Bakteriofaagid: rakenduse kaasaegsed aspektid, tulevikuväljavaated. Faagide kasutamine meditsiinis ja mikrobioloogias

Eelmise sajandi keskel astus bioloogiateadus pöördelise sammu edasi, luues elussüsteemide toimimiseks molekulaarse aluse. Suur roll edukas uurimistöös, mis viis pärilike molekulide keemilise olemuse kindlaksmääramiseni, dekodeerimiseni geneetiline kood ja mängis eelmise sajandi alguses avastatud geenimanipulatsiooni tehnoloogiate loomine, bakteriofaagid. Praeguseks on need bakteriaalsed viirused omandanud palju inimestele kasulikke "kutsealasid": neid kasutatakse mitte ainult ohutute antibakteriaalsete ravimitena, vaid ka desinfektsioonivahenditena ja isegi elektrooniliste nanoseadmete loomise alusena.

Kui 1930. a rühm teadlasi võttis käsile elussüsteemide toimimise probleemid, seejärel pöörasid nad lihtsamaid mudeleid otsides tähelepanu bakteriofaagid- bakteriaalsed viirused. Lõppude lõpuks pole bioloogiliste objektide hulgas midagi lihtsamat kui bakteriofaagid, pealegi saab neid lihtsalt ja kiiresti kasvatada ja analüüsida ning viiruste geneetilised programmid on väikesed.

Faag on minimaalse suurusega looduslik struktuur, mis sisaldab tihedalt pakitud geneetilist programmi (DNA või RNA), milles pole midagi üleliigset. See programm on suletud valgukestasse, mis on varustatud minimaalse seadmete komplektiga selle bakterirakku viimiseks. Bakteriofaagid ei saa ise paljuneda ja selles mõttes ei saa neid pidada täisväärtuslikeks elusobjektideks. Nende geenid hakkavad töötama ainult bakterites, kasutades selleks bakterirakus olemasolevaid biosünteetilisi süsteeme ja sünteesiks vajalikke molekulide varusid. Kuid nende viiruste geneetilised programmid ei erine põhimõtteliselt enamate viiruste omadest keerulised organismid Seetõttu võimaldasid katsed bakteriofaagidega kindlaks teha genoomi struktuuri ja toimimise aluspõhimõtted.

Hiljem said need teadmised ja uurimistöö käigus välja töötatud meetodid aluseks bioloogia- ja arstiteaduse arengule ning laiaulatuslikele biotehnoloogilistele rakendustele.

Võitlejad patogeenide vastu

Esimesed katsed kasutada raviks bakteriofaage nakkushaigused võeti ette peaaegu kohe pärast nende avastamist, kuid teadmiste puudumine ja tolleaegsed ebatäiuslikud biotehnoloogiad ei võimaldanud neil täielikku edu saavutada. Sellegipoolest näitas edasine kliiniline praktika bakteriofaagide eduka kasutamise võimalust nakkushaiguste korral. seedetrakti, Urogenitaalsüsteem, patsientide ägedate mäda-septiliste seisundite korral, kirurgiliste infektsioonide raviks jne.

Võrreldes antibiootikumidega on bakteriofaagidel mitmeid eeliseid: nad ei põhjusta kõrvalmõjud Pealegi on need rangelt spetsiifilised teatud tüüpi bakteritele, mistõttu nende kasutamisel ei häirita inimese normaalset mikrobioomi. Selline kõrge selektiivsus tekitab aga ka probleeme: patsiendi edukaks raviks on vaja täpselt teada nakkustekitajat ja valida bakteriofaag individuaalselt.

Faage võib kasutada ka profülaktiliselt. Näiteks Moskva epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut. G. N. Gabrichevsky töötas välja bakteriofaagide kokteilil põhineva profülaktilise toote "FOODFAG", mis vähendab ägeda infektsiooni riski. sooleinfektsioonid. Kliinilised uuringud on näidanud, et iganädalane ravimi tarbimine võimaldab teil vabaneda hemolüüsivast Escherichia colist ja teistest patogeensetest ja oportunistlikest bakteritest, põhjustab düsbakterioosi sooled.

Bakteriofaagid ravivad mitte ainult inimeste, vaid ka kodu- ja põllumajandusloomade nakkushaigusi: lehmade mastiiti, vasikate ja sigade kolibatsilloosi ja escherichioosi, kanade salmonelloosi... Eriti mugav on faagipreparaate kasutada vesiviljeluse puhul – tööstuslikult kasvatatud kalade ja krevettide töötlemine, sest need püsivad vees kaua. Bakteriofaagid aitavad ka taimi kaitsta, kuigi faagitehnoloogiate kasutamine on sel juhul keeruline viirustele kahjulike looduslike tegurite (nt päikesevalguse ja vihma) mõju tõttu.

Faagidel võib olla suur roll toidu mikrobioloogilise ohutuse säilitamisel, kuna antibiootikumide ja keemiliste ainete kasutamine toiduainetööstuses seda probleemi ei lahenda, samas vähendab toodete keskkonnasõbralikkuse taset. Probleemi enda tõsidusest annab tunnistust statistika: näiteks USA-s ja Venemaal registreeritakse aastas kuni 40 tuhat salmonelloosijuhtu, millest 1% sureb. Selle nakkuse levikut seostatakse suures osas eri tüüpi kodulindude kasvatamise, töötlemise ja tarbimisega ning katsed kasutada selle vastu võitlemiseks bakteriofaage on andnud paljulubavaid tulemusi.

Jah, Ameerika ettevõte Intralytix toodab faagipreparaate listerioosi, salmonelloosi ja Escherichia coli bakteriaalse saastumise vastu võitlemiseks. Need on heaks kiidetud kasutamiseks lisaainetena, et vältida bakterite kasvu toidul – neid pihustatakse liha- ja linnulihatoodetele, samuti juur- ja puuviljadele. Katsed on näidanud, et bakteriofaagide kokteili saab edukalt kasutada elusate tiigikalade transportimisel ja müügil, et vähendada mitte ainult vee, vaid ka kala enda bakteriaalset saastumist.

Bakteriofaagide ilmne rakendus on desinfitseerimine, see tähendab bakterite hävitamist kohtades, kus neid ei tohiks olla: haiglates, toiduainetööstuses jne. Sel eesmärgil Briti ettevõte Fikseeritud faag töötas välja meetodi faagipreparaatide pindadele kinnitamiseks, mis tagab säilivuse bioloogiline aktiivsus faagid kuni kolm aastat.

Bakteriofaagid - molekulaarbioloogia "Drosophila".

1946. aastal kuulutati 11. sümpoosionil kuulsas Ameerika laboris Cold Spring Harboris välja teooria "üks geen – üks ensüüm". Bakterioloog A. Hershey ja "endine" füüsik, molekulaarbioloog M. Delbrück teatasid geneetiliste tunnuste vahetusest erinevate faagide vahel, nakatades samal ajal Escherichia coli rakke. See avastus, mis tehti ajal, mil geeni füüsiline kandja polnud veel teada, andis tunnistust, et "rekombinatsiooni" fenomen – geneetiliste tunnuste segunemine on iseloomulik mitte ainult kõrgematele organismidele, vaid ka viirustele. Selle nähtuse avastamine võimaldas hiljem üksikasjalikult uurida replikatsiooni molekulaarseid mehhanisme. Hiljem võimaldasid katsed bakteriofaagidega paika panna geneetiliste programmide ülesehituse ja toimimise põhimõtted.

1952. aastal tõestasid A. Hershey ja M. Chase eksperimentaalselt, et bakteriofaagi T2 pärilik informatsioon ei ole kodeeritud valkudes, nagu paljud teadlased arvasid, vaid DNA molekulides (Hershey & Chase, 1952). Teadlased jälgisid paljunemisprotsessi kahes bakteriofaagirühmas, millest üks kandis radioaktiivselt märgistatud valke ja teine ​​DNA molekule. Pärast bakterite nakatamist selliste faagidega selgus, et nakatunud rakku edastatakse ainult viiruse DNA, mis oli tõendiks selle rolli kohta päriliku teabe säilitamisel ja edastamisel.

Samal aastal leidsid Ameerika geneetikud D. Lederberg ja N. Zindler katses, milles osalesid kaks Salmonella tüve ja bakteriofaag P22, et bakteriofaag on võimeline paljunemise ajal kaasama peremeesbakteri DNA fragmente ja kandma need edasi teistele bakteritele. nakatumisel (Zinder & Lederberg, 1952). Seda geeniülekande nähtust doonorbakterilt retsipientbakterile on nimetatud "transduktsiooniks". Katse tulemused said järjekordseks kinnituseks DNA rolli kohta päriliku teabe edastamisel.

1969. aastal said A. Hershey, M. Delbrück ja nende kolleeg S. Luria Nobeli preemia laureaatideks "avastuste eest, mis puudutavad viiruste replikatsioonimehhanismi ja geneetilist struktuuri".

1972. aastal, uurides E. coli DNA replikatsiooni (rakuinfo kopeerimist), kasutasid R. Bird ja kolleegid bakteriofaage kui sonde, mis on võimelised integreeruma bakteriraku genoomi ja leidsid, et replikatsiooniprotsess kulgeb mööda kromosoomi kahes suunas. (Stent, 1974).

Seitse päeva loomist

Kaasaegsed sünteetilise bioloogia meetodid võimaldavad mitte ainult faagigenoomides teha mitmesuguseid modifikatsioone, vaid ka luua täiesti kunstlikke aktiivseid faage. Tehnoloogiliselt pole see keeruline, tuleb lihtsalt sünteesida faagi genoom ja viia see bakterirakku ning seal käivitatakse kõik valkude sünteesiks ja uute faagiosakeste kokkupanemiseks vajalikud protsessid. Kaasaegsetes laborites võtab see töö aega vaid paar päeva.

Faagide spetsiifilisuse muutmiseks ja nende efektiivsuse suurendamiseks kasutatakse geneetilisi modifikatsioone. terapeutiline toime. Selleks on kõige agressiivsemad faagid varustatud äratundmisstruktuuridega, mis seovad need sihtbakteritega. Samuti sisestatakse viiruse genoomi täiendavalt geenid, mis kodeerivad bakteritele toksilisi valke, mis häirivad ainevahetust – sellised faagid on bakteritele surmavamad.

Bakteritel on antibiootikumide ja bakteriofaagide vastu mitu kaitsemehhanismi, millest üks on viiruse genoomide hävitamine. restriktsiooniensüümid toimides spetsiifilistele nukleotiidjärjestustele. Faagide terapeutilise aktiivsuse suurendamiseks saab geneetilise koodi degeneratsiooni tõttu nende geenide järjestusi "ümber vormindada" selliselt, et minimeerida ensüümide suhtes "tundlike" nukleotiidjärjestuste arvu, säilitades samal ajal nende kodeerimisomadused.

Universaalne viis bakterite kaitsmiseks kõige eest välismõjud- nn biofilmid, DNA, polüsahhariidide ja valkude kiled, mida bakterid koos loovad ja kuhu ei tungi ei antibiootikumid ega ravivalgud. Sellised biofilmid on peavalu arstid, kuna need aitavad kaasa hambaemaili hävitamisele, moodustuvad implantaatide, kateetrite, tehisliigeste pinnale ja ka hingamisteed, naha pinnal jne. Biokilede vastu võitlemiseks konstrueeriti spetsiaalsed bakteriofaagid, mis sisaldasid geeni, mis kodeerib spetsiaalset lüütilist ensüümi, mis hävitab bakteripolümeere.

Ensüümid "bakteriofaagist"

Bakteriofaagide uurimise tulemusena avastati suur hulk ensüüme, mida tänapäeval laialdaselt kasutatakse molekulaarbioloogias ja geenitehnoloogias.

Üks selline näide on restriktsiooniensüümid, rühm bakteriaalseid nukleaase, mis lõhustavad DNA-d. Veel 1950. aastate alguses. Leiti, et ühe bakteritüve rakkudest eraldatud bakteriofaagid paljunevad sageli lähedalt seotud tüves halvasti. Selle nähtuse avastamine tähendas, et bakteritel on süsteem viiruste paljunemise pärssimiseks (Luria & Human, 1952). Selle tulemusena avastati ensümaatiline restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem, mille abil bakterid hävitasid rakku sattunud võõr-DNA. Restriktsiooniensüümide (restriktsiooni endonukleaaside) eraldamine andis molekulaarbioloogidele hindamatu vahendi DNA-ga manipuleerimiseks: sisestage üks järjestus teise või lõigake välja vajalikud ahelafragmendid, mis lõpuks viis rekombinantse DNA tehnoloogia väljatöötamiseni.

Teine molekulaarbioloogias laialdaselt kasutatav ensüüm on bakteriofaagi T4 DNA ligaas, mis "ristseob" kaheahelaliste DNA ja RNA molekulide "kleepuvad" ja "nürid" otsad. Ja hiljuti on ilmunud selle ensüümi suurema aktiivsusega geneetiliselt muundatud variandid.

Suurem osa laboripraktikas kasutatavatest RNA ligaasidest, mis "õmblevad" üheahelalisi RNA ja DNA molekule, pärinevad samuti bakteriofaagidest. Looduses kasutatakse neid peamiselt purustatud RNA molekulide parandamiseks. Teadlased kasutavad kõige sagedamini bakteriofaagi T4 RNA ligaasi, mis võib nende märgistamiseks RNA molekulidele "õmmelda" üheahelalisi polünukleotiide. Seda tehnikat kasutatakse RNA struktuuri analüüsimiseks, RNA-valgu sidumissaitide otsimiseks, oligonukleotiidide sünteesiks jne. Viimasel ajal on tavapäraselt kasutatavate ensüümide hulgas ilmunud termostabiilsed RNA ligaasid, mis on eraldatud bakteriofaagidest rm378 ja TS2126 (Nordberg Karlsson, et al., 2010). Hjorleifsdottir, 2014).

Bakteriofaagidest saadi ka osa teisest ülitähtsate ensüümide rühmast, polümeraasidest. Näiteks väga "täpne" bakteriofaagi T7 DNA polümeraas, mis on leidnud rakendust erinevaid valdkondi molekulaarbioloogia, näiteks kohtsuunatud mutagenees, kuid seda kasutatakse peamiselt DNA primaarse struktuuri määramiseks.

On pakutud välja keemiliselt modifitseeritud T7 faagi DNA polümeraas nagu ideaalne tööriist DNA sekveneerimiseks juba 1987. aastal (Tabor & Richardson, 1987). Selle polümeraasi modifitseerimine on suurendanud selle efektiivsust mitu korda: DNA polümerisatsiooni kiirus ulatub sel juhul üle 300 nukleotiidi sekundis, nii et seda saab kasutada suurte DNA fragmentide amplifitseerimiseks. Sellest ensüümist sai sekvenaasi eelkäija, geneetiliselt muundatud ensüüm, mis on optimeeritud DNA sekveneerimiseks Sangeri reaktsioonis. Sekvenaasi iseloomustab kõrge efektiivsus ja võime lülitada DNA järjestusse nukleotiidi analooge, mida kasutatakse sekveneerimistulemuste parandamiseks.

Bakteriofaagidest pärinevad ka peamised molekulaarbioloogias kasutatavad RNA polümeraasid (DNA-sõltuvad RNA polümeraasid) – ensüümid, mis katalüüsivad transkriptsiooniprotsessi (RNA koopiate lugemine DNA matriitsist). Nende hulka kuuluvad SP6, T7 ja T3 RNA polümeraasid, mis on nimetatud vastavate bakteriofaagide SP6, T7 ja T3 järgi. Kõiki neid ensüüme kasutatakse antisenss-RNA transkriptide, märgistatud RNA sondide jne in vitro sünteesiks.

Esimene täielikult sekveneeritud DNA genoom oli φ174 faagi genoom, üle 5000 nukleotiidi pikk (Sanger et al., 1977). Selle dekodeerimise viis läbi rühm inglise biokeemikut F. Sangerit, kes oli kuulsa samanimelise DNA sekveneerimismeetodi looja.

Polünukleotiidkinaasid katalüüsivad fosfaatrühma ülekandumist ATP molekulilt nukleiinhappemolekuli 5'-otsa, 5'-fosfaatrühmade vahetust või mononukleotiidide 3'-otste fosforüülimist. Laboratoorses praktikas kasutatakse kõige laialdasemalt bakteriofaagi T4 polünukleotiidkinaasi. Seda kasutatakse tavaliselt katsetes DNA märgistamiseks fosfori radioaktiivse isotoobiga. Polünukleotiidkinaasi kasutatakse ka restriktsioonisaitide otsimiseks, DNA ja RNA sõrmejälgede võtmiseks, DNA või RNA ligaaside substraatide sünteesiks.

Molekulaarbioloogilistes katsetes kasutatakse bakteriofaagi ensüüme, nagu T4 faagi polünukleotiidkinaas, mida tavaliselt kasutatakse DNA märgistamiseks fosfori radioaktiivse isotoobiga, DNA ja RNA sõrmejälgede võtmiseks jne, samuti DNA-d lõhustavaid ensüüme, mida kasutatakse üheahelalise saamiseks. DNA malle kasutatakse laialdaselt ka molekulaarbioloogilistes katsetes nukleotiidide polümorfismi sekveneerimiseks ja analüüsimiseks.

Sünteetilise bioloogia meetodeid kasutades oli võimalik välja töötada ka bakteriofaage, mis olid relvastatud kõige keerukamate relvadega, mida bakterid faagide endi vastu kasutavad. See on umbes bakteriaalsete CRISPR-Cas süsteemide kohta, mis kujutavad endast DNA-d lõikava ensüümi nukleaasi ja RNA järjestuse kompleksi, mis suunab selle ensüümi toimet viiruse genoomi spetsiifilisele fragmendile. Faagi DNA tükk toimib "osutajana", mille bakter salvestab "mälu jaoks" spetsiaalsesse geeni. Kui sarnane fragment leitakse bakteri seest, hävitab see valgu-nukleotiidi kompleks selle.

Olles välja selgitanud CRISPR-Cas süsteemide töömehhanismi, püüdsid teadlased varustada faagid ise sarnase "relvaga", mille jaoks oli nukleaasi kodeeriv geenide kompleks, mis adresseerib bakteri genoomi teatud piirkondadega komplementaarseid RNA järjestusi. sisestatud nende genoomi. "Sihtmärgiks" võivad olla mitme ravimiresistentsuse eest vastutavad geenid. Katseid kroonis täielik edu – sellised faagid mõjutasid suure efektiivsusega baktereid, millele nad olid "häälestatud".

Faagi antibiootikumid

Terapeutilistel eesmärkidel ei pea faage otseselt kasutama. Bakteriofaagid on miljonite aastate jooksul evolutsiooni käigus välja töötanud spetsiifiliste valkude arsenali – vahendid sihtmärkmikroorganismide äratundmiseks ja ohvri biopolümeeridega manipuleerimiseks, mille põhjal saab luua antibakteriaalseid ravimeid. Seda tüüpi kõige lootustandvamad valgud on endolüsiini ensüümid, mida faagid kasutavad rakuseina hävitamiseks pärast bakterist väljumist. Need ained on iseenesest võimsad antibakteriaalsed ained, mis ei ole inimestele mürgised. Nende toime tõhusust ja suunda saab suurendada, muutes neis adresseerimisstruktuure – teatud bakteritega spetsiifiliselt seonduvaid valke.

Enamik baktereid jagunevad rakuseina ehituse järgi grampositiivseteks, mille membraan on kaetud väga paksu peptidoglükaanide kihiga, ja gramnegatiivseteks, milles peptidoglükaanikiht asub kahe membraani vahel. Looduslike endolüsiinide kasutamine on eriti efektiivne grampositiivsete bakterite (stafülokokid, streptokokid jne) puhul, kuna nende peptidoglükaanikiht asub väljaspool. Gramnegatiivsed bakterid (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, coli jne) on vähem ligipääsetav sihtmärk, kuna ensüüm peab sisemise peptidoglükaani kihini jõudmiseks tungima läbi välimise bakterimembraani.

Selle probleemi lahendamiseks loodi nn artilüsiinid – looduslike endolüsiinide modifitseeritud versioonid, mis sisaldavad polükatioonseid või amfipaatilisi peptiide, mis destabiliseerivad välismembraani ja tagavad endolüsiini kohaletoimetamise otse peptidoglükaani kihti. Artilysiinidel on kõrge bakteritsiidne toime ja need on juba osutunud efektiivseks koerte keskkõrvapõletiku ravis (Briers et al., 2014).

Näiteks modifitseeritud endolüsiinist, mis toimib selektiivselt teatud bakteritele, on Kanada ettevõtte ravim P128. Ganga Gen Inc.. See on endolüsiini bioloogiliselt aktiivne fragment, mis on seotud lüsostafiiniga, sihtmärgiks oleva valgu molekuliga, mis seondub stafülokoki rakkude pinnaga. Saadud kimäärsel valgul on kõrge aktiivsus erinevate stafülokoki tüvede, sealhulgas mitme ravimiresistentsuse tüvede vastu.

Bakterite "loendurid".

Bakteriofaagid ei toimi mitte ainult mitmekülgse ravi- ja "desinfitseeriva" vahendina, vaid ka mugava ja täpse analüüsivahendina mikrobioloogile. Näiteks on need oma kõrge spetsiifilisuse tõttu looduslikud analüütilised reaktiivid teatud tüüpi ja tüve bakterite tuvastamiseks.

Sellise uuringu kõige lihtsamas versioonis lisatakse Petri tassile tilkhaaval erinevaid diagnostilisi bakteriofaage koos bakterikultuuriga nakatatud toitekeskkonnaga. Kui bakter osutub faagi suhtes tundlikuks, siis selles bakteriaalse "muru" kohas moodustub "plaak" - läbipaistev ala tapetud ja lüüsitud bakterirakkudega.

Analüüsides faagide paljunemist sihtbakterite juuresolekul, saab kvantifitseerida viimaste arvukuse. Kuna faagiosakeste arv lahuses suureneb proportsionaalselt selles sisalduvate bakterirakkude arvuga, piisab bakteriofaagi tiitri määramisest, et hinnata bakterite arvu.

Sellise analüütilise reaktsiooni spetsiifilisus ja tundlikkus on üsna kõrged ning protseduurid ise on lihtsalt teostatavad ega vaja keerukaid seadmeid. On oluline, et bakteriofaagidel põhinevad diagnostikasüsteemid annaksid signaali elava patogeeni olemasolust, samas kui teised meetodid, nagu PCR ja immunoanalüütilised meetodid, näitavad ainult sellesse bakterisse kuuluvate biopolümeeride olemasolu. Seda tüüpi diagnostikameetodid sobivad eriti hästi kasutamiseks keskkonnauuringutes, samuti toiduainetööstuses ja põllumajandus.

Nüüd kasutatakse erinevate mikroorganismide tüvede tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks spetsiaalseid meetodeid. võrdlusliigid faagid. Geneetiliselt muundatud bakteriofaagide baasil saab luua väga kiireid, peaaegu reaalajas analüütilisi süsteeme, mis bakterirakku sattudes käivitavad reporterfluorestseeruvate (või luminestsentsvõimeliste) valkude sünteesi, nt. lutsiferaas. Vajalike substraatide lisamisel sellisesse söötmesse ilmub sinna luminestsentssignaal, mille väärtus vastab bakterite sisaldusele proovis. Sellised "valgusmärgisega" faagid on välja töötatud ohtlike patogeenide – katku tekitajate – avastamiseks, siberi katk, tuberkuloos ja taimeinfektsioonid.

Tõenäoliselt õnnestub modifitseeritud faagide abil lahendada ka kauaaegne globaalse tähtsusega probleem - töötada välja odavad ja kiired meetodid tuberkuloositekitajate tuvastamiseks haiguse varases staadiumis. See ülesanne on väga raske, kuna tuberkuloosi põhjustavatele mükobakteritele on iseloomulik väga aeglane kasv, kui neid kasvatatakse laboratoorsed tingimused. Seetõttu võib haiguse diagnoosimist traditsiooniliste meetoditega edasi lükata kuni mitu nädalat.

Faagitehnoloogia muudab selle ülesande lihtsamaks. Selle olemus seisneb selles, et analüüsitud vereproovidele lisatakse bakteriofaag D29, mis on võimeline nakatama. lai valik mükobakterid. Seejärel bakteriofaagid eraldatakse ja proov segatakse kiiresti kasvava mittepatogeense mükobakterite kultuuriga, mis on samuti selle bakteriofaagi suhtes tundlik. Kui algselt leidus veres mükobaktereid, mis olid nakatunud faagidega, siis bakteriofaagi tootmist jälgitakse ka uues kultuuris. Nii saab tuvastada üksikuid mükobakterirakke ja diagnostiline protsess ise väheneb 2–3 nädalalt 2–5 päevale (Swift & Rees, 2016).

Faagi kuvamine

Tänapäeval kasutatakse bakteriofaage laialdaselt lihtsad süsteemid soovitud omadustega valkude tootmiseks. See on see, mis töötati välja 1980. aastatel. äärmiselt tõhus molekulaarse valiku tehnika - faagi ekraan. Selle termini pakkus välja ameeriklane J. Smith, kes tõestas, et Escherichia coli bakteriofaagide põhjal on võimalik luua elujõuline modifitseeritud viirus, mis kannab oma pinnal võõrvalku. Selleks viiakse faagi genoomi vastav geen, mis sulandub ühte pinnaviiruse valku kodeeriva geeniga. Selliseid modifitseeritud bakteriofaage saab eraldada segust metsiktüüpi faagidega, kuna "võõras" valk on võimeline seonduma spetsiifiliste antikehadega (Smith, 1985).

Smithi katsetest järgnesid kaks olulist järeldust: esiteks on rekombinantse DNA tehnoloogia abil võimalik luua tohutuid populatsioone, mis koosnevad 10 6–10 14 faagiosakest, millest igaüks kannab oma pinnal erinevaid valguvariante. Selliseid populatsioone nimetatakse kombinatoorsed faagi raamatukogud. Teiseks, isoleerides populatsioonist spetsiifilise faagi (näiteks millel on võime seostuda teatud valgu või orgaanilise molekuliga), saab seda faagi paljundada bakterirakkudes ja saada piiramatul arvul soovitud omadustega järeltulijaid.

Faagi kuvamine toodab tänapäeval valke, mis võivad selektiivselt seostuda terapeutiliste sihtmärkidega, näiteks nendega, mis on eksponeeritud M13 faagi pinnal, mis suudavad ära tunda kasvajarakke ja suhelda nendega. Nende valkude roll faagiosakeses on nukleiinhapet "pakendada", seetõttu sobivad nad hästi geeniteraapia ravimite loomiseks, ainult sel juhul moodustavad nad osakese juba koos terapeutilise nukleiinhappega.

Tänapäeval on faagikuvaril kaks peamist rakendusvaldkonda. Peptiidipõhist tehnoloogiat kasutatakse retseptorite uurimiseks ja antikehade seondumiskohtade kaardistamiseks, immunogeenide ja nanovaktsiinide kavandamiseks ning ensüümvalkude substraadi sidumissaitide kaardistamiseks. Valkudel ja valgudomeenidel põhinev tehnoloogia – soovitud omadustega antikehade valimiseks, valgu-ligandi interaktsioonide uurimiseks, ekspresseeritud komplementaarsete DNA fragmentide skriinimiseks ja valkude sihipärasteks modifikatsioonideks.

Faagidisplei abil on võimalik sisestada äratundmisrühmi igat tüüpi pinnaviiruse valkudesse, samuti peamisse bakteriofaagi keha moodustavasse valku. Soovitud omadustega peptiidide sisestamisega pinnavalkudesse on võimalik saada terve rida väärtuslikke biotehnoloogilisi tooteid. Näiteks kui see peptiid jäljendab immuunsüsteemi poolt äratuntud ohtliku viiruse või bakteri valku, siis selline modifitseeritud bakteriofaag on vaktsiin, mida saab kergesti, kiiresti ja ohutult toota.

Kui bakteriofaagi terminaalne pinnavalk on “adresseeritud”. vähirakud ja kinnitage reporterrühmad (näiteks fluorestseeruvad või magnetilised) mõne teise pinnavalgu külge, siis saate tööriista kasvajate tuvastamiseks. Ja kui osakesele lisatakse ka tsütotoksilist ravimit (ja tänapäevane bioorgaaniline keemia teeb seda lihtsaks), siis saame ravimi, mis on suunatud vähirakkudele.

Valgufaagide esituse üheks oluliseks rakenduseks on rekombinantsete antikehade faagiraamatukogude loomine, kus fd või M13 faagiosakeste pinnal paiknevad immunoglobuliinide antigeeni siduvad fragmendid. Inimese antikehade raamatukogud pakuvad erilist huvi, kuna selliseid antikehi saab kasutada teraapias ilma piiranguteta. IN viimased aastad ainuüksi USA ravimiturg müüb kümmekond selle meetodiga valmistatud terapeutilist antikeha.

"Tööstuslikud" faagid

Faagikuvamise metoodika on leidnud ka üsna ootamatuid rakendusi. Bakteriofaagid on ju eelkõige teatud struktuuriga nanosuuruses osakesed, mille pinnal paiknevad valgud, millele saab faagikuvari abil “andada” omadused, mis seonduvad spetsiifiliselt soovitud molekulidega. Sellised nanoosakesed avanevad kõige laiemad võimalused luua etteantud arhitektuuriga materjale ja "tarku" molekulaarseid nanoseadmeid, samas kui nende tootmistehnoloogiad on keskkonnasõbralikud.

Kuna viirus on teatud mõõtmete suhtega üsna jäik struktuur, võimaldab see asjaolu kasutada seda teadaoleva pindala ja soovitud pooride jaotusega poorsete nanostruktuuride saamiseks struktuuris. Nagu teada, on katalüsaatori pindala selle tõhususe määrav kriitiline parameeter. Ja olemasolevad tehnoloogiad kõige õhema metallide ja nende oksiidide kihi moodustamiseks bakteriofaagide pinnal võimaldavad saada katalüsaatoreid, millel on antud mõõtmega äärmiselt arenenud korrapärane pind. (Lee et al., 2012).

MIT-i teadlane A. Belcher kasutas bakteriofaagi M13 mallina roodiumi ja nikli nanoosakeste ja nanojuhtmete kasvatamiseks tseeriumoksiidi pinnal. Saadud katalüsaatori nanoosakesed hõlbustavad etanooli muundamist vesinikuks; seega võib see katalüsaator olla väga kasulik olemasolevate vesinikkütuseelementide uuendamiseks ja uute loomiseks. Viiruse mallil kasvatatud katalüsaator erineb sarnase koostisega "tavalisest" katalüsaatorist suurema stabiilsuse poolest, see on vähem vastuvõtlik vananemisele ja pinna deaktiveerumisele (Nam et al. . , 2012).

Filamentsete faagide kulla ja indiumdioksiidiga katmisel saadi elektrokroomsed materjalid – elektrivälja muutumisel värvi muutvad poorsed nanokiled, mis on võimelised reageerima elektrivälja muutusele poolteist korda kiiremini kui teadaolevad analoogid. Sellised materjalid on paljulubavad energiasäästlike üliõhukese ekraaniga seadmete loomisel (Nam et al., 2012).

Massachusettsis Tehnoloogiainstituut bakteriofaagid said aluseks väga võimsate ja ülimalt kompaktsete elektriakude tootmisel. Selleks kasutati elusaid, geneetiliselt muundatud M13 faage, mis on inimesele kahjutud ja suudavad pinnale kinnitada erinevaid metalliioone. Nende viiruste isekoostumise tulemusena saadi etteantud konfiguratsiooniga struktuurid, mis metalliga katmisel moodustasid üsna pikad nanojuhtmed, millest sai anoodi ja katoodi alus. Anoodi materjali isemoodutamisel kasutati viirust, mis oli võimeline siduma kulda ja koobaltoksiidi, katoodi jaoks - mis on võimeline kinnitama raudfosfaati ja hõbedat. Viimasel faagil oli molekulaarse äratundmise tõttu ka võime "korjata" üles süsinik-nanotoru otsad, mis on vajalik tõhusa elektronide ülekande tagamiseks.

Päikesepatareide jaoks on loodud materjale ka bakteriofaagi M13, titaandioksiidi ja ühe seinaga süsinik-nanotorude komplekside põhjal (Dang et al., 2011).

Viimaseid aastaid on iseloomustanud ulatuslikud bakteriofaagide uuringud, mis leiavad uusi rakendusi mitte ainult teraapias, vaid ka bio- ja nanotehnoloogiates. Nende ilmne praktiline tulemus peaks olema personaliseeritud meditsiini uue võimsa suuna esilekerkimine, samuti terve rea tehnoloogiate loomine toiduainetööstuses, veterinaarmeditsiinis, põllumajanduses ja kaasaegsete materjalide tootmises. Ootame, et bakteriofaagide uurimise teine ​​sajand toob vähem avastusi kui esimene.

Kirjandus
1. Bakteriofaagid: bioloogia ja rakendused / Toim.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Teadusmaailm. 2012. aasta.
2. Stent G., Kalindar R. Molekulaargeneetika. M.: Mir. 1974. 614 lk.
3. Tikunova N. V., Morozova V. V. Filamentsetel bakteriofaagidel põhinev faagikuva: rakendus rekombinantsete antikehade valimiseks // Acta Naturae. 2009. nr 3. C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bakteriofaag: geneetika ja molekulaarbioloogia. Horizon Scientific Press, 2007.

№ 10-2013

Foto tehtud koos elektronmikroskoop,
näitab bakteriofaagide (kolifaagide T1) fikseerimise protsessi E. coli bakteri pinnal.

20. sajandi lõpus sai selgeks, et Maa biosfääris domineerivad kahtlemata bakterid, mis moodustavad enam kui 90% selle biomassist. Igal liigil on palju spetsiifilisi viiruste tüüpe. Esialgsetel hinnangutel on bakteriofaagiliikide arv umbes 10 15 . Selle joonise ulatuse mõistmiseks võime öelda, et kui iga inimene Maal avastab iga päev ühe uue bakteriofaagi, kulub nende kõigi kirjeldamiseks 30 aastat.

Seega on bakteriofaagid meie biosfääris kõige vähem uuritud olendid. Enamik tänapäeval tuntud bakteriofaagid kuuluvad seltsi Caudovirales – sabaviirused. Nende osakeste suurus on 50–200 nm. Erineva pikkuse ja kujuga saba tagab viiruse kinnitumise peremeesbakteri pinnale, pea (kapsiid) toimib genoomi hoidlana. Genoomne DNA kodeerib struktuurseid valke, mis moodustavad bakteriofaagi "keha", ja valke, mis tagavad faagi paljunemise rakus nakatumise ajal.

Võime öelda, et bakteriofaag on looduslik kõrgtehnoloogiline nanoobjekt. Näiteks faagi sabad on "molekulaarne süstal", mis läbistab bakteri seina ja süstib selle DNA rakku, kui see kokku tõmbub. Sellest hetkest algab nakkustsükkel. Selle edasised etapid hõlmavad bakteriaalsete elumehhanismide lülitamist bakteriofaagi teenindamiseks, selle genoomi paljundamist, viiruse ümbriste mitme koopia ehitamist, viiruse DNA pakkimist neisse ja lõpuks peremeesraku hävitamist (lüüsi).

Bakteriofaag ei ​​ole elusolend, vaid looduse poolt loodud molekulaarne nanomehhanism.
Bakteriofaagi saba on süstal, mis läbistab bakteri seina ja süstib viiruse DNA-d,
mida hoitakse peas (kapsiidis), raku sees.

Lisaks bakterite kaitsemehhanismide pidevale evolutsioonilisele konkurentsile ja viiruste rünnakule võib praeguse tasakaalu põhjuseks pidada asjaolu, et bakteriofaagid on spetsialiseerunud oma nakkuslikule toimele. Kui see on olemas suur koloonia bakterid, kus oma ohvrid leiavad järgmised faagipõlved, siis toimub bakterite hävitamine lüütiliste (tapmise, sõna otseses mõttes - lahustavate) faagide abil kiiresti ja pidevalt.

Kui potentsiaalseid ohvreid ei ole piisavalt või välistingimused pole faagide efektiivseks paljunemiseks eriti sobivad, siis saavad eelise lüsogeense arengutsükliga faagid. Sel juhul ei käivita see pärast faagi DNA viimist bakterisse kohe nakkuse mehhanismi, vaid esialgu eksisteerib see raku sees passiivses olekus, tungides sageli bakteri genoomi.

Sellises profaagi seisundis võib viirus eksisteerida pikka aega, läbides raku jagunemise tsüklid koos bakteri kromosoomiga. Ja alles siis, kui bakter satub paljunemiseks soodsasse keskkonda, aktiveerub infektsiooni lüütiline tsükkel. Samal ajal, kui faagi DNA vabaneb bakterikromosoomist, püütakse sageli kinni bakterigenoomi naaberpiirkonnad, mille sisu saab hiljem üle kanda järgmisele bakterile, mille bakteriofaag nakatab. Seda protsessi (geeniülekannet) käsitletakse kõige olulisem vahend info ülekanne prokarüootide – rakutuumadeta organismide vahel.

Kuidas bakteriofaag töötab

Kõiki neid molekulaarseid peensusi ei tuntud 20. sajandi teisel kümnendil, kui avastati "nähtamatud nakkusetekitajad, mis hävitavad baktereid". Kuid isegi ilma elektronmikroskoobita, mida kasutati esimest korda 1940. aastate lõpus bakteriofaagide kujutiste saamiseks, oli selge, et need on võimelised hävitama baktereid, sealhulgas patogeene. Seda vara nõudis kohe ka meditsiin.

Esimesed katsed ravida faagidega düsenteeriat, haavapõletikke, koolerat, tüüfust ja isegi katku tehti üsna hoolikalt ning edu näis üsna veenev. Kuid pärast masstootmise algust ja faagipreparaatide kasutamist muutus eufooria pettumuseks. Väga vähe teati, mis on bakteriofaagid, kuidas toota, puhastada ja kasutada nende ravimvorme. Piisab, kui öelda, et Ameerika Ühendriikides 1920. aastate lõpus tehtud testi tulemuste kohaselt ei leitud paljudes tööstuslikes faagipreparaatides tõelisi bakteriofaage.

Probleem antibiootikumidega

Kahekümnenda sajandi teist poolt võib meditsiinis nimetada "antibiootikumide ajastuks". Penitsilliini avastaja Alexander Fleming hoiatas aga oma Nobeli loengus, et mikroobide resistentsus penitsilliini suhtes tekib üsna kiiresti. Praeguseks on antibiootikumiresistentsust kompenseerinud uut tüüpi antimikroobsete ravimite väljatöötamine. Kuid alates 1990. aastatest on saanud selgeks, et inimkond on kaotamas võidurelvastumist mikroobide vastu.

Esiteks on süüdi antibiootikumide kontrollimatu kasutamine mitte ainult meditsiinis, vaid ka meditsiinis ennetuslikel eesmärkidel, ja mitte ainult meditsiinis, vaid ka põllumajanduses, toiduainetööstuses ja igapäevaelus. Selle tulemusena hakkas nende ravimite suhtes resistentsus arenema mitte ainult patogeensetes bakterites, vaid ka kõige tavalisemates mullas ja vees elavates mikroorganismides, muutes need "tingimuslikeks patogeenideks".

Need bakterid vohavad raviasutused, asustada torustikku, mööblit, meditsiinitehnikat, mõnikord isegi desinfitseerivaid lahuseid. Nõrgenenud immuunsüsteemiga inimestel, keda haiglates on enamus, põhjustavad need tõsiseid tüsistusi.

Pole ime, et meditsiiniringkond lööb häirekella. 2012. aastal tegi WHO peadirektor Margaret Chan avalduse, milles ennustas antibiootikumide ajastu lõppu ja inimkonna kaitsetust nakkushaiguste vastu. Kuid, praktilisi võimalusi Kombinatoorne keemia – farmakoloogiateaduse alused – pole kaugeltki ammendatud. Teine asi on see, et areng antimikroobsed ained- väga kallis protsess, mis ei too sellist kasumit kui paljud teised ravimid. Seega on hirmujutud “superbugidest” pigem hoiatus, mis julgustab inimesi otsima alternatiivseid lahendusi.

Bakteriofaagid ja immuunsus

Kuna looduses leidub lugematul hulgal bakteriofaage ja need satuvad inimkehasse pidevalt koos vee, õhu ja toiduga, siis immuunsüsteem lihtsalt ignoreerib neid. On isegi hüpotees bakteriofaagide sümbioosi kohta soolestikus, mis reguleerib soolestiku mikrofloorat. Mingit tüüpi immuunreaktsiooni on võimalik saavutada ainult pikaajalise manustamise korral kehasse. suured annused faagid.

Kuid sel viisil võite saavutada allergia peaaegu iga aine suhtes. Lõpuks on väga oluline, et bakteriofaagid oleksid odavad. Täpselt valitud täielikult dekodeeritud genoomidega bakteriofaagidest koosneva ravimi väljatöötamine ja tootmine, mida kasvatatakse vastavalt kaasaegsetele biotehnoloogilistele standarditele teatud bakteritüvedel keemiliselt puhtas söötmes ja kõrgelt puhastatud, on suurusjärgus odavam kui tänapäevased kompleksantibiootikumid.

See võimaldab kiiresti kohandada faagi terapeutilisi preparaate muutuvate patogeensete bakterite komplektidega ja kasutada bakteriofaage veterinaarmeditsiinis, kus kallid ravimid ei ole majanduslikult põhjendatud.

Meditsiiniteenistuses

Tundub loogiline, et huvi bakteriofaagide, bakterite looduslike vaenlaste kasutamise vastu infektsioonide ravis on taastunud. Tõepoolest, "antibiootikumide ajastu" aastakümnete jooksul teenisid bakteriofaagid aktiivselt teadust, mitte meditsiini, vaid fundamentaalset molekulaarbioloogiat. Piisab, kui mainida geneetilise koodi "kolmikute" dekodeerimist ja DNA rekombinatsiooni protsessi. Praegu on bakteriofaagide kohta piisavalt teada, et mõistlikult valida terapeutilistel eesmärkidel sobivad faagid.

Bakteriofaagidel on potentsiaalsete ravimitena palju eeliseid. Esiteks on neid lugematu arv. Kuigi ka bakteriofaagi geneetilise aparaadi muutmine on palju lihtsam kui bakteri oma, ja veelgi enam kõrgemad organismid, See pole vajalik. Loodusest leiab alati midagi sobivat. See on pigem vajalike bakteriofaagide valik, soovitud omaduste fikseerimine ja paljundamine.

Seda võib võrrelda koeratõugude aretusega - kelgutamine, valvur, jaht, hagijad, võitlus, dekoratiiv ... Kõik nad jäävad koerteks, kuid on optimeeritud teatud tüüpi tegevuseks, inimesele vajalik. Teiseks on bakteriofaagid rangelt spetsiifilised, see tähendab, et nad hävitavad ainult teatud tüüpi mikroobe, inhibeerimata normaalne mikrofloora isik.

Kolmandaks, kui bakteriofaag leiab bakteri, mille ta peab hävitama, hakkab see oma elutsükli jooksul paljunema. Seega ei muutu annustamise küsimus nii teravaks. Neljandaks ei põhjusta bakteriofaagid kõrvaltoimeid. Kõik allergiliste reaktsioonide juhtumid terapeutiliste bakteriofaagide kasutamisel olid põhjustatud kas lisanditest, millest ravim ei olnud piisavalt puhastatud, või bakterite massilise surma käigus vabanenud toksiinidest. Viimast nähtust, "Herxheimeri efekti", täheldatakse sageli antibiootikumide kasutamisel.

Mündi kaks külge

Kahjuks on meditsiinilistel bakteriofaagidel ka palju puudusi. Kõige olulisem probleem tuleneb faagide kõrge spetsiifilisuse eelisest. Iga bakteriofaag nakatab rangelt määratletud bakteritüüpi, isegi mitte taksonoomilist liiki, vaid mitmeid kitsamaid sorte, tüvesid. Suhteliselt öeldes nagu valvekoer ta hakkas haukuma vaid kahemeetriste mustadesse vihmamantlitesse riietatud pättide peale ega reageerinud üldse lühikestes pükstes teismelise majja ronimisele.

Seetõttu ei ole praeguste faagipreparaatide puhul ebatõhusa kasutamise juhud haruldased. Teatud tüvede vastu valmistatud ja Smolenskis streptokokist põhjustatud tonsilliidi suurepäraselt raviv ravim võib Kemerovos olla jõuetu kõigi sama tonsilliidi nähtude vastu. Haigus on sama, põhjustatud sama mikroobi poolt ja streptokoki tüved erinevates piirkondades on erinevad.

Bakteriofaagi kõige tõhusamaks kasutamiseks on vajalik täpne diagnostika. patogeenne mikroob, kuni pingeni. Praegu kõige levinum diagnostiline meetod – külvi pookimine – võtab palju aega ega taga vajalikku täpsust. Kiired meetodid – tüpiseerimine polümeraasi ahelreaktsiooni või massispektromeetria abil – võetakse aeglaselt kasutusele seadmete kõrge hinna ja kõrgemate laborantide kvalifikatsiooninõuete tõttu. Ideaalis faagikomponentide valik ravimtoode saab teha iga üksiku patsiendi nakatumise vastu, kuid see on kallis ja praktikas vastuvõetamatu.

Teine faagide oluline puudus on nende bioloogiline olemus. Lisaks sellele, et bakteriofaagid nõuavad eritingimused ladustamine ja transportimine, avab selline ravimeetod palju spekulatsioone teemal "võõr-DNA inimeses". Ja kuigi on teada, et bakteriofaag ei ​​saa põhimõtteliselt inimrakku nakatada ja oma DNA-d sinna viia, pole avalikku arvamust lihtne muuta.

Bioloogilisest olemusest ja üsna suurest, võrreldes madala molekulmassiga ravimitega (sama antibiootikumidega), järgib suurus kolmandat piirangut - bakteriofaagi kehasse viimise probleemi. Kui tekib mikroobne infektsioon, kus bakteriofaagi saab manustada otse tilkade, pihusti või klistiiri kujul – nahale, lahtistele haavadele, põletushaavadele, ninaneelu limaskestadele, kõrvadele, silmadele, jämesoolele –, siis probleeme pole.

Aga kui infektsioon tekib siseorganites, on olukord keerulisem. On teada neeru- või põrnainfektsioonide eduka ravi juhtumeid bakteriofaagipreparaadi tavapärase suukaudse manustamisega. Suhteliselt suurte (100 nm) faagiosakeste maost vereringesse ja siseorganitesse tungimise mehhanism on aga halvasti mõistetav ja on patsienditi väga erinev. Bakteriofaagid on võimetud ka nende mikroobide vastu, mis arenevad rakkude sees, nagu tuberkuloos ja pidalitõbi. Läbi seina inimese rakk bakteriofaag ei ​​pääse läbi.

Tuleb märkida, et bakteriofaagide ja antibiootikumide kasutamise vastu meditsiinilistel eesmärkidelära tee seda. Nende ühise tegevusega täheldatakse antibakteriaalse toime vastastikust tugevnemist. See võimaldab näiteks vähendada antibiootikumide annuseid väärtusteni, mis ei põhjusta väljendunud kõrvaltoimeid. Sellest tulenevalt on bakterite resistentsuse tekke mehhanism kombineeritud ravimi mõlema komponendi suhtes peaaegu võimatu.

Antimikroobsete ravimite arsenali laienemine annab rohkem vabadusastmeid ravimeetodite valikul. Seega on bakteriofaagide kasutamise kontseptsiooni teaduslikult põhjendatud arendamine antimikroobses ravis paljutõotav suund. Bakteriofaagid ei toimi mitte niivõrd alternatiivina, kuivõrd täiendusena ja tõhustajana võitluses infektsioonide vastu.

CM. ZAKHARENKO, meditsiiniteaduste kandidaat, dotsent, sõjaline meditsiiniakadeemia neid. CM. Kirov, Peterburi

Bakteriofaagid on unikaalsed mikroorganismid, mille põhjal on nende omaduste ja omaduste poolest loodud spetsiaalne rühm ravi- ja profülaktilisi preparaate. Faagide ja bakterite vahelise koostoime loomulikud füsioloogilised mehhanismid, mis on nende toime aluseks, võimaldavad ennustada mõlema bakteriofaagi enda ja nende võimalike kasutusviiside lõpmatut mitmekesisust. Bakteriofaagide kollektsioonide laienedes ilmnevad kahtlemata uued sihtpatogeenid ning laieneb haiguste hulk, mille puhul faage saab kasutada nii monoteraapiana kui ka kompleksravi osana.

Seega võimaldas polüvalentse püobakteriofaagi Sextaphage kasutamine nakatunud pankrease nekroosi ravis (akadeemik E. A. Wagneri nimeline Permi osariigi meditsiiniakadeemia) kiiresti taastada homöostaasi peamised parameetrid ning patsientide elundite ja süsteemide funktsioonid. Samuti on märgatavalt vähenenud arv operatsioonijärgsed tüsistused Ja surmad: standardravi saanud patsientide rühmas oli suremus 100%, samas kui BF-ga ravitud trupis - 16,6%.

BF-i preparaatide kahjutuse ja reaktogeensuse tõttu on neid võimalik kasutada pediaatrilises praktikas, sealhulgas vastsündinutel. Huvitav on Nižni Novgorodi laste piirkondliku kliinilise haigla kogemus, kus epidemioloogilise olukorra tüsistuste perioodil kasutati koos tavaliste epideemiavastaste meetmetega BP - Intesti-bakteriofaagi ja BP Pseucfomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa nosokomiaalse infektsiooni esinemissageduse 11-kordne vähenemine näitas BP kasutamise kõrget efektiivsust. BF-i preparaate võib välja kirjutada nii düsbakterioosi ja seedesüsteemi häirete raviks kui ka seedetrakti limaskestade koloniseerimise vältimiseks oportunistlike bakterite poolt. BF-i mitmekomponentsed preparaadid sobivad ideaalselt esimeste seedetrakti häirete sümptomite koheseks leevendamiseks.

Tänaseks on ettevõte välja toonud mitmeid prioriteetseid valdkondi terapeutiliste ja profülaktiliste bakteriofaagide arendamiseks ja tootmiseks, mis on korrelatsioonis äsja esilekerkivate globaalsete suundumustega. Luuakse ja juurutatakse uusi preparaate: välja on töötatud hammaste ja enterobakterite vastane BF, käimas on Helicobacter pylori vastase faagipreparaadi loomine.

Ainult üks nende ravimite tootja - NPO Microgen - toodab teaduse ja innovaatilise arengu osakonna juhataja asetäitja Alla Lobastova aruande kohaselt aastas üle 2 miljoni pakendi. Kahjuks pole paljude arstide ideed bakteriofaagide kohta kaugeltki objektiivsed. Vähesed inimesed teavad, et sama patogeeni vastu aktiivsed bakteriofaagid võivad kuuluda erinevatesse perekondadesse, olla erineva elutsükliga jne. Näiteks P. aeruginosa bakteriofaagid kuuluvad perekondadesse Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, elutsüklilised või mõõdukad. Sama patogeeni erinevatel tüvedel võib olla erinev tundlikkus bakteriofaagide suhtes. Enamik eksperte teab (kuulnud, keegi kasutas) vedeliku ja tableti olemasolust annustamisvorm bakteriofaagide terapeutilised ja profülaktilised preparaadid. Kuid nende valik on palju laiem, mida võib seostada tingimusteta eelistega, eriti kombinatsioonis mitmesuguste manustamisviisidega (suukaudne manustamine, klistiirid, aplikatsioonid, haavade ja limaskestade niisutamine, haavaõõnsustesse viimine jne). Bakteriofaagide ilmsed eelised hõlmavad traditsiooniliselt spetsiifilist toimet üsna piiratud bakterite populatsioonile, piiratud aja olemasolu (kuni mikroorganismide sihtpopulatsioon kaob), selliste kõrvaltoimete puudumist nagu toksilised ja allergilised reaktsioonid, düsbiootilised reaktsioonid jne Neid ravimeid saab kasutada mitmesuguste vanuserühmad ja raseduse ajal. Bakteriofaagid ise ei ole olulised allergeenid. Bakteriofaagipreparaatide talumatuse juhud on enamasti seotud reaktsiooniga toitainekeskkonna komponentidele. Kõik selle ravimirühma suuremad tootjad püüdlevad kasutatavate komponentide maksimaalse kvaliteedi poole, mis vähendab selliste reaktsioonide tõenäosust. Kasvava antibiootikumiresistentsuse kontekstis soovitavad mõned autorid kaaluda bakteriofaage kui antibiootikumide parimat alternatiivi. Bakteriofaagide terapeutilised ja profülaktilised preparaadid on spetsiaalselt valitud kombinatsioonide kokteil (polüklonaalsete kõrge virulentsete bakteriviiruste kompleks, mis on spetsiaalselt valitud bakteriaalsete infektsioonide levinumate patogeenide rühmade vastu), mis põhineb tootja faagikollektsioonidel. Föderaalse riikliku ühtse ettevõtte NPO Microgen filiaalid Ufas, Permis ja Nižni Novgorodis on selliste ravimite kaasaegsed tootmiskeskused. Võimalus luua kohandatud patogeensed mikroorganismid Bakteriofaagide terapeutilised ja profülaktilised preparaadid on selle preparaatide rühma teine ​​suur eelis. Bakterite resistentsuse kasv antimikroobsete ravimite suhtes ja tänapäevaste nakkushaiguste sageli esinev polüetioloogia nõuavad kombineeritud antibiootikumravi (kaks, kolm ja mõnikord rohkem antimikroobsed ained). Tõhusa antibiootikumravi režiimi valimiseks tuleb lisaks bakterite tegelikule tundlikkusele ravimi suhtes arvestada ka üsna paljude teguritega. Faagiteraapial on selles osas ka teatud eelised. Ühest küljest ei kaasne bakteriofaagide kombinatsiooni kasutamisega nende omavaheline koostoime ja see ei too kaasa muutusi nende kasutusskeemides. Olemasolevas terapeutiliste bakteriofaagide komplektis on mitmeid hästi tõestatud kombinatsioone - bakteriofaag coliproteus, püobakteriofaag polüvalentne, intesti-bakteriofaag. Teisest küljest ei ole bakteritel antibiootikumide ja faagide suhtes ühiseid resistentsuse mehhanisme, seetõttu saab neid kasutada nii siis, kui patogeen on ühe ravimi suhtes resistentne, kui ka kombinatsioonis "antibiootikum + bakteriofaag". See kombinatsioon on eriti tõhus mikroobide biokilede hävitamiseks. Katse näitas veenvalt, et raua antagonistide ja bakteriofaagi kombineeritud kasutamine võib häirida Klebsiella pneumoniae biokilede teket. Samal ajal märgitakse nii mikroobipopulatsioonide arvu olulist vähenemist kui ka "noorte" rakkude arvu vähenemist. Üks veel oluline omadus Bakteriofaagide toime on selline nähtus nagu apoptoosi esilekutsumine. Mõnel E. coli tüvel on geenid, mis põhjustavad rakusurma pärast T4 bakteriofaagi sisestamist. Seega, vastuseks T4 faagi hiliste geenide ekspressioonile blokeerib lit geen (kodeerib proteaasi, mis hävitab valgusünteesiks vajaliku EF-Tu elongatsioonifaktori) kõigi rakuvalkude sünteesi. PrrC geen kodeerib nukleaasi, mis lõikab lüsiini tRNA-d. Nukleaasi aktiveerib T4 faagi stp geeni saadus. T4-faagiga nakatunud rakkudes põhjustavad rex-geenid (mis kuuluvad faagi genoomi ja ekspresseeritakse lüsogeensetes rakkudes) ioonikanalite moodustumist, mis viib rakkude poolt elutähtsate ioonide kadumiseni ja seejärel surmani. T4 faag ise võib takistada rakusurma, sulgedes kanalid oma valkude, rII geenide produktidega. Bakterite resistentsuse kujunemisel antibiootikumi suhtes tuleb otsida uusi võimalusi aktiivse molekuli või põhimõtteliselt uute ainete muutmiseks. Kahjuks on viimastel aastatel uute antibiootikumide kasutuselevõtu tempo oluliselt aeglustunud. Bakteriofaagidega on olukord põhimõtteliselt erinev. Suurte tootjate kollektsioonides on kümneid valmis bakteriofaagi tüvesid ning neid täiendatakse pidevalt uute aktiivsete faagidega. Tänu isoleeritud patogeenide bakteriofaagide suhtes tundlikkuse pidevale jälgimisele kohandavad tootjad piirkondadesse tarnitavaid faagikompositsioone. Tänu kohandatud bakteriofaagidele on võimalik kõrvaldada antibiootikumiresistentsete tüvede põhjustatud haiglanakkuste puhanguid.

Suukaudsel manustamisel jõuavad bakteriofaagid kiiresti nakkuse lokaliseerimise koldesse: mäda-põletikuliste haigustega patsientidel satuvad faagid verre tunni aja pärast, 1–1,5 tunni pärast tuvastatakse need bronhopulmonaalsest eksudaadist ja põletushaavade pinnalt. , 2 tunni pärast - uriinist, samuti kraniotserebraalsete vigastustega patsientide tserebrospinaalvedelikust.

Seega on bakteriofaagid unikaalsed mikroorganismid, mille põhjal on nende omaduste ja omaduste poolest loodud spetsiaalne ravi- ja profülaktiliste preparaatide rühm. Faagide ja bakterite vahelise koostoime loomulikud füsioloogilised mehhanismid, mis on nende toime aluseks, võimaldavad ennustada mõlema bakteriofaagi enda ja nende võimalike kasutusviiside lõpmatut mitmekesisust. Bakteriofaagide kollektsioonide laienedes ilmnevad kahtlemata uued sihtpatogeenid ning laieneb haiguste hulk, mille puhul faage saab kasutada nii monoteraapiana kui ka kompleksravi osana. Kaasaegne nägemus faagiteraapia edasisest saatusest peaks põhinema nii nende tegevuse kõrgel spetsiifilisusel kui ka vajadusel järgida rangelt kõiki faagiteraapia reegleid. Bakteriofaagide vastandamine mis tahes etiotroopse ravi vahenditega on ekslik.

Esimest korda tehti oletus, et bakteriofaagid on viirused. D. Errel. Tulevikus avastati seente viirused jne, neid hakati kutsuma faagideks.

Faagi morfoloogia.

Suurused - 20-200nm. Enamik faage on kulleste kujuga. Kõige keerulisemad faagid koosnevad nukleiinhapet sisaldavast mitmetahulisest peast, kaelast ja protsessidest. Protsessi lõpus on basaalplaat, millest ulatuvad filamendid ja hambad. Need niidid ja hambad kinnitavad faagi bakterikesta külge. Kõige keerulisemalt organiseeritud faagid protsessi distaalses osas sisaldavad ensüümi - lüsosüüm. See ensüüm aitab kaasa bakterimembraani lahustumisele faagi NK tungimisel tsütoplasmasse. Paljudes faagides on protsessi ümbritsetud kestaga, mis mõnes faagis võib kokku tõmbuda.

Seal on 5 morfoloogilist rühma

1. Pika protsessiga ja kokkutõmbuva kestaga bakteriofaagid
2. Pika protsessiga, kuid mitte kokkutõmbuva kestaga faagid
3. Lühikese sabaga faagid
4. Faagid protsessi analoogiga
5. Filamentsed faagid

Keemiline koostis.

Faagid koosnevad nukleiinhapetest ja valkudest. Enamik neist sisaldab 2-ahelalist DNA-d, mis on suletud rõngasse. Mõned faagid sisaldavad ühte DNA või RNA ahelat.

Faagi kest - kapsiid, koosneb järjestatud valgu alaühikutest – kapsomeeridest.

Kõige keerulisemalt organiseeritud faagid protsessi distaalses osas sisaldavad ensüümi - lüsosüüm. See ensüüm aitab kaasa bakterimembraani lahustumisele faagi NK tungimisel tsütoplasmasse.

Faagid taluvad hästi külmumist, kuumutamist kuni 70 kraadini ja kuivatamist. Tundlik hapete, UV-kiirguse ja keemise suhtes. Faagid nakatavad rangelt määratletud baktereid, toimides spetsiifiliste rakuretseptoritega.

Vastavalt interaktsiooni spetsiifilisusele -

Polüfaagid – suhtlevad mitmete sugulasbakteriliikidega

Monofaagid – liigifaagid – suhtlevad ühte tüüpi bakteritega

Tüüpfaagid – interakteeruvad liigisisese bakterite üksikute variantidega.

Tüüpiliste faagide toime järgi võib liigid jagada faagi rida. Faagide interaktsioon bakteritega võib toimuda produktiivne, produktiivne ja integreeriv tüüp.

produktiivne tüüp- moodustuvad faagi järglased ja rakk lüüsitakse

Koos produktiivsega- rakk eksisteerib edasi, interaktsiooniprotsess katkeb algstaadiumis

Integreeriv tüüp- faagi genoom integreerub bakterikromosoomi ja eksisteerib sellega koos.

Sõltuvalt interaktsiooni tüübist on olemas virulentsed ja parasvöötme faagid.

Virulentne suhelda bakteritega produktiivselt. Alguses imendub faag spetsiifiliste retseptorite koostoime tõttu bakterimembraanile. Viiruse nukleiinhape tungib või tungib bakterite tsütoplasmasse. Lüsosüümi toimel tekib bakteri kesta väike auk, faagi kest väheneb ja NK süstitakse. Faagi kest väljaspool bakterit. Järgmine on varajaste valkude süntees. Nad tagavad faagi struktuurvalkude sünteesi, faagi nukleiinhappe replikatsiooni ja bakterikromosoomide aktiivsuse represseerimise.

Sellele järgneb faagide struktuurikomponentide süntees ja nukleiinhappe replikatsioon. Nendest elementidest pannakse kokku uue põlvkonna faagiosakesed. Koostumist nimetatakse morfogeneesiks, uued osakesed, millest ühes bakteris võib tekkida 10-100. Bakteri edasine lüüs ja uue põlvkonna faagide vabastamine väliskeskkonda.

parasvöötme bakteriofaagid suhelda kas produktiivselt või integratiivselt. Tootmistsükkel kulgeb samamoodi. Integratiivse interaktsiooni korral integreerub parasvöötme faagi DNA pärast tsütoplasmasse sisenemist teatud piirkonnas kromosoomi ja rakkude jagunemise ajal replitseerub see sünkroonselt bakteri DNA-ga ja need struktuurid kanduvad edasi. tütarrakud. Selline sisseehitatud faagi DNA - profaag, ja profaagi sisaldavat bakterit nimetatakse lüsogeenseks ja nähtust nimetatakse lüsogenees.

Spontaanselt või mõne seriaali mõjul välised tegurid kromosoomist saab välja lõigata profaagi, st. liikuda vabasse olekusse, avaldada virulentse faagi omadusi, mis viib uue põlvkonna bakterikehade moodustumiseni - profaagi induktsioon.

Bakteriaalne lüsogenees on faagi (lüsogeense) muundamise aluseks. Seda mõistetakse kui muutust lüsogeensete bakterite tunnustes või omadustes võrreldes sama liigi mittelüsogeensete bakteritega. Muutuda võivad erinevad omadused – morfoloogilised, antigeensed jne.

Parasvöötme faagid võivad olla defektsed – ei suuda moodustada faagi järglasi väljaspool looduslikke tingimusi ja induktsiooni käigus.

Virion – terviklik viirusosake, mis koosneb NK-st ja valgukestast

Faagide praktiline kasutamine -

1. Rakendus diagnostikas. Seoses mitmete bakteriliikidega kasutatakse faagide lagunemisreaktsioonis monofaage, mis on üks bakterikultuuri identifitseerimise kriteeriumidest, tüüpilisi faage kasutatakse faagide tüpiseerimiseks, bakterite spetsiifiliseks diferentseerimiseks. Viiakse läbi epidemioloogilistel eesmärkidel, et teha kindlaks nakkusallikas ja kõrvaldamise viisid
2. Mitmete bakteriaalsete infektsioonide - kõhu tüüpi, stafülokoki ja streptokoki infektsioonide raviks ja ennetamiseks (happekindlad tabletid)
3. Parasvöötme bakteriofaage kasutatakse geenitehnoloogias vektorina, mis on võimeline viima elusrakku geneetilist materjali.

Bakterite geneetika

Bakteri genoom koosneb geneetilistest elementidest, mis on võimelised ise paljunema - replikonid. Replikonid on bakterite kromosoomid ja plasmiidid. Bakteri kromosoom moodustab nukleoidi, mis ei ole seotud valkudega suletud ringis ja kannab haploidset geenikomplekti.

Plasmiidid on samuti DNA molekuli suletud ring, kuid palju väiksemad kui kromosoom. Plasmiidide olemasolu bakterite tsütoplasmas ei ole vajalik, kuid need annavad eelise keskkond. Suured plasmiidid redutseeritakse koos kromosoomiga ja nende arv rakus on väike. Ja väikeste plasmiidide arv võib ulatuda mitmekümneni. Mõned plasmiidid on võimelised pöörduvalt integreeruma teatud piirkonna bakterikromosoomi ja toimima ühe replikonina. Selliseid plasmiide ​​nimetatakse integreerivateks. Mõned plasmiidid on võimelised kanduma ühest bakterist teise otsekontakti teel – konjugatiivsed plasmiidid. Need sisaldavad geene, mis vastutavad F-pillide moodustumise eest, mis moodustavad konjugatiivse silla geneetilise materjali ülekandeks.

Peamised plasmiidide tüübid on

F - integreeriv kongatiivne plasmiid. Soofaktor määrab bakterite võime olla konjugatsiooni ajal doonoriks

R - plasmiidid. Vastupidav. Sisaldab geene, mis määravad antibakteriaalseid ravimeid hävitavate tegurite sünteesi. Selliseid plasmiide ​​omavad bakterid ei ole paljude ravimite suhtes tundlikud. Seetõttu moodustub ravimiresistentne tegur.

Plasmiidtoks – patogeensuse määravad tegurid –

Ent - plasmiid - sisaldab enterotoksiinide tootmise geeni.

Hly - hävitada erütrotsüüdid.

mobiilsed geneetilised elemendid. Nende hulka kuuluvad lisad - sisestuselemendid. Üldtunnustatud nimetus on Is. Need on DNA lõigud, mis võivad liikuda nii replikonis kui ka nende vahel. Need sisaldavad ainult nende enda liikumiseks vajalikke geene.

transposoonid- suuremad struktuurid, millel on samad omadused nagu Is, kuid lisaks sisaldavad nad struktuurgeene, mis määravad bioloogiliste ainete, näiteks toksiinide sünteesi. Ülekantavad geneetilised elemendid võivad bakteripopulatsioonis põhjustada geenide inaktiveerumist, geneetilise materjali kahjustusi, replikoni sulandumist ja geenide proliferatsiooni.

bakterite varieeruvus.

Kõik varieeruvuse tüübid jagunevad 2 rühma - mittepärilik (fenotüüpne, modifikatsioon) ja pärilik (genotüüpne).

Modifikatsioonid– tunnuste või omaduste fenotüübilised mittepärilikud muutused. Modifikatsioonid ei mõjuta genotüüpi ja seetõttu ei ole need päritud. Need on kohanemisreaktsioonid teatud keskkonnatingimuste muutustele. Reeglina kaovad need esimeses põlvkonnas pärast teguri lõppemist.

Genotüübi varieeruvus mõjutab organismi genotüüpi ja on seetõttu võimeline kanduda järglastele. Genotüübi varieeruvus jaguneb mutatsioonideks ja rekombinatsioonideks.

Mutatsioonid- püsivad, päritud muutused organismi omadustes või omadustes. Mutatsioonide aluseks on kvalitatiivne või kvantitatiivne muutus nukleotiidide järjestus DNA molekulis. Mutatsioonid võivad muuta peaaegu kõiki omadusi.

Päritolu järgi on mutatsioonid spontaansed ja indutseeritud.

Spontaansed mutatsioonid esineb organismi eksisteerimise looduslikes tingimustes ja indekseeritud tekivad mutageense faktori suunatud toime tulemusena. Vastavalt DNA primaarstruktuuri muutuste olemusele bakterites eristatakse geeni- või punktmutatsioone ja kromosoomaberratsioone.

Geenimutatsioonid esinevad ühes geenis ja hõivavad minimaalselt ühte nukleotiidi. Seda tüüpi mutatsioon võib tuleneda ühe nukleotiidi asendamisest teisega, nukleotiidi kadumisest või täiendava sisestamisest.

Kromosomaalne- võib mõjutada mitut kromosoomi.

Võib esineda deletsioon - kromosoomi segmendi kadu, dubleerimine - kromosoomi segmendi kahekordistumine. Kromosoomi segmendi 180-kraadine pööramine on inversioon.

Igasugune mutatsioon toimub teatud mutageense faktori mõjul. Oma olemuselt on mutageenid füüsikalised, keemilised ja bioloogilised. ioniseeriv kiirgus, röntgenikiirgus, UV-kiired. Keemiliste mutageenide jaoks - analoogid lämmastikku sisaldavad alused, dilämmastikhape ise ja isegi mõned ravimid, tsütostaatikumid. Bioloogilistele - mõned viirused ja transfatsoonid

Rekombinatsioon- kromosoomide osade vahetus

Transduktsioon – geneetilise materjali ülekanne bakteriofaagi poolt

Geneetilise materjali parandamine - mutatsioonidest tulenevate kahjustuste taastamine.

Parandusi on mitut tüüpi

1. Fotoreaktiveerimine - seda protsessi tagab spetsiaalne ensüüm, mis aktiveeritakse juuresolekul nähtav valgus. See ensüüm liigub mööda DNA ahelat ja parandab kahjustusi. Ühendab tüümereid, mis tekivad UV-kiirguse toimel. Pimeda heastamise tulemused on märkimisväärsemad. See ei sõltu valgusest ja seda pakuvad mitmed ensüümid – esiteks lõikavad nukleaasid välja DNA ahela kahjustatud lõigu, seejärel sünteesib DNA polümeraas allesjäänud komplementaarse ahela maatriksile plaastri ja ligaasid õmblevad plaastri kahjustatud piirkonda. .

Geenimutatsioonid paranevad, kuid kromosomaalsed mutatsioonid reeglina mitte.

1. Geneetiline rekombinatsioon bakterites. Iseloomustab doonorbakteri geneetilise materjali tungimine retsipientbakterisse koos mõlema algse isendi geene sisaldava tütargenoomi moodustumisega.

Doonori DNA fragmendi kaasamine retsipiendisse toimub ristumise teel

Kolm tüüpi ülekandeid -

1. Muutumine– eraldatud doonor-DNA fragmendi ülekandmise protsess. Sõltub retsipiendi pädevusest ja doonor-DNA seisundist. Pädevus- võime absorbeerida DNA-d. See sõltub konkreetsete valkude olemasolust retsipiendi rakumembraanis ja moodustub teatud perioodid bakterite kasvu. Doonori DNA peab olema kaheahelaline ja mitte väga suure suurusega. Doonor-DNA tungib läbi bakterimembraani, üks ahelatest hävib, teine ​​integreerub retsipiendi DNA-sse.
2. transduktsioon- viiakse läbi bakteriofaagide abil. Üldtransduktsioon ja spetsiifiline transduktsioon.

kindral - tekib virulentsete tegurite osalusel. Osakeste faagide kokkupanemise ajal võib faagipea ekslikult sisaldada mitte faagi DNA-d, vaid osa bakterikromosoomist. Sellised faagid on defektsed faagid.

spetsiifiline- seda viivad läbi mõõdukad faagid. Väljalõikamisel toimub väljalõikamine rangelt mööda piiri.Need sisestatakse teatud geenide vahele ja kannavad need üle.

1. konjugatsioon- geneetilise materjali ülekandmine doonori bakterilt retsipiendile nende otsese kokkupuute korral. Vajalik seisukord- kongatiivse plasmiidi olemasolu doonorrakus. Pili tõttu konjugatsiooni käigus moodustub konjugatsioonisild, mille kaudu kantakse geneetiline materjal doonorilt patsiendile.

Geeni diagnostika

Meetodite kogum uuritavas materjalis oleva mikroorganismi või selle fragmendi genoomi tuvastamiseks. Esimesena pakuti välja NC-hübridisatsiooni meetod. Lähtudes komplementaarsuse põhimõttest. See meetod võimaldab molekulaarsete sondide abil tuvastada patogeeni marker-DNA fragmentide olemasolu geneetilises materjalis. Molekulaarsed sondid on lühikesed DNA ahelad, mis on markeri saidiga komplementaarsed. Sondi sisestatakse märgis - fluorokroom, radioaktiivne isotoop, ensüüm. Uuritav materjal läbib spetsiaalse töötluse, mis võimaldab hävitada mikroorganisme, vabastada DNA ja jagada selle üheahelalisteks fragmentideks. Pärast seda materjal fikseeritakse. Seejärel tuvastatakse märgistuse aktiivsus. See meetod ei ole eriti tundlik. Haigustekitajat on võimalik tuvastada vaid piisava arvukuse korral. 10 kuni 4 mikroorganismi. See on tehniliselt üsna keeruline ja nõuab suurt hulka sonde. Praktikas pole seda laialdaselt kasutatud. Oli projekteeritud uus meetod - polümeraas ahelreaktsioon- PCR.

See meetod põhineb DNA ja viiruse RNA võimel paljuneda, st. enesepaljundamiseks. Patsiendi olemus on korduv kopeerimine – antud mikroorganismi markeriks oleva DNA fragmendi in vitro amplifikatsioon. Kuna protsess toimub piisavalt kõrgetel temperatuuridel 70-90 °C, sai meetod võimalikuks pärast termostabiilse DNA polümeraasi eraldamist termofiilsetest bakteritest. Amplifikatsioonimehhanism on selline, et DNA ahelate kopeerimine ei alga mitte ühestki punktist, vaid ainult teatud lähteplokkidest, mille loomiseks kasutatakse nn praimereid. Praimerid on polünukleotiidjärjestused, mis on komplementaarsed soovitud DNA kopeeritud fragmendi lõppjärjestustega ja praimerid mitte ainult ei algata amplifikatsiooni, vaid ka piiravad. Nüüd on PCR-i jaoks mitu võimalust, iseloomulikud on 3 etappi -

1. DNA denatureerimine (eraldamine üheahelalisteks fragmentideks)
2. Krundi kinnitus.
3. DNA ahelate tasuta pikendamine 2 ahelaks

See tsükkel kestab 1,5-2 minutit. Selle tulemusena kahekordistub DNA molekulide arv 20-40 korda. Tulemuseks on 10 kuni 8. koopiate aste. Pärast võimendamist viiakse läbi elektroforees ja eraldatakse ribade kujul. Seda hoitakse sees spetsiaalne seade, mida nimetatakse võimendiks.

PCR eelised

1. Annab otseseid viiteid patogeeni olemasolule uuritavas materjalis, ilma puhaskultuuri eraldamata.
2. Väga kõrge tundlikkus. Teoreetiliselt võite leida 1.
3. Uurimismaterjali saab kohe pärast proovide võtmist desinfitseerida.
4. 100% spetsiifilisus
5. Kiired tulemused. Täielik analüüs- 4-5 tundi. Ekspress meetod.

Seda kasutatakse laialdaselt selliste nakkushaiguste diagnoosimiseks, mille tekitajateks on kasvatamata või raskesti kultiveeritavad organismid. Klamüüdia, mükoplasmad, paljud viirused - hepatiit, herpes. Siberi katku, tuberkuloosi määramiseks on välja töötatud katsesüsteemid.

Piirangute analüüs- ensüümide abil jagatakse DNA molekul teatud nukleoidide järjestuste järgi ja fragmente analüüsitakse nende koostise järgi. Nii saate leida ainulaadseid saite.

Biotehnoloogia ja geenitehnoloogia

Biotehnoloogia on teadus, mis põhineb elusorganismide elutähtsate protsesside uurimisel ja kasutab neid bioprotsesse, aga ka bioloogilisi objekte endid, inimestele vajalike toodete tööstuslikuks tootmiseks, selliste bioefektide taastootmiseks, mis ei avaldu organismis. ebaloomulikud tingimused. Bioloogiliste objektidena kasutatakse kõige sagedamini üherakulisi mikroorganisme, aga ka rakke, loomi ja taimi. Rakud paljunevad väga kiiresti, mis võimaldab lühikese ajaga suurendada tootja biomassi. Praegu biosüntees komplekssed ained, nagu valgud, antibiootikumid, on säästlikumad ja tehnoloogiliselt kättesaadavamad kui muud tüüpi toorained.

Biotehnoloogia kasutab sihtprodukti allikana rakke endid, aga ka raku poolt sünteesitud suuri molekule, ensüüme, toksiine, antikehi ning primaarseid ja sekundaarseid metaboliite – aminohappeid, vitamiine, hormoone. Mikroobse ja rakulise sünteesi produktide saamise tehnoloogia on taandatud mitmele tüüpilisele etapile - produktiivse peakorteri valik või loomine. Optimaalse toitekeskkonna valik, kasvatamine. Sihtprodukti eraldamine, selle puhastamine, standardimine, ravimvorm. Geenitehnoloogia taandub inimesele vajaliku sihttoote loomisele. Saadud sihtgeen liidetakse vektoriga ja vektor võib olla plasmiid ja sisestatud retsipiendi rakku. Retsipient - bakterid - Escherichia coli, pärm. Rekombinantide abil sünteesitud sihtproduktid eraldatakse, puhastatakse ja kasutatakse praktikas.

Esimesena loodi insuliin ja inimese interferoon. Erütropoetiin, kasvuhormoon, monoklonaalsed antikehad. B-hepatiidi vaktsiin.

Bakteriofaag gi või faagid (muu kreekakeelsest sõnast φᾰγω "ma õgin") on viirused, mis nakatavad valikuliselt bakterirakke. Kõige sagedamini paljunevad bakteriofaagid bakterite sees ja põhjustavad nende lüüsi. Bakteriofaag koosneb reeglina valgukestast ja üheahelalise või kaheahelalise nukleiinhappe (DNA või harvemini RNA) geneetilisest materjalist. Bakteriofaagide koguarv looduses on ligikaudu võrdne bakterite koguarvuga (1030 - 1032 osakest). Bakteriofaagid osalevad aktiivselt tsüklis keemilised ained ja energia, avaldavad märgatavat mõju mikroobide ja bakterite evolutsioonile Tüüpilise bakteriofaagi müoviiruse struktuur.

Bakteriofaagide struktuur 1 - pea, 2 - saba, 3 - nukleiinhape, 4 - kapsiid, 5 - "krae", 6 - sabavalgu kate, 7 - saba fibrill, 8 - naelu, 9 - basaalplaat

Bakteriofaagid erinevad keemilise struktuuri, nukleiinhappe tüübi, morfoloogia ja koostoime poolest bakteritega. Bakteriaalsed viirused on sadu ja tuhandeid kordi väiksemad kui mikroobirakud. Tüüpiline faagiosake (virion) koosneb peast ja sabast. Saba pikkus on tavaliselt 2-4 korda suurem pea läbimõõdust. Pea sisaldab geneetilist materjali – ühe- või kaheahelalist RNA-d või DNA-d, mille transkriptaasi ensüüm on inaktiivses olekus, ümbritsetud valgu või lipoproteiini kestaga – kapsiidiga, mis säilitab genoomi väljaspool rakku. Nukleiinhape ja kapsiid koos moodustavad nukleokapsiidi. Bakteriofaagidel võib olla ikosaeedriline kapsiid, mis on kokku pandud ühe või kahe spetsiifilise valgu mitmest koopiast. Tavaliselt koosnevad nurgad valgu pentameeridest ja kummagi külje tugi sama või sarnase valgu heksameeridest. Lisaks võivad faagid olla sfäärilise, sidrunikujulise või pleomorfse kujuga. Saba ehk protsess on valgutoru – pea valgukesta jätk, saba põhjas on ATPaas, mis regenereerib energiat geneetilise materjali süstimiseks. Samuti on bakteriofaagid lühikese protsessiga, ilma protsessita ja filamentsed.

Bakteriofaagide süstemaatika Suur hulk eraldatud ja uuritud bakteriofaage määrab nende süstematiseerimise vajaduse. Seda teeb Rahvusvaheline Viiruste Taksonoomia Komitee (ICTV). Praegu vastavalt Rahvusvaheline klassifikatsioon ja viiruste nomenklatuur, bakteriofaagid jagunevad sõltuvalt nukleiinhappe tüübist ja morfoloogiast. Hetkel eristatakse üheksateist perekonda. Neist ainult kaks on RNA-d sisaldavad ja ainult viis perekonda on ümbritsetud. DNA-d sisaldavate viiruste perekondadest on ainult kahel perekonnal üheahelalised genoomid. Üheksas DNA-d sisaldavas perekonnas esindab genoomi ringikujuline DNA, ülejäänud üheksas aga lineaarne. Üheksa perekonda on spetsiifilised ainult bakteritele, ülejäänud üheksa on spetsiifilised arheedele ja (Tectiviridae) nakatavad nii baktereid kui ka arhee.

Bakteriofaagi interaktsioon bakterirakkudega Vastavalt bakteriofaagi interaktsiooni olemusele bakterirakuga eristatakse virulentseid ja parasvöötme faage. Virulentsete faagide arv võib suureneda ainult lüütilise tsükli jooksul. Virulentse bakteriofaagi ja raku interaktsiooni protsess koosneb mitmest etapist: bakteriofaagi adsorptsioon rakule, tungimine rakku, faagikomponentide biosüntees ja nende kokkupanek ning bakteriofaagide väljumine rakust. Algselt kinnituvad bakteriofaagid faagispetsiifiliste retseptorite külge bakteriraku pinnal. Faagi saba lahustab selle otsas paiknevate ensüümide (peamiselt lüsosüümi) abil lokaalselt rakumembraani, tõmbub kokku ja peas sisalduv DNA süstitakse rakku, bakteriofaagi valkjas kest jääb aga väljapoole. . Süstitud DNA põhjustab raku metabolismi täieliku ümberstruktureerimise: bakteriaalse DNA, RNA ja valkude süntees peatub. Bakteriofaagi DNA hakkab transkribeerima omaenda transkriptaasi ensüümi abil, mis pärast bakterirakku sisenemist aktiveerub. Sünteesiti esmalt varakult, seejärel hilja ja. RNA, mis siseneb peremeesraku ribosoomidesse, kus sünteesitakse varased (DNA polümeraasid, nukleaasid) ja hilised (kapsiidi- ja sabavalgud, lüsosüüm, ATPaas ja transkriptaasi ensüümid) bakteriofaagi valgud. Bakteriofaagi DNA replikatsioon toimub poolkonservatiivse mehhanismi järgi ja see viiakse läbi oma DNA polümeraaside osalusel. Pärast hiliste valkude sünteesi ja DNA replikatsiooni lõppemist toimub viimane protsess - faagiosakeste küpsemine või faagi DNA kombineerimine ümbrisvalguga ja küpsete nakkusohtlike faagiosakeste moodustumine.

Eluring Mõõdukatel ja virulentsetel bakteriofaagidel on bakterirakuga interaktsiooni algfaasis sama tsükkel. Bakteriofaagide adsorptsioon faagispetsiifilistel rakuretseptoritel. Faagi nukleiinhappe süstimine peremeesrakku. Faagide ja bakteriaalsete nukleiinhapete koosreplikatsioon. Raku pooldumine. Lisaks võib bakteriofaag areneda kahe mudeli järgi: lüsogeensel või lüütilisel teel. Parasvöötme bakteriofaagid on pärast jagunemist profaasis (lüsogeenne rada) Virulentsed bakteriofaagid arenevad poliitilise mudeli järgi: Faagi nukleiinhape juhib faagi ensüümide sünteesi, kasutades selleks bakteri valke sünteesivat aparaati. Faag ühel või teisel viisil inaktiveerib peremeesorganismi DNA ja RNA ning faagiensüümid lõhustavad selle täielikult; Faagi RNA "allutab" valgusünteesi rakumehhanismi. Faagi nukleiinhape replitseerib ja juhib uute ümbrisvalkude sünteesi. Uued faagiosakesed moodustuvad faagi nukleiinhappe ümber oleva valgu kesta (kapsiidi) spontaanse isekoostumise tulemusena; faagi RNA kontrolli all sünteesitakse lüsosüüm. Rakkude lüüs: rakk puruneb lüsosüümi mõjul; vabaneb umbes 200-1000 uut faagi; faagid nakatavad teisi baktereid.

Kasutamine meditsiinis Üks bakteriofaagide kasutusvaldkondi on antibiootikumravi Alternatiiv antibiootikumide võtmisele. Näiteks kasutatakse bakteriofaage: streptokokk, stafülokokk, klebsiella, düsenteeria ja niisutusalent, püobakteriofaag, coli, proteus ja coliproteus jt. 13 registreeritud ja taotletud Venemaal meditsiinilised preparaadid põhinevad faagidel. Praegu kasutatakse neid bakteriaalsete infektsioonide raviks, mis ei ole traditsioonilisele antibiootikumravile tundlikud, eriti Gruusia Vabariigis. Tavaliselt on bakteriofaagide kasutamine edukam kui antibiootikumid, kus on polüsahhariididega kaetud bioloogilised membraanid, millest antibiootikumid tavaliselt ei tungi. Praegu terapeutiline kasutamine bakteriofaagid ei ole läänes omaksvõttu saavutanud, kuigi faage kasutatakse toidumürgitust põhjustavate bakterite, näiteks listeria hävitamiseks. Aastatepikkune kogemus suurlinna mahus ja maal düsenteeria bakteriofaagi ebatavaliselt kõrge terapeutiline ja profülaktiline efektiivsus on tõestatud (P. M. Lerner, 2010). Venemaal on terapeutilisi faagipreparaate valmistatud pikka aega, faage raviti juba enne antibiootikume. Viimastel aastatel on faage laialdaselt kasutatud pärast Krõmski ja Habarovski üleujutusi düsenteeria ennetamiseks.

Bioloogias kasutatakse bakteriofaage geenitehnoloogias DNA segmente ülekandvate vektoritena, võimalik on ka loomulik geenide ülekandmine bakterite vahel teatud faagide abil (transduktsioon). Faagivektorid luuakse tavaliselt parasvöötme bakteriofaagi λ alusel, mis sisaldab kaheahelalist lineaarset DNA molekuli. Faagi vasakus ja paremas käes on kõik lüütiliseks tsükliks (replikatsioon, paljunemine) vajalikud geenid. keskosa bakteriofaagi genoom λ (sisaldab geene, mis kontrollivad lüsogeneesi, st selle integreerumist bakteriraku DNA-sse) ei ole selle paljunemiseks hädavajalik ja on ligikaudu 25 tuhat aluspaari. Selle osa saab asendada võõra DNA fragmendiga. Sellised modifitseeritud faagid läbivad lüütilise tsükli, kuid lüsogeneesi ei toimu. Bakteriofaagi λ-põhiseid vektoreid kasutatakse kuni 23 kb suuruste eukarüootsete DNA fragmentide (st suuremate geenide) kloonimiseks. Lisaks on ilma insertideta faagid alla 38 kbp. või vastupidi, liiga suurte sisestustega - rohkem kui 52 kb. ei arene ega nakata baktereid. Kuna bakteriofaagide paljunemine on võimalik ainult elusrakkudes, saab bakteriofaage kasutada bakterite elujõulisuse määramiseks. Sellel suunal on suured väljavaated, kuna erinevate biotehnoloogiliste protsesside üheks põhiküsimuseks on kasutatavate kultuuride elujõulisuse määramine. Rakususpensioonide elektrooptilise analüüsi meetodil näidati, et on võimalik uurida faagi-mikroobse raku interaktsiooni etappe.

Ja ka veterinaarmeditsiinis: ennetamiseks ja raviks bakteriaalsed haigused linnud ja loomad; silma limaskestade, suuõõne mädaste-põletikuliste haiguste ravi; mädaste-põletikuliste tüsistuste ennetamine põletuste, haavade, kirurgiliste sekkumiste korral; geenitehnoloogias: transduktsiooniks - geenide loomulik ülekandmine bakterite vahel; vektoritena, mis edastavad DNA sektsioone; faagide abil on võimalik konstrueerida suunatud muutusi peremees-DNA genoomis; toiduainetööstuses: suurtes kogustes faagi sisaldavaid aineid töödeldakse juba valmis liha- ja linnulihatooteid; bakteriofaage kasutatakse toiduainete tootmisel lihast, linnulihast, juustudest, taimsetest saadustest jne;

põllumajanduses: faagipreparaatide pihustamine taimede ja põllukultuuride kaitsmiseks lagunemise ja bakteriaalsete haiguste eest; kaitsta kariloomi ja kodulinde nakkuste ja bakteriaalsete haiguste eest; keskkonnaohutuse tagamiseks: seemnete ja taimede antibakteriaalne töötlemine; toiduainetööstuse ettevõtete ruumide koristamine; tööruumide ja seadmete desinfitseerimine; haiglaruumide ennetamine; keskkonnaalaste tegevuste läbiviimine

Seega on bakteriofaagid tänapäeval inimeste ja loomade elus väga populaarsed. Ettevõtetes on välja toodud terve rida prioriteetseid valdkondi terapeutiliste ja profülaktiliste bakteriofaagide arendamiseks ja tootmiseks, mis on korrelatsioonis äsja esilekerkivate globaalsete trendidega. Paljude haiguste raviks luuakse ja võetakse kasutusele uusi ravimeid. Bakteriofaagide uurimise ja kasutamisega tegelevad bakterioloogid, viroloogid, biokeemikud, geneetikud, biofüüsikud, molekulaarbioloogid, eksperimentaalonkoloogid, geenitehnoloogia ja biotehnoloogia spetsialistid.