Fágok gyakorlati alkalmazása. Bakteriofágok: az alkalmazás modern vonatkozásai, jövőbeli kilátások

A bakteriofágok, mint a Vira királyság képviselői, megkülönböztető tulajdonságai. Virulens fágok, a baktériumsejttel való interakció szakaszai. Gyakorlati használat bakteriofágok

A virulens fágok okozzák produktív fertőzés, ahol a fágok szaporodása és a baktériumsejt lízise megy végbe.

A virulens fág és a mikrobiális sejt kölcsönhatásának mechanizmusa:

1. Fágadszorpció érzékeny sejteken. Komplementer receptorok jelenlétében fordul elő a baktériumok sejtfalában és a fágfolyamat filamentumainak végein. Először a fágot szálakkal rögzítik, majd a banális lemez fogai segítségével szilárdan rögzítik a sejtfalhoz.

2. A fág DNS bejutása a bakteriális sejtbe. A banális lemezben található lizozim segítségével a sejtfal egy része hidrolizálódik, a folyamat hüvelye lecsökken, és a belső rudat átszúrja a sejtmembrán. A fág DNS-molekula a rúd csatornáján keresztül jut be a sejtbe.

3. Intracelluláris fág fejlődés. A fázis DNS genetikai információt visz be a baktériumsejtbe. A szaporodáshoz szükséges komponensek bioszintézise zajlik. A korai szakaszaiban"korai fehérjéket" szintetizálnak - olyan enzimeket, amelyek replikálják a fág DNS-t, hogy sok másolatot hozzanak létre. Aztán tovább sejtes riboszómák szerkezeti „késői fehérjék” képződnek

4. Fág morfogenezis. A fágérés három független ág mentén megy végbe a sejt különböző részein, ami disszociált folyamat. Külön-külön fágfejek képződnek - egy kapszid épül a DNS-molekula köré. A folyamat ettől függetlenül épül. A folyamatszálakat külön-külön szintetizálják. Ezután a fág összes alkotórésze virionokká egyesül.

5. A baktériumsejt lízise és a fág felszabadulása. A lízist lizozim hatására végezzük. Kilépés bimbózóval.

A bakteriofágok szigorú specifitása lehetővé teszi, hogy fágtipizálásra és bakteriális tenyészetek differenciálására, valamint külső környezetben, például víztestekben történő indikációjukra használják fel őket.

A baktériumok fágtipizálásának módszerét széles körben alkalmazzák a mikrobiológiai gyakorlatban. Nemcsak a vizsgált kultúra faji hovatartozását, hanem fagotípusát (fagovár) is lehetővé teszi. Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az azonos fajhoz tartozó baktériumok olyan receptorokkal rendelkeznek, amelyek adszorbeálják a szigorúan meghatározott fágokat, amelyek aztán lízisüket okozzák. Az ilyen típusspecifikus fágkészletek használata lehetővé teszi a vizsgált tenyészetek fágtipizálását a fertőző betegségek epidemiológiai elemzése céljából: (a fertőzés forrásának és átviteli módjainak meghatározása)

II. A fágokat fertőző betegségek megelőzésére és kezelésére használják:

a) fág profilaxis- olyan módszer, amely megakadályozza bizonyos bakteriális fertőzések specifikus bakteriofág lenyelésével. Kolera, vérhas, tífusz, stb. megelőzésére használják.

b) A fágterápia a bakteriális fertőzések kezelésének módszere egy adott fág lenyelésével.(tífusz, szalmonella, vérhas, proteus, pseudomonas, staphylococcus, streptococcus, coli-fág és kombinált gyógyszerek. A fenti mikroorganizmusok okozta fertőző betegségek kezelésében, valamint seb- és anaerob fertőzések kezelésében alkalmazzák.)

Genotípusos variabilitás

Patogenitás -

Tapadás

Invázió

Agresszió.

4. A prokarióták genetikai apparátusának felépítése. Fenotípusos és genotípusos variabilitás. A bakteriális patogenitás genetikai alapjai.

A prokarióták genetikai apparátusa- nem rendelkezik magburokkal, és egy körkörös DNS-molekula képviseli, amely egy kromoszóma; a citoplazmában található, nem tartalmaz hisztonfehérjéket. Nem képes mitózisra

Fenotípusos variabilitás - módosítások (egynél több tulajdonság változása) - nem befolyásolja a genotípust. A fenotípusos változások környezeti tényezők hatására következnek be.A módosulások a populáció egyedeinek többségét érintik. Nem öröklődnek, és idővel elhalványulnak, azaz visszatérnek az eredeti fenotípushoz.

Genotípusos variabilitás- a baktériumok tulajdonságainak megváltoztatása, genotípusuk befolyásolása. Ez öröklődik, hosszú távú. Mutációk vagy genetikai csere (transzformáció, konjugáció vagy transzdukció) eredményeként fordul elő

Patogenitás - olyan fajtulajdonság, amely öröklődik, rögzül a mikroorganizmus genomjában, azaz olyan genotípusos tulajdonság, amely tükrözi a mikroorganizmus potenciális képességét, hogy behatoljon a makroorganizmusba és abban szaporodjon (invazivitás), komplexet okozzon. kóros folyamatok amelyek a betegség során jelentkeznek.

A patogenitási tényezők közé tartozik a mikroorganizmusok azon képessége, hogy kötődjenek a sejtekhez (adhézió), megtelepedjenek azok felületén (kolonizáció), behatoljanak a sejtekbe (invázió), és ellenálljanak a szervezet védekező tényezőinek (agresszió).

Néhányukat közvetlenül a nukleoid gének kódolják (például egyes fajoknál a kapszula és az enzimek). A másik részt az extrakromoszómális öröklődési faktorok - plazmidok és episzómák - kódolják. A plazmidgének általában meghatározzák a kórokozók kölcsönhatását a hámszövettel, míg a kromoszómális gének a baktériumok sejten kívüli létezését és szaporodását határozzák meg a szervekben és szövetekben.

Tapadás A mikroorganizmusnak a sejthez való kötődéséért felelős struktúrákat adhezineknek nevezzük, és annak felszínén helyezkednek el, Gram-negatív baktériumokban a tapadás a pili I ill. általános típusok. A Gram-pozitív baktériumokban az adhezinek a sejtfal fehérjéi és teichoinsavai. Más mikroorganizmusokban ezt a funkciót a sejtrendszer különféle struktúrái látják el: felszíni fehérjék, lipopoliszacharidok stb.

Invázió a hialuronidáz enzim lebontja az intercelluláris anyag részét képező hialuronsavat, és ezáltal növeli a nyálkahártya és a kötőszövet permeabilitását. A neuraminidáz lebontja a neuraminsavat, amely a nyálkahártya sejtek felszíni receptorainak része, ami hozzájárul a kórokozó szövetekbe való behatolásához.

Agresszió Az agressziós faktorok a következők: proteázok - enzimek, amelyek elpusztítják az immunglobulinokat; koaguláz - a vérplazmát koaguláló enzim; fibrinolizin – feloldó fibrinrög; lecitináz - egy enzim, amely az izomrostok, eritrociták és más sejtek membránjainak foszfolipidjeire hat .

Fágok gyakorlati alkalmazása. A bakteriofágokat a fertőzések laboratóriumi diagnosztikájában alkalmazzák a baktériumok intraspecifikus azonosítása során, azaz a fagovár (fág típus) meghatározása során. Ehhez a fágtipizálási módszert alkalmazzák, amely a fágok hatásának szigorú specifikusságán alapul: különböző diagnosztikai típus-specifikus fágok cseppjeit csészébe csepegtetik sűrű tápközeggel, amelyet tiszta kultúra "gyepével" oltottak be. a kórokozótól. A baktérium fág fágját a lízist okozó fág típusa határozza meg (steril folt, "plakk" vagy "negatív telep", fág kialakulása). A fágtipizálási technikát a fertőzés forrásának és terjedési módjainak azonosítására használják (epidemiológiai jelölés). Az azonos fagovarba tartozó baktériumok különböző betegekből történő izolálása fertőzésük közös forrását jelzi.

A fágokat számos bakteriális fertőzés kezelésére és megelőzésére is használják. Tífusz, szalmonella, vérhas, pseudomonas, staphylococcus, streptococcus fágokat, ill. kombinált készítmények(koliprotein, piobakteriofágok stb.). A bakteriofágokat a javallatok szerint orálisan, parenterálisan vagy helyileg írják fel folyadék, tabletta, kúp vagy aeroszol formájában.

A bakteriofágokat széles körben használják génmanipulációés a biotechnológia mint vektorok rekombináns DNS előállítására.

A gyakorlatban használt bakteriofág készítmények a megfelelő mikrobák fág által lizált húsleves tenyészetének szűrletei, amelyek élő fágrészecskéket, valamint azok lízise során a baktériumsejtekből felszabaduló, oldott bakteriális antigéneket tartalmaznak. A kapott készítménynek - egy folyékony bakteriofágnak - úgy kell kinéznie, mint egy teljesen átlátszó, nagyobb vagy kisebb intenzitású sárga folyadék.

Terápiás és profilaktikus célokra a fágok saválló bevonattal ellátott tabletták formájában állíthatók elő. A tablettázott száraz fág stabilabb a tárolás során és kényelmesebb a használata. Egy tabletta száraz bakteriofág 20-25 ml-nek felel meg folyékony készítmény. A száraz és folyékony készítmény eltarthatósága 1 év. A folyékony bakteriofágot + 2 +10 C hőmérsékleten, szárazon - +1 ° C-nál nem magasabb hőmérsékleten kell tárolni, de hűtőszekrényben negatív hőmérsékleten is tárolható.

A szájon át bevett bakteriofág 5-7 napig marad a szervezetben. A bakteriofág bevételét általában nem kíséri semmilyen reakció vagy szövődmény. A felvételnek nincs ellenjavallata. Használják öblítések, öblítések, testápolók, tamponok, injekciók formájában, valamint befecskendezik az üregekbe - hasi, pleurális, ízületi és hólyag, a kórokozó helyétől függően.

A diagnosztikai fágokat folyékony és száraz formában is előállítják ampullákban.A munka megkezdése előtt a száraz bakteriofágot felhígítják. Ha a titer, tr, DRT (working titer dose) fel van tüntetve az ampullákon, akkor a fág lizability tesztben (Otto módszer) a baktériumok azonosítására, ha a fág típus feltüntetésre kerül, akkor a fág tipizálásnál - a forrás meghatározására. fertőzéstől.

A bakteriofág hatása mikrobiális tenyészetre folyékony közegben és sűrű táptalajban

Ottó módszere (hulló csepp)

Készítsen sűrű vetési pázsitot a vizsgált növényből. A vetés után 5-10 perccel folyékony diagnosztikai fágot juttatunk a táptalaj szárított felületére. Az edényt kissé megdöntjük, hogy a fágcsepp szétterüljön az agar felületén. A csészét termosztátba helyezzük 18-24 órára. Az eredményt elszámolják teljes hiánya tenyészet növekedése a fágcseppek alkalmazásának helyén.

Kísérletezzen folyékony tápközegen

A vizsgált tenyészetet folyékony tápközeggel két kémcsőbe kell vetni. A diagnosztikai bakteriofágot hurok formájában egy kémcsőbe ("O") adják. 18-20 óra elteltével egy olyan kémcsőben, ahol nem adták hozzá a bakteriofágot ("K"), a leves erős homályosodása figyelhető meg - a beoltott kultúra nőtt. A kémcsőben lévő leves, ahová a bakteriofágot adtuk, átlátszó maradt a hatása alatt lévő tenyészet lízise miatt.

A baktériumok fágtipizálása

A hatásspektrum szerint a következő bakteriofágokat különböztetjük meg: polivalens, lizáló rokon típusú baktériumok; bizonyos típusú egyértékű, lizáló baktériumok; tipikus, lizáló egyes baktériumtípusok (variánsok).

Például egy patogén staphylococcus törzset többféle fág lizálhat, ezért az összes tipikus fág (24) és a patogén staphylococcus törzse 4 csoportba sorolható.

A fágtipizálási módszer rendelkezik nagyon fontos epidemiológiai kutatásra, mivel lehetővé teszi a kórokozók forrásának és terjedési módjainak azonosítását. Ebből a célból a kóros anyagból izolált tiszta tenyészet fagovárát sűrű tápközegen határozzuk meg tipikus diagnosztikai fágok segítségével.

A mikroorganizmus tenyészet fagovarját a lízist okozó fág típusa határozza meg, az azonos fagovarba tartozó baktériumok különböző alanyokból történő izolálása jelzi a fertőzés forrását.

A fágkészítményeket fertőző betegségek kezelésére, megelőzésére, valamint diagnosztikában - a mikroorganizmusok azonosításában a fágérzékenység és fágtipizálás meghatározására használják. A fágok működése szigorú specifikusságukon alapul. A fágok terápiás és profilaktikus hatását magának a fágnak a lítikus aktivitása, valamint a fagolizátumokban lévő elpusztult mikrobasejtek komponenseinek (antigének) immunizáló tulajdonsága határozza meg, különösen ismételt felhasználás esetén. A fágkészítmények előállítása során a fágok bevált termelő törzseit és ennek megfelelően tipikus mikroorganizmus-tenyészeteket használnak. A szaporodás logaritmikus fázisában lévő, folyékony tápközegben lévő baktériumtenyészetet fág anyaszuszpenzióval fertőzik meg.

A fággal lizált tenyészetet (általában másnap) baktériumszűrőn átszűrjük, és a fágot tartalmazó szűrlethez tartósítószerként kinozololdatot adunk.
A kész fág készítmény az tiszta folyadék sárgás színű. A hosszabb tárolás érdekében néhány fág száraz formában (tablettában) kapható. A bélfertőzések kezelésében és megelőzésében a fágokat nátrium-hidrogén-karbonát oldattal egyidejűleg alkalmazzák, mivel a gyomor savas tartalma elpusztítja a fágot. A fág nem marad sokáig a szervezetben (5-7 napig), ezért ajánlott újra alkalmazni.

A Szovjetunióban betegségek kezelésére és megelőzésére a következő gyógyszereket gyártották: tífusz, salmo-pella, vérhas, coliphage, staphylococcus fág és streptococcus. Jelenleg a fágokat antibiotikumokkal kombinálva kezelésre és megelőzésre használják. Ez az alkalmazás hatékonyabban hat a baktériumok antibiotikum-rezisztens formáira.

A diagnosztikai bakteriofágokat széles körben használják a betegekből vagy fertőzött környezeti tárgyakból izolált baktériumok azonosítására. A bakteriofágok segítségével nagy specificitásuk miatt lehetőség nyílik a baktériumok típusainak, illetve nagyobb pontossággal az izolált baktériumok egyedi típusainak meghatározására. A Salmonella, Vibrio és Staphylococcusok nemzetségébe tartozó baktériumok fágdiagnosztikáját és fágtipizálását fejlesztették ki. A fágtipizálás segít feltárni a fertőzés forrását, tanulmányozni az epidemiológiai összefüggéseket, megkülönböztetni a sporadikus és járványos betegségeket.
A fágdiagnosztika és a fágtipizálás az izolált mikroorganizmusok és a megfelelő fajok vagy típusú fágok együttes tenyésztésének elvén alapul. pozitív eredmény figyelembe vesszük a vizsgált tenyészet jól kifejezett lízisét a fajfággal, majd az egyik tipikus fággal.

CM. ZAKHARENKO, az orvostudományok kandidátusa, egyetemi docens, Katonai-orvosi Akadémiaőket. CM. Kirov, Szentpétervár

A bakteriofágok egyedülálló mikroorganizmusok, amelyek alapján a terápiás és profilaktikus készítmények speciális csoportját hozták létre tulajdonságaikat és jellemzőit tekintve. A fágok és baktériumok közötti kölcsönhatás természetes fiziológiai mechanizmusai, amelyek a működésük hátterében állnak, lehetővé teszik mind a bakteriofágok, mind a bakteriofágok végtelen sokféleségének előrejelzését. lehetséges módjai alkalmazásaik. A bakteriofág kollekciók bővülésével kétségtelenül új célkórokozók jelennek meg, és bővül azoknak a betegségeknek a köre, amelyekben a fágok monoterápiaként és komplex kezelési rendek részeként egyaránt alkalmazhatók.

Igen, használd polivalens piobakteriofág A fertőzött hasnyálmirigy-nekrózis kezelésében alkalmazott szextafág (E. A. Wagner akadémikusról elnevezett Perm Állami Orvosi Akadémia) lehetővé tette a homeosztázis fő paramétereinek, valamint a betegek szerveinek és rendszereinek funkcióinak gyors helyreállítását. Szignifikánsan csökkent a posztoperatív szövődmények és halálozások száma is: a standard terápiában részesült betegek csoportjában a mortalitás 100%, míg a BP-t kapó csoportban 16,6% volt.

A BF-készítmények ártalmatlansága és reaktogenitása miatt a gyermekgyógyászati ​​gyakorlatban, így újszülötteknél is alkalmazhatók. Érdekesek a Nyizsnyij Novgorodi Regionális Gyermekklinikai Kórház tapasztalatai, ahol a járványügyi helyzet szövődményeinek időszakában a szokásos járványellenes intézkedések mellett a BP - Intesti-bakteriofágot és a BP Pseucfomonas aeruginosa-t alkalmazták. A Pseudomonas aeruginosa nosocomiális fertőzések előfordulási gyakoriságának 11-szeres csökkenése a BP használatának magas hatékonyságát mutatta. A BF-készítmények diszbakteriózis és rendellenességek kezelésére egyaránt felírhatók emésztőrendszer valamint a nyálkahártya kolonizációjának megakadályozására gyomor-bél traktus opportunista baktériumok. A BF többkomponensű készítményei ideálisak a gyomor-bélrendszeri zavarok első jeleinek azonnali enyhítésére.

A cég a mai napig számos tervet tervezett kiemelt területek terápiás és profilaktikus bakteriofágok fejlesztése és gyártása, amelyek korrelálnak az újonnan megjelenő globális trendekkel. Új készítményeket készítenek és vezetnek be: kifejlesztették a fogazat és enterobaktériumok elleni BF-et, folyamatban van a Helicobacter pylori elleni fágkészítmény létrehozása.

Csak egy gyártó ezeknek a gyógyszereknek - az NPO Microgen, Alla Lobastova tudományos és innovációs fejlesztési osztály helyettes vezetője szerint - évente több mint 2 millió csomagot gyárt. Sajnos sok orvos elképzelése a bakteriofágokról messze nem objektív. Kevesen tudják, hogy egyazon kórokozó ellen aktív bakteriofágok különböző családokba tartozhatnak, eltérő életciklusúak stb. A P. aeruginosa bakteriofágok például a Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae családokba tartoznak. életciklus vagy mérsékelten. Ugyanazon kórokozó különböző törzsei eltérően érzékenyek a bakteriofágokra. A legtöbb szakértő tud (hallott, valaki használt) a bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményeinek folyékony és tabletta adagolási formáiról. A hatókörük azonban jóval szélesebb, ami feltétlen előnyöknek tudható be, különösen sokféle beadási móddal kombinálva (szájon át történő beadás, beöntés, alkalmazás, sebek és nyálkahártyák öblítése, sebüregekbe való bejuttatás stb.). A bakteriofágok nyilvánvaló előnyei hagyományosan magukban foglalják a meglehetősen korlátozott baktériumpopulációra kifejtett specifikus hatást, a korlátozott ideig tartó létezést (amíg a mikroorganizmusok célpopulációja el nem tűnik), az ilyen baktériumok hiányát. mellékhatások mint mérgező és allergiás reakciók, dysbiotikus reakciók stb. Ezek a gyógyszerek különféle esetekben alkalmazhatók korcsoportokés terhesség alatt. Maguk a bakteriofágok nem jelentős allergének. A bakteriofág készítményekkel szembeni intolerancia esetei többnyire a tápközeg összetevőire adott reakcióhoz kapcsolódnak. Ennek a gyógyszercsoportnak minden nagyobb gyártója a felhasznált komponensek maximális minőségére törekszik, ami csökkenti az ilyen reakciók valószínűségét. A növekvő antibiotikum-rezisztencia összefüggésében egyes szerzők azt javasolják, hogy a bakteriofágokat tekintsék a legjobb alternatíva antibiotikumok. A bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményei speciálisan kiválasztott kombinációk (poliklonális, erősen virulens bakteriális vírusok komplexe, amelyeket kifejezetten a bakteriális fertőzések leggyakoribb kórokozócsoportjai ellen szelektálnak) koktélja a gyártó fágkollekciói alapján. A Szövetségi Állami Egységes Vállalat NPO Microgen fióktelepei Ufában, Permben és Nyizsnyij Novgorodban modern központok az ilyen gyógyszerek előállítására. Személyre szabott létrehozás képessége patogén mikroorganizmusok A bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményei a másik nagy előnye ennek a készítménycsoportnak. Az antimikrobiális gyógyszerekkel szembeni bakteriális rezisztencia növekedése és a modern fertőző betegségek gyakran előforduló polietiológiája kombinált antibiotikum terápiát igényel (két, három és néha több) antimikrobiális szerek). Kiválasztáshoz hatékony rendszer antibiotikum-terápia esetén a baktériumoknak a gyógyszerrel szembeni tényleges érzékenységén túl figyelembe kell venni nagy szám tényezőket. A fágterápiának ebben a tekintetben is vannak bizonyos előnyei. Egyrészt a bakteriofágok kombinációjának alkalmazása nem jár együtt egymással való kölcsönhatásukkal, és nem vezet változáshoz az alkalmazási sémákban. A terápiás bakteriofágok meglévő készletén belül számos jól bevált kombináció létezik - coliproteus bakteriofág, polivalens piobakteriofág, intesti-bakteriofág. Másrészt a baktériumok nem közös mechanizmusok antibiotikumokkal és fágokkal szembeni rezisztencia, ezért mind akkor használhatók, ha a kórokozó rezisztens az egyik gyógyszerrel szemben, mind az "antibiotikum + bakteriofág" kombinációjában. Ez a kombináció különösen hatékony a mikrobiális biofilmek elpusztítására. A kísérlet meggyőzően mutatja azt kombinált alkalmazás vas-antagonisták és bakteriofágok megzavarhatják a Klebsiella pneumoniae biofilmek képződését. Ugyanakkor mind a mikrobiális populációk számának jelentős csökkenése, mind a "fiatal" sejtek számának csökkenése figyelhető meg. Még egy fontos jellemzője A bakteriofágok hatása olyan jelenség, mint az apoptózis indukciója. Egyes E. coli törzsek olyan génekkel rendelkeznek, amelyek a T4 bakteriofág bejuttatása után sejthalált okoznak. Így a T4 fág késői génjeinek expressziójára válaszul a lit gén (olyan proteázt kódol, amely elpusztítja a fehérjeszintézishez szükséges EF-Tu elongációs faktort) blokkolja az összes sejtfehérje szintézisét. A prrC gén egy nukleázt kódol, amely a lizin tRNS-t hasítja. A nukleázt a T4 fág stp gén terméke aktiválja. A T4 fággal fertőzött sejtekben a rex gének (amelyek a fág genomjához tartoznak és lizogén sejtekben expresszálódnak) ioncsatornák képződését okozzák, ami a sejtek létfontosságú ionjainak elvesztéséhez, majd halálához vezet. Maga a T4 fág képes megakadályozni a sejtpusztulást azáltal, hogy fehérjéivel, az rII gének termékeivel lezárja a csatornákat. Az antibiotikumokkal szembeni bakteriális rezisztencia kialakulása esetén új lehetőségeket kell keresni az aktív molekula vagy alapvetően új anyagok módosítására. Sajnos azért utóbbi évek az új antibiotikumok bevezetésének üteme jelentősen lelassult. A bakteriofágok helyzete alapvetően más. A nagy gyártók kollekciói több tucat kész bakteriofág törzset tartalmaznak, és folyamatosan új aktív fágokkal bővülnek. Az izolált kórokozók bakteriofágokkal szembeni érzékenységének folyamatos ellenőrzésének köszönhetően a gyártók módosítják a régiókba szállított fágösszetételeket. Az adaptált bakteriofágoknak köszönhetően kiküszöbölhető az antibiotikum-rezisztens törzsek által okozott nozokomiális fertőzések kitörése.

Nál nél szájon át történő bevitel A bakteriofágok gyorsan elérik a fertőzés lokalizációjának gócát: gennyes-gyulladásos betegek szájon át történő bevétele esetén a fágok egy óra múlva a véráramba kerülnek, 1-1,5 óra múlva a bronchopulmonalis váladékból és az égési sebek felszínéről, 2 óra múlva kimutathatók. óra - vizeletből, valamint traumás agysérülésben szenvedő betegek cerebrospinális folyadékából.

A bakteriofágok tehát egyedülálló mikroorganizmusok, amelyek alapján a terápiás és profilaktikus készítmények speciális csoportját hozták létre tulajdonságaik és jellemzőik tekintetében. A fágok és baktériumok közötti kölcsönhatás természetes fiziológiai mechanizmusai, amelyek működésük hátterében állnak, lehetővé teszik mindkét bakteriofág végtelen sokféleségének előrejelzését, valamint felhasználásuk lehetséges módjait. A bakteriofág kollekciók bővülésével kétségtelenül új célkórokozók jelennek meg, és bővül azoknak a betegségeknek a köre, amelyekben a fágok monoterápiaként és komplex kezelési rendek részeként egyaránt alkalmazhatók. Modern felfogás további sorsa a fágterápiának mind a hatásuk nagy specifitásán, mind a fágterápia összes szabályának szigorú betartásán kell alapulnia. A bakteriofágok szembeállítása az etiotróp terápia bármely eszközével téves.

A múlt század közepén a biológia tudomány forradalmi lépést tett az élő rendszerek működésének molekuláris alapjainak megteremtésével. A múlt század elején felfedezett bakteriofágok óriási szerepet játszottak abban a sikeres kutatásban, amely az öröklődő molekulák kémiai természetének meghatározásához, a genetikai kód dekódolásához és génmanipulációs technológiák megalkotásához vezetett. A mai napig ezek a bakteriális vírusok sok ember számára hasznos „szakmát” elsajátítottak: nemcsak biztonságos antibakteriális gyógyszerként, hanem fertőtlenítőként is használják, sőt elektronikus nanoeszközök létrehozásának alapjául is szolgálnak.

Amikor az 1930-as években tudósok egy csoportja foglalkozott az élő rendszerek működésének problémáival, majd a legegyszerűbb modelleket keresve felfigyeltek a bakteriofágok- bakteriális vírusok. Hiszen a biológiai objektumok között nincs egyszerűbb a bakteriofágoknál, ráadásul könnyen és gyorsan termeszthetők, elemezhetők, a vírusgenetikai programok pedig kicsik.

A fág egy minimális méretű természetes szerkezet, amely egy sűrűn csomagolt genetikai programot (DNS vagy RNS) tartalmaz, amelyben nincs semmi felesleges. Ez a program egy fehérjehéjba van zárva, amely minimális eszközökkel van felszerelve a baktériumsejtbe való bejutáshoz. A bakteriofágok nem képesek önmagukban szaporodni, és ebben az értelemben nem tekinthetők teljes értékű élő tárgyaknak. Génjeik csak a baktériumokban kezdenek működni, felhasználva a baktériumsejtben elérhető bioszintetikus rendszereket és a szintézishez szükséges molekulatartalékokat. Ezeknek a vírusoknak a genetikai programjai azonban alapvetően nem különböznek a bonyolultabb szervezetek programjaitól, így a bakteriofágokkal végzett kísérletek lehetővé tették a alapelvek a genom szerkezete és működése.

A későbbiekben ezek az ismeretek és a kutatás során kidolgozott módszerek a biológiai és orvostudomány fejlődésének, valamint a biotechnológiai alkalmazások széles skálájának alapjául szolgáltak.

Harcosok a kórokozók ellen

Az első kísérletek a bakteriofágok fertőző betegségek kezelésére történő alkalmazására szinte azonnal a felfedezés után történtek, de az ismeretek hiánya és az akkori tökéletlen biotechnológiák nem tette lehetővé a teljes sikert. Ennek ellenére a további klinikai gyakorlat megmutatta a bakteriofágok sikeres alkalmazásának alapvető lehetőségét fertőző betegségek gyomor-bél traktus, húgyúti rendszer, betegek heveny gennyes-szeptikus állapotában, műtéti fertőzések kezelésére stb.

Az antibiotikumokhoz képest a bakteriofágok számos előnnyel rendelkeznek: nem okoznak mellékhatásokat, ráadásul szigorúan bizonyos típusú baktériumokra specifikusak, így használatuk során a normál emberi mikrobióma nem sérül. Az ilyen nagy szelektivitás azonban problémákat is okoz: a beteg sikeres kezeléséhez pontosan ismerni kell a fertőző ágenst, és egyedileg kell kiválasztani a bakteriofágot.

A fágok profilaktikusan is használhatók. Például a Moszkvai Epidemiológiai és Mikrobiológiai Kutatóintézet. G. N. Gabrichevsky kifejlesztette a "FOODFAG" profilaktikus terméket bakteriofágok koktélján, amely csökkenti az akut fertőzés kockázatát. bélfertőzések. Klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a gyógyszer heti bevitele lehetővé teszi, hogy megszabaduljon a hemolizáló Escherichia coli és más patogén és opportunista baktériumok bélrendszeri diszbiózist okozva.

A bakteriofágok nemcsak az emberek, hanem a házi- és haszonállatok fertőző betegségeit is kezelik: tehenek tőgygyulladását, borjak és sertések colibacillózisát és escherichiosisát, csirkék szalmonellózisát... Különösen kényelmes a fágkészítmények alkalmazása akvakultúra esetén - pl. iparilag termesztett halak és garnélarák kezelése, mert hosszú ideig vízben maradnak. A bakteriofágok a növények védelmét is segítik, bár a fágtechnológiák alkalmazása ebben az esetben a hatás miatt nehézkes. természetes tényezők, mint például a napfény és az eső, károsak a vírusokra.

A fágok nagy szerepet játszhatnak az élelmiszerek mikrobiológiai biztonságának megőrzésében, hiszen az élelmiszeriparban az antibiotikumok és vegyszerek alkalmazása nem oldja meg ezt a problémát, ugyanakkor csökkenti a termékek környezetbarát jellegét. Maga a probléma súlyosságát statisztikák is bizonyítják: például az Egyesült Államokban és Oroszországban évente akár 40 ezer szalmonellózisos esetet regisztrálnak, ebből 1%-a meghal. Ennek a fertőzésnek a terjedése nagyrészt a különféle baromfifajták tenyésztésével, feldolgozásával és fogyasztásával függ össze, és a bakteriofágok felhasználására tett kísérletek a leküzdésére ígéretes eredményeket mutattak.

Igen, egy amerikai cég Intralytix fágkészítményeket gyárt a listeriosis, a szalmonellózis és az Escherichia coli által okozott bakteriális fertőzés leküzdésére. Adalékanyagként használhatók, hogy megakadályozzák a baktériumok élelmiszereken való elszaporodását – hús- és baromfitermékekre, valamint zöldségekre és gyümölcsökre permetezik. Kísérletek kimutatták, hogy a bakteriofágok koktélja sikeresen használható élő tavi halak szállítása és értékesítése során, hogy csökkentse nemcsak a víz, hanem magának a halnak a bakteriális szennyeződését is.

A bakteriofágok nyilvánvaló alkalmazása az fertőtlenítés, vagyis a baktériumok elpusztítása olyan helyeken, ahol nem kellene: kórházakban, on ételgyártás stb. Erre a célra egy brit cég Fix Phage módszert dolgozott ki fágpreparátumok felületeken történő rögzítésére, amely biztosítja a tartósítást biológiai aktivitás fágok legfeljebb három évig.

Bakteriofágok - a molekuláris biológia "Drosophila".

1946-ban, a híres amerikai laboratóriumban, Cold Spring Harborban tartott 11. szimpóziumon kihirdették az „egy gén – egy enzim” elméletét. A. Hershey bakteriológus és M. Delbrück "egykori" fizikus, molekuláris biológus genetikai tulajdonságok cseréjéről számoltak be a különböző fágok között, miközben egyidejűleg megfertőzték az Escherichia coli sejteket. Ez a felfedezés, amely akkor történt, amikor még nem ismerték a gén fizikai hordozóját, arról tanúskodott, hogy a "rekombináció" jelensége - a genetikai tulajdonságok keveredése - nemcsak a magasabb rendű élőlényekre, hanem a vírusokra is jellemző. A jelenség felfedezése ezt követően lehetővé tette a replikáció molekuláris mechanizmusainak részletes tanulmányozását. Később a bakteriofágokkal végzett kísérletek lehetővé tették a genetikai programok felépítésének és működésének elveinek megállapítását.

1952-ben A. Hershey és M. Chase kísérleti úton bebizonyították, hogy a T2 bakteriofág örökletes információit nem a fehérjék kódolják, amint azt sok tudós hitte, hanem a DNS-molekulák (Hershey & Chase, 1952). A kutatók a szaporodási folyamatot a bakteriofágok két csoportjában követték nyomon, az egyik radioaktívan jelölt fehérjéket, a másik pedig DNS-molekulákat hordozott. A baktériumok ilyen fágokkal való megfertőzése után kiderült, hogy a fertőzött sejtbe csak a vírus DNS kerül be, ami bizonyítékul szolgált az örökletes információk tárolásában és továbbításában betöltött szerepére.

Ugyanebben az évben D. Lederberg és N. Zindler amerikai genetikusok a Salmonella két törzsével és a P22 bakteriofággal végzett kísérletben azt találták, hogy a bakteriofág képes beépíteni a gazdabaktérium DNS-fragmenseit a szaporodás során, és átadni azokat más baktériumoknak. fertőzés esetén (Zinder és Lederberg, 1952). A donor baktériumból a befogadó baktériumba történő géntranszfernek ezt a jelenségét „transzdukciónak” nevezték. A kísérlet eredményei újabb megerősítést jelentettek a DNS szerepére az öröklődő információk továbbításában.

1969-ben A. Hershey, M. Delbrück és kollégájuk, S. Luria Nobel-díjasok lettek "a vírusok replikációs mechanizmusával és genetikai szerkezetével kapcsolatos felfedezéseikért".

1972-ben az E. coli DNS replikációjának (sejtinformációinak másolásának) tanulmányozása során R. Bird és munkatársai bakteriofágokat használtak próbaként, amelyek képesek integrálódni a baktériumsejt genomjába, és megállapították, hogy a replikációs folyamat két irányban megy végbe a kromoszóma mentén. (Stent, 1974).

A teremtés hét napja

A szintetikus biológia modern módszerei nemcsak a fággenomok különféle módosításait teszik lehetővé, hanem teljesen mesterséges aktív fágok létrehozását is. Technológiailag ez nem nehéz, csak meg kell szintetizálni a fág genomot, és be kell juttatni egy baktériumsejtbe, és ott beindítja a fehérjék szintéziséhez és az új fágrészecskék összeállításához szükséges összes folyamatot. A modern laboratóriumokban ez a munka csak néhány napot vesz igénybe.

A genetikai módosításokat a fágok specifitásának megváltoztatására és hatékonyságuk növelésére használják. terápiás hatás. Ennek érdekében a legagresszívebb fágokat felismerő struktúrákkal látják el, amelyek a célbaktériumokhoz kötik őket. Ezenkívül a baktériumok számára mérgező fehérjéket kódoló géneket, amelyek megzavarják az anyagcserét, beépítik a vírusgenomokba - az ilyen fágok halálosabbak a baktériumok számára.

A baktériumoknak számos védekezési mechanizmusuk van az antibiotikumokkal és bakteriofágokkal szemben, ezek egyike a vírusgenomok elpusztítása. restrikciós enzimek specifikus nukleotidszekvenciákra ható. A fágok terápiás aktivitásának növelése érdekében a genetikai kód degeneráltsága miatt a génjeik szekvenciái „újraformázhatók” oly módon, hogy az enzimekre „érzékeny” nukleotidszekvenciák száma minimalizálható, ugyanakkor megőrizhető. kódolási tulajdonságaikat.

A baktériumok minden külső hatástól való védelmének univerzális módja - az ún biofilmek, DNS-filmek, poliszacharidok és fehérjék, amelyeket a baktériumok együtt hoznak létre, és amelyekbe sem az antibiotikumok, sem a terápiás fehérjék nem hatolnak be. Ilyen biofilmek fejfájás az orvosok, mivel hozzájárulnak a fogzománc pusztításához, az implantátumok felületén, katétereken, műízületeken, valamint légutak, a bőr felszínén stb. A biofilmek leküzdésére speciális bakteriofágokat építettek, amelyek egy speciális, bakteriális polimereket elpusztító lítikus enzimet kódoló gént tartalmaznak.

Enzimek "bakteriofágból"

A bakteriofágokon végzett kutatások eredményeként számos olyan enzimet fedeztek fel, amelyeket ma széles körben használnak a molekuláris biológiában és a géntechnológiában.

Ilyen például a restrikciós enzimek, a DNS-t hasító bakteriális nukleázok csoportja. Még az 1950-es évek elején. Azt találták, hogy az egyik baktériumtörzs sejtjéből izolált bakteriofágok gyakran rosszul szaporodnak egy közeli rokon törzsben. Ennek a jelenségnek a felfedezése azt jelentette, hogy a baktériumok rendelkeznek egy rendszerrel, amely elnyomja a vírusok szaporodását (Luria & Human, 1952). Ennek eredményeként egy enzimatikus restrikciós-módosító rendszert fedeztek fel, amelynek segítségével a baktériumok elpusztították a sejtbe került idegen DNS-t. A restrikciós enzimek (restrikciós endonukleázok) izolálása felbecsülhetetlen értékű eszközt adott a molekuláris biológusoknak a DNS manipulálására: egyik szekvenciát a másikba illeszteni, vagy a szükséges láncrészleteket kivágni, ami végül a rekombináns DNS technológia kifejlesztéséhez vezetett.

Egy másik, a molekuláris biológiában széles körben használt enzim a bakteriofág T4 DNS-ligáz, amely a kettős szálú DNS- és RNS-molekulák „ragadós” és „tompa” végeit „keresztezi”. A közelmúltban pedig ennek az enzimnek nagyobb aktivitású, genetikailag módosított változatai jelentek meg.

A laboratóriumi gyakorlatban használt, egyszálú RNS- és DNS-molekulákat "varr" RNS-ligázok többsége is bakteriofágokból származik. A természetben elsősorban a törött RNS-molekulák helyreállítására szolgálnak. A kutatók leggyakrabban a bakteriofág T4 RNS-ligázt használják, amely egyszálú polinukleotidokat „varrhat” RNS-molekulákra, hogy megjelölje azokat. Ezt a technikát az RNS szerkezetének elemzésére, RNS-fehérje kötőhelyek keresésére, oligonukleotid szintézisre stb. használják. A közelmúltban az rm378 és TS2126 bakteriofágokból izolált hőstabil RNS-ligázok a rutinszerűen használt enzimek között jelentek meg (Nordberg Karlsson és mtsai, 2010). Hjorleifsdottir, 2014).

A bakteriofágokból egy másik rendkívül fontos enzimcsoport, a polimerázok egy részét is előállították. Például a nagyon "precíz" bakteriofág T7 DNS polimeráz, amely a molekuláris biológia különböző területein talált alkalmazást, például a helyspecifikus mutagenezisben, de főleg a DNS elsődleges szerkezetének meghatározására használják.

Egy kémiailag módosított T7 fág DNS polimerázt javasoltak pl tökéletes eszköz DNS-szekvenáláshoz már 1987-ben (Tabor és Richardson, 1987). Ennek a polimeráznak a módosítása többszörösére növelte hatékonyságát: a DNS-polimerizáció sebessége ebben az esetben másodpercenként több mint 300 nukleotidot ér el, így nagy DNS-fragmensek amplifikálására is használható. Ez az enzim a szekvenáz prekurzora lett, egy genetikailag módosított enzim, amelyet a Sanger-reakció DNS-szekvenálására optimalizáltak. A Sequenase más magas hatásfok valamint a nukleotid-analógok DNS-szekvenciába való beépítésének képessége, amelyeket a szekvenálási eredmények javítására használnak.

A molekuláris biológiában használt főbb RNS-polimerázok (DNS-függő RNS-polimerázok) - a transzkripciós folyamatot katalizáló enzimek (RNS-másolatok leolvasása a DNS-templátról) - szintén bakteriofágokból származnak. Ezek közé tartoznak az SP6, T7 és T3 RNS polimerázok, amelyeket a megfelelő SP6, T7 és T3 bakteriofágokról neveztek el. Mindezeket az enzimeket antiszensz RNS-transzkriptumok, jelölt RNS-próbák stb. in vitro szintézisére használják.

Az első teljesen szekvenált DNS-genom a φ174 fág genom volt, több mint 5000 nukleotid hosszúságú (Sanger et al., 1977). Ezt a dekódolást F. Sanger angol biokémikus egy csoportja végezte, a híres, azonos nevű DNS-szekvenálási módszer megalkotója.

A polinukleotid-kinázok katalizálják a foszfátcsoport átvitelét egy ATP-molekuláról a nukleinsavmolekula 5'-végére, az 5'-foszfátcsoportok cseréjét vagy a mononukleotidok 3'-végeinek foszforilációját. A laboratóriumi gyakorlatban a bakteriofág T4 polinukleotid kinázt használják legszélesebb körben. Általában kísérletekben használják a DNS radioaktív foszforizotópjával való jelölésére. A polinukleotid-kinázt restrikciós helyek keresésére, DNS- és RNS-ujjlenyomat-vételre, DNS- vagy RNS-ligáz-szubsztrátok szintézisére is használják.

Molekuláris biológiai kísérletekben bakteriofág enzimeket, például T4 fág polinukleotid kinázt használnak, amelyet általában DNS radioaktív foszforizotóppal való jelölésére használnak, DNS és RNS ujjlenyomatot stb. A DNS-templátokat széles körben használják molekuláris biológiai kísérletekben is, a nukleotid-polimorfizmus szekvenálására és elemzésére.

A szintetikus biológia módszereivel lehetőség nyílt olyan bakteriofágok kifejlesztésére is, amelyek a legkifinomultabb fegyverekkel vannak felvértezve, amelyeket a baktériumok magukkal a fágokkal szemben alkalmaznak. Ez körülbelül a bakteriális CRISPR-Cas rendszerekről, amelyek a DNS-t hasító nukleáz enzim és az RNS szekvencia komplexe, amely ezen enzim hatását a vírusgenom egy specifikus fragmensére irányítja. A fág DNS egy darabja „mutatóként” szolgál, amelyet a baktérium „emlékezetre” tárol egy speciális génben. Ha egy hasonló fragmentumot találnak egy baktérium belsejében, ez a fehérje-nukleotid komplex elpusztítja azt.

Miután rájöttek a CRISPR-Cas rendszerek működési mechanizmusára, a kutatók magukat a fágokat próbálták felszerelni egy hasonló „fegyverrel”, amelyhez egy nukleázt kódoló és a bakteriális genom meghatározott régióival komplementer RNS-szekvenciákat megcímző gének komplexét alkalmazták. bekerült a genomjukba. A „célpont” a többszörös gyógyszerrezisztenciáért felelős gének lehetnek. A kísérleteket teljes siker koronázta – az ilyen fágok nagy hatékonysággal hatnak a baktériumokra, amelyekre „ráhangolták”.

Fág antibiotikumok

Terápiás célokra a fágokat nem kell közvetlenül használni. Több millió éves evolúció során a bakteriofágok specifikus fehérjék arzenálját fejlesztették ki - eszközöket a célmikroorganizmusok felismerésére és az áldozat biopolimerjeinek manipulálására, amelyek alapján antibakteriális gyógyszereket lehet létrehozni. A legígéretesebb ilyen típusú fehérjék az endolizin enzimek, amelyeket a fágok a baktériumból való kilépéskor a sejtfal elpusztítására használnak. Önmagukban ezek az anyagok erősek. antibakteriális szerek, nem mérgező az emberre. Hatásuk hatékonysága és iránya növelhető a bennük lévő címzési struktúrák – bizonyos baktériumokhoz specifikusan kötődő fehérjék – megváltoztatásával.

A legtöbb baktérium a sejtfal szerkezete szerint Gram-pozitívra, melynek membránját nagyon vastag peptidoglikánréteg borítja, és Gram-negatívra, amelyben a peptidoglikán réteg két membrán között helyezkedik el. A természetes endolizinek alkalmazása különösen hatékony a gram-pozitív baktériumok (staphylococcusok, streptococcusok stb.) esetében, mivel ezek peptidoglikán rétege kívül helyezkedik el. A Gram-negatív baktériumok (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli stb.) kevésbé hozzáférhető célpontok, mivel az enzimnek át kell hatolnia a külső bakteriális membránon, hogy elérje a belső peptidoglikán réteget.

Ennek a problémának a leküzdésére létrehozták az úgynevezett artilizineket - a természetes endolizinek módosított változatait, amelyek polikationos vagy amfipatikus peptideket tartalmaznak, amelyek destabilizálják a külső membránt és biztosítják az endolizin közvetlenül a peptidoglikán rétegbe való eljuttatását. Az artilizinek magas baktericid hatással rendelkeznek, és már kimutatták, hogy hatékonyak a kutyák középfülgyulladásának kezelésében (Briers et al., 2014).

Példa a módosított endolizinre, amely szelektíven hat bizonyos baktériumokra, a kanadai cég P128 gyógyszere. Ganga Gen Inc.. Ez az endolizin biológiailag aktív fragmense, amely lizosztafinhoz kapcsolódik, egy célzó fehérjemolekulához, amely a staphylococcus sejtek felszínéhez kötődik. A kapott kiméra fehérje nagy aktivitással rendelkezik a staphylococcusok különféle törzsei ellen, beleértve azokat is, amelyek multidrog rezisztenciával rendelkeznek.

A baktériumok "számlálói".

A bakteriofágok nemcsak sokoldalú terápiás és "fertőtlenítő" szerként szolgálnak, hanem kényelmes és pontos analitikai eszközként is szolgálnak egy mikrobiológus számára. Például nagy specifitásuk miatt természetes analitikai reagensek egy bizonyos típusú és törzsű baktériumok kimutatására.

Egy ilyen vizsgálat legegyszerűbb változatában különféle diagnosztikai bakteriofágokat csepegtetnek egy Petri-csészébe baktériumtenyészettel beoltott tápközeggel. Ha a baktérium érzékenynek bizonyul a fágra, akkor a bakteriális "gyep" ezen a helyén "plakk" képződik - egy átlátszó terület elölt és lizált baktériumsejtekkel.

A fágok szaporodásának elemzésével célbaktériumok jelenlétében számszerűsíthető ez utóbbiak bősége. Mivel az oldatban lévő fágrészecskék száma a benne lévő baktériumsejtek számával arányosan növekszik, elegendő a bakteriofág titerének meghatározása a baktériumok számának becsléséhez.

Az ilyen analitikai reakciók specifitása és érzékenysége meglehetősen magas, és maguk az eljárások egyszerűen végrehajthatók, és nem igényelnek kifinomult felszerelést. Fontos, hogy a bakteriofágokon alapuló diagnosztikai rendszerek élő kórokozó jelenlétét jelezzék, míg más módszerek, így a PCR és az immunanalitikai módszerek csak az ehhez a baktériumhoz tartozó biopolimerek jelenlétét jelzik. Az ilyen típusú diagnosztikai módszerek különösen alkalmasak a környezettanulmányok, valamint az élelmiszeripar és mezőgazdaság.

Jelenleg speciális módszereket alkalmaznak a mikroorganizmusok különböző törzseinek azonosítására és mennyiségi meghatározására. referencia faj fágok. Nagyon gyors, szinte valós időben működik elemző rendszerek genetikailag módosított bakteriofágok alapján hozhatók létre, amelyek baktériumsejtbe kerülve beindítják a riporter fluoreszcens (vagy lumineszcenciára képes) fehérjék szintézisét, mint pl. luciferáz. Amikor a szükséges szubsztrátokat hozzáadjuk egy ilyen közeghez, lumineszcens jel jelenik meg benne, amelynek értéke megfelel a mintában lévő baktériumok mennyiségének. Az ilyen „fénnyel jelölt” fágokat veszélyes kórokozók – a pestis kórokozói – kimutatására fejlesztették ki, lépfene, tuberkulózis és növényi fertőzések.

Valószínűleg a módosított fágok segítségével megoldható lesz a régóta fennálló, globális jelentőségű probléma is - olcsó ill. gyors módszerek a tuberkulózis kórokozóinak kimutatása korai fázis betegségek. Ez a feladat nagyon nehéz, mivel a mikobaktériumok, tuberkulózist okozva laboratóriumi körülmények között termesztve rendkívül lassú növekedés jellemzi. Ezért a betegség diagnózisa hagyományos módszerek akár több hétig is eltarthat.

A fág technológia megkönnyíti ezt a feladatot. Lényege, hogy a vizsgált vérmintákhoz D29 bakteriofág kerül, amely képes fertőzni. széleskörű mikobaktériumok. Ezután a bakteriofágokat elválasztják, és a mintát összekeverik egy gyorsan növekvő, nem patogén mikobaktérium kultúrával, amely szintén érzékeny erre a bakteriofágra. Ha kezdetben fágokkal fertőzött mikobaktériumok voltak a vérben, akkor az új tenyészetben bakteriofág termelés is megfigyelhető lesz. Ily módon a mikobaktériumok egyetlen sejtje kimutatható, és maga a diagnosztikai folyamat 2–3 hétről 2–5 napra csökken (Swift & Rees, 2016).

Fág kijelző

Ma a bakteriofágokat széles körben használják egyszerű rendszerek kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérjék előállítására. Ezt az 1980-as években fejlesztették ki. rendkívül hatékony molekuláris szelekciós technika - fág kijelző. Ezt a kifejezést az amerikai J. Smith javasolta, aki bebizonyította, hogy az Escherichia coli bakteriofágok alapján lehetséges életképes módosított vírust létrehozni, amely idegen fehérjét hordoz a felszínén. Ennek érdekében a megfelelő gént bejuttatják a fág genomjába, amely egyesül az egyik felszíni vírusfehérjét kódoló génnel. Az ilyen módosított bakteriofágok vad típusú fágokkal alkotott keverékből izolálhatók, mivel egy „idegen” fehérje képes specifikus antitestekhez kötődni (Smith, 1985).

Smith kísérleteiből kettő következett fontos megállapítások: először is, a rekombináns DNS-technológia segítségével 10 6 -10 14 fágrészecskékből álló populációkat lehet létrehozni, amelyek hatalmas diverzitásúak, és mindegyik a felszínén hordozza különböző változatok fehérjék. Az ilyen populációkat ún kombinatorikus fágkönyvtárak. Másodszor, ha egy adott fágot izolálunk egy populációból (például képes egy bizonyos fehérjéhez vagy szerves molekulához kötődni), ez a fág szaporítható bakteriális sejtekés korlátlan számú gyermeket kap az adott tulajdonságokkal.

A fágmegjelenítés manapság olyan fehérjéket termel, amelyek szelektíven kötődhetnek terápiás célpontokhoz, például azokhoz, amelyek az M13 fág felszínén vannak kitéve, és képesek felismerni a tumorsejteket és kölcsönhatásba lépni velük. Ezeknek a fehérjéknek a szerepe a fágrészecskében a nukleinsav „becsomagolása”, ezért jól alkalmasak génterápiás gyógyszerek előállítására, csak ebben az esetben már terápiás nukleinsavval alkotnak részecskét.

Ma a fágmegjelenítésnek két fő alkalmazási területe van. Peptid alapú technológiát használnak a receptorok feltárására és az antitestkötő helyek feltérképezésére, immunogének és nanovakcinák tervezésére, valamint az enzimfehérjék szubsztrátkötő helyek feltérképezésére. Fehérjéken és fehérjedoméneken alapuló technológia - kívánt tulajdonságokkal rendelkező antitestek kiválasztására, fehérje-ligandum kölcsönhatások vizsgálatára, expresszált komplementer DNS-fragmensek szűrésére és fehérjék célzott módosítására.

A fágmegjelenítés használatával lehetőség nyílik felismerő csoportok bejuttatására minden típusú felszíni vírusfehérjébe, valamint a bakteriofág testet alkotó fő fehérjébe. A kívánt tulajdonságú peptidek felületi fehérjékbe történő bejuttatásával értékes biotechnológiai termékek egész sora nyerhető. Például, ha ez a peptid egy fehérjét utánoz veszélyes vírus vagy baktériumok, felismerhetők immunrendszer, akkor egy ilyen módosított bakteriofág egy könnyen, gyorsan és biztonságosan fejleszthető vakcina.

Ha a bakteriofág terminális felszíni fehérje rákos sejtekhez van "címezve", és riportercsoportok (például fluoreszcens vagy mágneses) kapcsolódnak egy másik felszíni fehérjéhez, akkor eszközt kapunk a daganatok kimutatására. Ha pedig citotoxikus gyógyszert is adnak a részecskéhez (és a modern bioorganikus kémia ezt megkönnyíti), akkor olyan gyógyszert kapunk, amely a rákos sejteket célozza meg.

A protein fág display egyik fontos alkalmazása a rekombináns antitestek fágkönyvtárainak létrehozása, ahol az immunglobulinok antigénkötő fragmentumai az fd vagy M13 fág részecskék felszínén helyezkednek el. A humán antitest-könyvtárak különösen érdekesek, mivel az ilyen antitestek korlátozás nélkül használhatók a terápiában. Az elmúlt években mintegy tucat, ezzel a módszerrel előállított terápiás antitestet értékesítettek csak az Egyesült Államok gyógyszerpiacán.

"Ipari" fágok

A fágmegjelenítési módszertan meglehetősen váratlan alkalmazásokra is talált. Hiszen a bakteriofágok elsősorban egy bizonyos szerkezetű nanoméretű részecskék, amelyek felületén fehérjék helyezkednek el, amelyek egy fág display segítségével „elláthatók” azzal a tulajdonsággal, hogy specifikusan kötődjenek a kívánt molekulákhoz. Az ilyen nanorészecskék kinyílnak a legszélesebb lehetőségeket adott architektúrájú anyagokat és "okos" molekuláris nanoeszközöket készíteni, miközben ezek előállítási technológiája környezetbarát lesz.

Mivel a vírus meglehetősen merev szerkezet, bizonyos méretarányokkal, ez a körülmény lehetővé teszi, hogy ismert felülettel és kívánt póruseloszlású porózus nanostruktúrákat kapjunk a szerkezetben. Mint ismeretes, a katalizátor felülete a hatékonyságát meghatározó kritikus paraméter. A bakteriofágok felületén a fémek és oxidjaik legvékonyabb rétegének kialakítására szolgáló meglévő technológiák pedig lehetővé teszik egy adott méretű, rendkívül fejlett szabályos felületű katalizátorok előállítását. (Lee et al., 2012).

A. Belcher, az MIT kutatója az M13 bakteriofágot használta sablonként a ródium és nikkel nanorészecskék és nanoszálak növekedéséhez a cérium-oxid felületén. A keletkező katalizátor nanorészecskék elősegítik az etanol hidrogénné történő átalakítását, így ez a katalizátor nagyon hasznos lehet a meglévő hidrogén üzemanyagcellák korszerűsítésére és új hidrogén üzemanyagcellák létrehozására. A vírustempláton növesztett katalizátor nagyobb stabilitásban különbözik a „hagyományos” hasonló összetételű katalizátortól, kevésbé hajlamos az öregedésre és a felületi dezaktiválódásra (Nam et al. . , 2012).

A fonalas fágok arannyal és indium-dioxiddal való bevonásával elektrokróm anyagokat kaptak - porózus nanofilmeket, amelyek színt változtatnak az elektromos tér megváltozásakor, és másfélszer gyorsabban képesek reagálni az elektromos tér változására, mint az ismert analógok. Az ilyen anyagok ígéretesek az energiatakarékos ultravékony képernyős eszközök létrehozásában (Nam et al., 2012).

Massachusettsben technológiai Intézet A bakteriofágok nagyon erős és rendkívül kompakt elektromos akkumulátorok gyártásának alapjává váltak. Ehhez élő, génmódosított M13-as fágokat használtak, amelyek emberre ártalmatlanok, és képesek különféle fémionokat a felszínre kötni. Ezen vírusok önszerveződésének eredményeként adott konfigurációjú szerkezetek keletkeztek, amelyek fémmel bevonva meglehetősen hosszú nanoszálakat képeztek, amelyek az anód és a katód alapjává váltak. Az anód anyagának önképződéséhez egy arany és kobalt-oxid megkötésére képes vírust használtak, a katódhoz - amely képes vas-foszfátot és ezüstöt megkötni. Ez utóbbi fág arra is képes volt, hogy a molekuláris felismerés révén "felvegye" a szén nanocső végeit, ami a hatékony elektronátvitel biztosításához szükséges.

Az M13 bakteriofág, a titán-dioxid és az egyfalú szén nanocsövek komplexei alapján napelemekhez is készítettek anyagokat (Dang et al., 2011).

Az elmúlt éveket a bakteriofágok kiterjedt kutatása jellemezte, amelyek nemcsak a terápiában, hanem a bio- és nanotechnológiákban is új alkalmazásokat találnak. Kézenfekvő gyakorlati eredményük a személyre szabott orvoslás új, erőteljes irányának megjelenése, valamint az élelmiszeriparban, az állatgyógyászatban, a mezőgazdaságban és a korszerű anyagok gyártásában egy sor technológia létrehozása. Arra számítunk, hogy a bakteriofágok kutatásának második évszázada ugyanannyi felfedezést hoz majd, mint az első.

Irodalom
1. Bakteriofágok: biológia és alkalmazások / Szerk.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Tudományos világ. 2012.
2. Stent G., Kalindar R. Molekuláris genetika. M.: Mir. 1974. 614 p.
3. Tikunova N. V., Morozova V. V. Fágmegjelenítés fonalas bakteriofágokon: alkalmazás rekombináns antitestek kiválasztására // Acta Naturae. 2009. 3. szám C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bakteriofág: Genetika és molekuláris biológia. Horizon Scientific Press, 2007.