Практическо приложение на фагите. Бактериофаги: съвременни аспекти на приложение, перспективи за бъдещето

Отличителни свойства на бактериофагите като представители на царство Вира. Вирулентни фаги, етапи на взаимодействие с бактериална клетка. Практическа употребабактериофаги

Вирулентните фаги причиняват продуктивна инфекция, при което настъпва размножаване на фаги и лизиране на бактериална клетка.

Механизмът на взаимодействие на вирулентен фаг с микробна клетка:

1. Фагова адсорбция върху чувствителни клетки.Възниква в присъствието на комплементарни рецептори в клетъчната стена на бактериите и в краищата на нишките на фаговия процес. Първо, фагът се закрепва с нишки и след това се закрепва здраво към клетъчната стена с помощта на зъбите на баналната пластина.

2. Навлизане на фагова ДНК в бактериална клетка. С помощта на лизозим, намиращ се в баналната пластина, част от клетъчната стена се хидролизира, обвивката на процеса се редуцира и вътрешната пръчка се пробива от клетъчната мембрана. Фаговата ДНК молекула навлиза в клетката през канала на пръчката.

3. Развитие на вътреклетъчни фаги. Фазовата ДНК внася генетична информация в бактериалната клетка. Има биосинтеза на компоненти, необходими за възпроизводството. На ранни стадиисе синтезират "ранни протеини" - ензими, които репликират ДНК на фага, за да образуват много нейни копия. След това на клетъчни рибозомиобразуват се структурни "късни протеини".

4. Фагова морфогенеза. Узряването на фага се извършва по три независими клона в различни части на клетката, което е дисоцииран процес. Отделно се образуват фагови глави - около ДНК молекулата се изгражда капсид. Независимо, процесът се изгражда. Процесните нишки се синтезират отделно. След това всички съставни части на фага се комбинират, за да образуват вириони.

5. Лизиране на бактериалната клетка и освобождаване на фага.Лизисът се извършва под действието на лизозим. Изход чрез пъпкуване.

Строгата специфичност на бактериофагите им позволява да се използват за фаготипизиране и диференциране на бактериални култури, както и за индикацията им във външна среда, например във водни тела.

Методът на фагово типизиране на бактериите се използва широко в микробиологичната практика. Тя позволява не само да се определи видовата принадлежност на изследваната култура, но и нейният фаготип (фаговар). Това се дължи на факта, че бактериите от един и същи вид имат рецептори, които адсорбират строго определени фаги, които след това причиняват техния лизис. Използването на комплекти от такива типоспецифични фаги позволява да се извърши фагово типизиране на изследваните култури за целите на епидемиологичния анализ на инфекциозните заболявания: (определяне на източника на инфекция и начините за нейното предаване)

II. Фагите се използват за профилактика и лечение на инфекциозни заболявания:

а) фагова профилактика- метод за предотвратяване на развитието на някои бактериални инфекциичрез поглъщане на специфичен бактериофаг. Използва се за профилактика на холера, дизентерия, коремен тиф и др.

б) фаготерапията е метод за лечение на бактериални инфекции чрез поглъщане на специфичен фаг.(тиф, салмонела, дизентерия, протей, псевдомонас, стафилококи, стрептококи, колифаги и комбинирани лекарства. Използват се при лечение на инфекциозни заболявания, причинени от горните микроорганизми, както и при лечение на рани и анаеробни инфекции.)

Генотипна изменчивост

Патогенност -

Адхезия

Нашествие

Агресия.

4. Устройство на генетичния апарат на прокариотите. Фенотипна и генотипна изменчивост. Генетични основи на бактериалната патогенност.

Генетичният апарат на прокариотите- няма ядрена обвивка и е представена от една кръгова ДНК молекула, която е хромозома; разположен в цитоплазмата, не съдържа хистонови протеини. Не е способен на митоза

Фенотипна променливост -модификации (изменения в повече от един или повече признаци) – не се отразява на генотипа. Фенотипните промени възникват под въздействието на факторите на околната среда.Модификациите засягат по-голямата част от индивидите в популацията. Те не се наследяват и избледняват с времето, т.е. връщат се към първоначалния фенотип.

Генотипна изменчивост- промяна на свойствата на бактериите, засягащи техния генотип. Унаследява се, дълготрайно е. Възниква в резултат на мутации или генетичен обмен (трансформация, конюгация или трансдукция)

Патогенност -видова черта, която се наследява, фиксирана в генома на микроорганизъм, т.е. това е генотипна черта, която отразява потенциалната способност на микроорганизма да проникне в макроорганизъм и да се размножава в него (инвазивност), причинява комплекс патологични процесикоито се появяват по време на заболяване.

Факторите на патогенност включват способността на микроорганизмите да се прикрепят към клетките (адхезия), да се установят на тяхната повърхност (колонизация), да проникнат в клетките (инвазия) и да се противопоставят на защитните фактори на организма (агресия).

Някои от тях са кодирани директно от нуклеоидните гени (например капсулата и ензимите при някои видове). Другата част е кодирана от екстрахромозомни фактори на наследствеността - плазмиди и епизоми. Плазмидните гени обикновено определят взаимодействието на патогените с епитела, докато хромозомните гени определят съществуването и възпроизвеждането на бактерии извънклетъчно в органи и тъкани.

АдхезияСтруктурите, отговорни за свързването на микроорганизма към клетката, се наричат ​​адхезини и са разположени на повърхността й. При грам-отрицателните бактерии адхезията възниква поради пили I и общи типове. В грам-положителните бактерии адхезините са протеини и тейхоеви киселини на клетъчната стена. При други микроорганизми тази функция се изпълнява от различни структури на клетъчната система: повърхностни протеини, липополизахариди и др.

Нашествиеензимът хиалуронидаза разгражда хиалуроновата киселина, която е част от междуклетъчното вещество и по този начин повишава пропускливостта на лигавиците и съединителната тъкан. Невраминидазата разгражда невраминовата киселина, която е част от повърхностните рецептори на клетките на лигавицата, което допринася за проникването на патогена в тъканите.

АгресияФакторите на агресия включват: протеази - ензими, които разрушават имуноглобулините; коагулаза - ензим, който коагулира кръвната плазма; фибринолизин - разтваряне на фибринов съсирек; лецитиназа - ензим, който действа върху фосфолипидите на мембраните на мускулните влакна, еритроцитите и други клетки .

Практическо приложение на фагите. Бактериофагите се използват при лабораторна диагностика на инфекции по време на вътреспецифична идентификация на бактерии, т.е. определяне на фаговар (тип фаго). За да направите това, се използва методът за типизиране на фагите, основан на строгата специфичност на действието на фагите: капки от различни диагностични тип-специфични фаги се нанасят върху чаша с плътна хранителна среда, засята с "морава" от чиста култура на патогена. Фаговият фаг на една бактерия се определя от вида на фага, който е причинил нейния лизис (образуването на стерилно петно, "плака" или "отрицателна колония", фаг). Техниката за фаготипиране се използва за идентифициране на източника и пътищата на разпространение на инфекцията (епидемиологично маркиране). Изолирането на бактерии от един и същ фаговар от различни пациенти показва общ източник на тяхната инфекция.

Фагите също се използват за лечение и предотвратяване на редица бактериални инфекции. Те произвеждат тиф, салмонела, дизентерия, псевдомонас, стафилококови, стрептококови фаги и комбинирани препарати(колипротеини, пиобактериофаги и др.). Бактериофагите се предписват според показанията перорално, парентерално или локално под формата на течност, таблетни форми, супозитории или аерозоли.

Бактериофагите се използват широко в генното инженерствои биотехнологиите като вектори за получаване на рекомбинантна ДНК.

Използваните в практиката бактериофагови препарати са филтрат от бульонна култура на съответните микроби, лизирани от фаг, съдържащ живи фагови частици, както и разтворени бактериални антигени, освободени от бактериални клетки по време на техния лизис. Полученият препарат - течен бактериофаг трябва да изглежда като напълно прозрачна жълта течност с по-голяма или по-малка интензивност.

За терапевтични и профилактични цели фагите могат да се произвеждат под формата на таблетки с киселинно устойчиво покритие. Таблетираният сух фаг е по-стабилен при съхранение и удобен за употреба. Една таблетка сух бактериофаг отговаря на 20-25 ml течен препарат. Срокът на годност на сухия и течния препарат е 1 година. Течният бактериофаг трябва да се съхранява при температура от + 2 +10 ° C, сух - не по-висока от +1 ° C, но може да се съхранява в хладилник при отрицателна температура.

Бактериофагът, приет през устата, остава в тялото за 5-7 дни. По правило приемането на бактериофаг не е придружено от реакции или усложнения. Няма противопоказания за прием. Използват се под формата на промивания, изплаквания, лосиони, тампони, инжекции, а също така се инжектират в кухините - коремна, плеврална, ставна и пикочен мехур, в зависимост от местоположението на патогена.

Диагностичните фаги се произвеждат както в течна, така и в суха форма в ампули.Преди започване на работа сухият бактериофаг се разрежда. Ако титърът, tr, DRT (доза на работния титър) е посочен на ампулите, той се използва в теста за разграждане на фаги (метод на Ото) за идентифициране на бактерии, ако е посочен фаговият тип, след това за фагово типизиране - за определяне на източника на инфекция.

Действието на бактериофаг върху микробна култура в течна среда и върху плътна среда

Метод на Ото (падаща капка)

Направете гъста тревна площ за засяване на изследваната култура. 5-10 минути след засяването върху изсушената повърхност на хранителната среда се нанася течен диагностичен фаг. Съдът се накланя леко, така че капката фаг да се разпръсне по повърхността на агара. Чашата се поставя в термостат за 18-24 часа. Резултатът се отчита пълно отсъствиерастеж на култура на мястото на прилагане на капчица фаг.

Опит върху течна хранителна среда

Направете засяване на изследваната култура в две епруветки с течна среда. Диагностичен бактериофаг се добавя в цикъл в една епруветка ("O"). След 18-20 часа в епруветка, в която не е добавен бактериофагът („К“), се наблюдава силно помътняване на бульона - засятата култура е нараснала. Бульонът в епруветката, където е добавен бактериофагът, остава прозрачен поради лизиране на културата под негово въздействие.

Фагово типизиране на бактерии

Според спектъра на действие се разграничават следните бактериофаги: поливалентни, лизиращи видове бактерии; моновалентни, лизиращи бактерии от определен тип; типични, лизиращи отделни видове (варианти) бактерии.

Например, един щам на патогенни стафилококи може да бъде лизиран от няколко вида фаги; следователно всички типични фаги (24) и щамове на патогенни стафилококи се комбинират в 4 групи.

Методът за фагово типизиране има голямо значениеза епидемиологични изследвания, тъй като позволява да се идентифицират източникът и начините на разпространение на патогени. За тази цел фаговарът на чиста култура, изолиран от патологичния материал, се определя върху плътни хранителни среди, като се използват типични диагностични фаги.

Фаговарът на културата на микроорганизма се определя от вида на фага, който е причинил лизиса й. Изолирането на бактерии от един и същи фаговар от различни субекти показва източника на инфекцията.

Фаговите препарати се използват за лечение и профилактика на инфекциозни заболявания, както и в диагностиката - за определяне на фаговата чувствителност и фаготипизиране при идентифициране на микроорганизми. Действието на фагите се основава на тяхната строга специфичност. Терапевтичният и профилактичен ефект на фагите се определя от литичната активност на самия фаг, както и от имунизиращото свойство на компонентите (антигени) на унищожените микробни клетки във фаголизатите, особено в случай на многократна употреба. При получаване на фагови препарати се използват доказани производствени щамове на фаги и съответно типични култури от микроорганизми. Бактериална култура в течна хранителна среда, която е в логаритмична фаза на възпроизвеждане, се заразява със суспензия на фагова майка.

Фаголизираната култура (обикновено на следващия ден) се филтрира през бактериални филтри и разтвор на хинозол се добавя като консервант към съдържащия фаги филтрат.
Готовият фагов препарат е бистра течност жълтеникав цвят. За по-дълго съхранение някои фаги се предлагат в суха форма (на таблетки). При лечението и профилактиката на чревни инфекции фагите се използват едновременно с разтвор на натриев бикарбонат, тъй като киселинното съдържание на стомаха унищожава фагата. Фагът не остава дълго в тялото (5-7 дни), затова се препоръчва повторно прилагане.

В Съветския съюз са произведени следните лекарства за лечение и профилактика на заболявания: коремен тиф, салмопела, дизентерия, колифаг, стафилококов фаг и стрептококов. Понастоящем фагите се използват за лечение и профилактика в комбинация с антибиотици. Това приложение има по-ефективен ефект върху резистентни на антибиотици форми на бактерии.

Диагностичните бактериофаги се използват широко за идентифициране на бактерии, изолирани от пациент или от заразени обекти на околната среда. С помощта на бактериофагите, поради тяхната висока специфичност, е възможно да се определят видовете бактерии и с по-голяма точност отделните видове изолирани бактерии. Разработена е фагодиагностика и фаготипизиране на бактерии от рода Salmonella, Vibrio и стафилококи. Фаговото типизиране помага да се установи източникът на инфекция, да се проучат епидемиологичните връзки и да се разграничат спорадичните и епидемичните случаи на заболявания.
Фагодиагностиката и фаготипизирането се основават на принципа на съвместно култивиране на изолиран микроорганизъм със съответния вид или тип фаги. положителен резултатсе има предвид наличието на добре изразен лизис на изследваната култура с видовия фаг, а след това с един от типичните фаги.

СМ. ЗАХАРЕНКО, кандидат на медицинските науки, доцент, Военномедицинска академиятях. СМ. Киров, Санкт Петербург

Бактериофагите са уникални микроорганизми, на базата на които е създадена специална по свойства и характеристики група лечебно-профилактични препарати. Естествените физиологични механизми на взаимодействие между фагите и бактериите, които са в основата на тяхното действие, позволяват да се предвиди безкрайното разнообразие както на самите бактериофаги, така и на възможни начинитехните приложения. С разширяването на колекциите от бактериофаги несъмнено ще се появят нови целеви патогени и ще се разшири обхватът от заболявания, при които фагите могат да се използват както като монотерапия, така и като част от комплексни схеми на лечение.

Да, използвай поливалентен пиобактериофагСекстафагът при лечението на инфектирана панкреатична некроза (Пермска държавна медицинска академия на името на академик Е.А. Вагнер) направи възможно бързото възстановяване на основните параметри на хомеостазата и функциите на органите и системите при пациентите. Броят на постоперативните усложнения и смъртните случаи също значително намалява: в групата на пациентите, които са получили стандартна терапия, смъртността е 100%, докато в трупата, която е получила BP, тя е 16,6%.

Поради безвредността и реактогенността на БФ препаратите е възможно използването им в педиатричната практика, включително при новородени. Интересен е опитът на Детската областна клинична болница в Нижни Новгород, където в периода на усложняване на епидемиологичната ситуация, наред с обичайните противоепидемични мерки, бяха използвани BP - Intesti-bacteriophage и BP Pseucfomonas aeruginosa. 11-кратно намаляване на честотата на нозокомиалните инфекции на Pseudomonas aeruginosa показва високата ефективност на употребата на BP. БФ препаратите могат да се предписват както за лечение на дисбактериоза, така и за лечение на разстройства храносмилателната системаи за предотвратяване на колонизация на лигавицата стомашно-чревния трактопортюнистични бактерии. Многокомпонентните препарати от BF са идеални за незабавно облекчаване на първите признаци на стомашно-чревно разстройство.

Към днешна дата компанията е планирала редица приоритетни областиразработване и производство на терапевтични и профилактични бактериофаги, които корелират с нововъзникващите световни тенденции. Създават се и се въвеждат нови препарати: разработени са BF срещу назъбвания и ентеробактерии, работи се за създаване на фагов препарат срещу Helicobacter pylori.

Само един производител на тези лекарства - NPO Microgen, според доклада на заместник-началника на отдела за наука и иновационно развитие Алла Лобастова, произвежда повече от 2 милиона опаковки годишно. За съжаление, идеите на много лекари за бактериофагите далеч не са обективни. Малко хора знаят, че бактериофагите, активни срещу един и същи патоген, могат да принадлежат към различни семейства, да имат различни жизнени цикли и т.н. Например бактериофагите на P. aeruginosa принадлежат към семействата Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, кръговат на животаили умерено. Различните щамове на един и същи патоген могат да имат различна чувствителност към бактериофагите. Повечето експерти знаят (чували, някой използвал) за съществуването на течни и таблетни лекарствени форми на терапевтични и профилактични препарати на бактериофаги. Техният обхват обаче е много по-широк, което може да се отдаде на безусловни предимства, особено в комбинация с различни начини на приложение (перорално приложение, клизми, приложения, напояване на рани и лигавици, въвеждане в кухини на рани и др.). Очевидните предимства на бактериофагите традиционно включват специфичен ефект върху доста ограничена популация от бактерии, ограничено време на съществуване (до изчезването на целевата популация от микроорганизми), липсата на такива странични ефектикато токсични и алергични реакции, дисбиотични реакции и др. Тези лекарства могат да се използват в различни възрастови групии по време на бременност. Самите бактериофаги не са значими алергени. Случаите на непоносимост към препарати от бактериофаг са свързани предимно с реакция към компонентите на хранителната среда. Всички големи производители на тази група лекарства се стремят към максимално качество на използваните компоненти, което намалява вероятността от подобни реакции. В контекста на нарастващата антибиотична резистентност, някои автори предлагат бактериофагите да се разглеждат като най-добрата алтернативаантибиотици. Терапевтичните и профилактичните препарати от бактериофаги са коктейл от специално подбрани комбинации (комплекс от поликлонални силно вирулентни бактериални вируси, специално подбрани срещу най-често срещаните групи патогени на бактериални инфекции) на базата на фагови колекции на производителя. Клоновете на Федералното държавно унитарно предприятие NPO Microgen в Уфа, Перм и Нижни Новгород са модерни центрове за производство на такива лекарства. Възможност за създаване на персонализирани патогенни микроорганизмилечебно-профилактични препарати от бактериофаги е друго основно предимство на тази група препарати. Нарастването на резистентността на бактериите към антимикробни лекарства и често срещаната полиетиология на съвременните инфекциозни заболявания изискват комбинирана антибиотична терапия (две, три, а понякога и повече). антимикробни средства). За избор ефективна схематерапия с антибиотици, в допълнение към действителната чувствителност на бактериите към лекарството, е необходимо да се вземе предвид достатъчно голямо числофактори. Фаготерапията също има някои предимства в това отношение. От една страна, използването на комбинация от бактериофаги не е придружено от тяхното взаимодействие помежду си и не води до промяна в схемите на тяхното приложение. В рамките на съществуващия набор от терапевтични бактериофаги има редица добре доказани комбинации - бактериофаг coliproteus, пиобактериофаг поливалентен, интести-бактериофаг. От друга страна, бактериите не го правят общи механизмирезистентност към антибиотици и фаги, следователно те могат да се използват както когато патогенът е резистентен към едно от лекарствата, така и в комбинация от "антибиотик + бактериофаг". Тази комбинация е особено ефективна за унищожаване на микробни биофилми. Експериментът убедително показва това комбинирано приложениежелезни антагонисти и бактериофаг могат да нарушат образуването на биофилми от Klebsiella pneumoniae. В същото време се отбелязва както значително намаляване на броя на микробните популации, така и намаляване на броя на "младите" клетки. Още едно важна характеристикадействието на бактериофагите е такова явление като индукция на апоптоза. Някои щамове на E. coli имат гени, които причиняват клетъчна смърт след въвеждането на бактериофага Т4 в нея. По този начин, в отговор на експресията на късните гени на фага Т4, lit генът (кодира протеаза, която разрушава фактора на удължаване EF-Tu, необходим за синтеза на протеини) блокира синтеза на всички клетъчни протеини. Генът prrC кодира нуклеаза, която разцепва лизиновата тРНК. Нуклеазата се активира от продукта на stp гена на Т4 фага. В клетките, инфектирани с фаг Т4, rex гените (принадлежащи към генома на фага и експресирани в лизогенни клетки) причиняват образуването на йонни канали, което води до загуба на жизненоважни йони от клетките и впоследствие до смърт. Самият Т4 фаг може да предотврати клетъчната смърт, като затвори каналите със своите протеини, продукти на rII гените. В случай на формиране на бактериална резистентност към антибиотик, трябва да се търсят нови възможности за модифициране на активната молекула или фундаментално нови вещества. За съжаление за последните годинискоростта на въвеждане на нови антибиотици се забави значително. Ситуацията с бактериофагите е коренно различна. Колекциите на големите производители включват десетки готови щамове бактериофаги и непрекъснато се допълват с нови активни фаги. Благодарение на постоянния мониторинг на чувствителността на изолираните патогени към бактериофагите, производителите коригират съставите на фагите, доставяни в регионите. Благодарение на адаптираните бактериофаги е възможно да се премахнат огнища на нозокомиални инфекции, причинени от резистентни на антибиотици щамове.

При орален приембактериофагите бързо достигат до огнищата на локализация на инфекцията: когато се приемат перорално от пациенти с гнойно-възпалителни заболявания, след час фагите навлизат в кръвния поток, след 1-1,5 часа се откриват от бронхопулмонарен ексудат и от повърхността на рани от изгаряния, след 2 часа - от урината, а също и от цереброспиналната течност на пациенти с черепно-мозъчна травма.

По този начин бактериофагите са уникални микроорганизми, на базата на които е създадена специална група терапевтични и профилактични препарати по отношение на техните свойства и характеристики. Естествените физиологични механизми на взаимодействие между фагите и бактериите, които са в основата на тяхното действие, позволяват да се предвиди безкрайно разнообразие както от самите бактериофаги, така и от възможните начини за тяхното използване. С разширяването на колекциите от бактериофаги несъмнено ще се появят нови целеви патогени и ще се разшири обхватът от заболявания, при които фагите могат да се използват както като монотерапия, така и като част от комплексни схеми на лечение. Модерен подход по-нататъшна съдбатерапията с фаги трябва да се основава както на високата специфичност на тяхното действие, така и на необходимостта от стриктно спазване на всички правила на терапията с фаги. Контрастирането на бактериофагите с каквито и да е средства за етиотропна терапия е погрешно.

В средата на миналия век биологичната наука направи революционна крачка напред, като установи молекулярната основа за функционирането на живите системи. Бактериофагите, открити в началото на миналия век, изиграха огромна роля в успешните изследвания, довели до определянето на химическата природа на наследствените молекули, декодирането на генетичния код и създаването на технологии за манипулиране на гени. Към днешна дата тези бактериални вируси са усвоили много „професии“, полезни за хората: те се използват не само като безопасни антибактериални лекарства, но и като дезинфектанти и дори като основа за създаване на електронни наноустройства.

Когато през 30-те години на ХХ в група учени се заеха с проблемите на функционирането на живите системи, след което в търсене на най-простите модели обърнаха внимание на бактериофаги- бактериални вируси. В крайна сметка сред биологичните обекти няма нищо по-просто от бактериофагите, освен това те могат лесно и бързо да се отглеждат и анализират, а вирусните генетични програми са малки.

Фагът е естествена структура с минимален размер, съдържаща плътно опакована генетична програма (ДНК или РНК), в която няма нищо излишно. Тази програма е затворена в протеинова обвивка, оборудвана с минимален набор от устройства за нейното доставяне вътре в бактериалната клетка. Бактериофагите не могат да се възпроизвеждат сами и в този смисъл не могат да се считат за пълноценни живи обекти. Техните гени започват да работят само в бактериите, използвайки наличните биосинтетични системи в бактериалната клетка и резервите от молекули, необходими за синтеза. Въпреки това, генетичните програми на тези вируси не се различават фундаментално от програмите на по-сложни организми, така че експериментите с бактериофаги позволиха да се установи фундаментални принципиструктурата и функционирането на генома.

Впоследствие това знание и методите, разработени по време на изследването, станаха основа за развитието на биологичната и медицинската наука, както и широк спектър от биотехнологични приложения.

Борци срещу патогени

Първите опити за използване на бактериофаги за лечение на инфекциозни заболявания бяха направени почти веднага след откриването им, но липсата на знания и несъвършените биотехнологии от онова време не им позволиха да постигнат пълен успех. Въпреки това по-нататъшната клинична практика показа фундаменталната възможност за успешно използване на бактериофаги в инфекциозни заболяваниястомашно-чревния тракт, пикочно-половата система, при остри гнойно-септични състояния на болни, за лечение на хирургични инфекции и др.

В сравнение с антибиотиците, бактериофагите имат редица предимства: не предизвикват странични ефекти, освен това са строго специфични за определени видове бактерии, така че при тяхното използване не се нарушава нормалният човешки микробиом. Такава висока селективност обаче също създава проблеми: за да се лекува успешно пациент, е необходимо да се знае точно инфекциозният агент и да се избере индивидуално бактериофага.

Фагите могат да се използват и профилактично. Например Московският изследователски институт по епидемиология и микробиология. Г. Н. Габричевски разработи профилактичен продукт "FOODFAG" на базата на коктейл от бактериофаги, който намалява риска от инфекция с остри чревни инфекции. Клиничните проучвания показват, че седмичният прием на лекарството ви позволява да се отървете от хемолизиращата Escherichia coli и други патогенни и опортюнистични бактериипричинявайки чревна дисбиоза.

Бактериофагите лекуват инфекциозни заболявания не само на хората, но и на домашните и селскостопанските животни: мастит при крави, колибацилоза и ешерихиоза при телета и прасета, салмонелоза при пилета ... Особено удобно е използването на фагови препарати в случай на аквакултури - за третиране на индустриално отглеждани риби и скариди, тъй като те престояват дълго време във вода. Бактериофагите също помагат за защита на растенията, въпреки че използването на фагови технологии в този случай е трудно поради въздействието природни фактори, като слънчева светлина и дъжд, са вредни за вирусите.

Фагите могат да играят голяма роля в поддържането на микробиологичната безопасност на храните, тъй като използването на антибиотици и химически агенти в хранително-вкусовата промишленост не решава този проблем, като същевременно намалява нивото на екологичност на продуктите. Сериозността на самия проблем се доказва от статистиката: например в САЩ и Русия се регистрират до 40 хиляди случая на салмонелоза годишно, от които 1% умират. Разпространението на тази инфекция до голяма степен е свързано с отглеждането, обработката и консумацията на различни видове домашни птици, а опитите за използване на бактериофаги за борба с нея показват обещаващи резултати.

Да, американска компания Интралитикспроизвежда фагови препарати за борба с листериозата, салмонелозата и бактериалното заразяване с Escherichia coli. Одобрени са за използване като добавки за предотвратяване развитието на бактерии върху храните - пръскат се върху месни и птичи продукти, както и върху зеленчуци и плодове. Експериментите показват, че коктейл от бактериофаги може успешно да се използва при транспортирането и продажбата на живи езерни риби, за да се намали бактериалното замърсяване не само на водата, но и на самата риба.

Очевидно приложение на бактериофагите е дезинфекция, тоест унищожаване на бактерии на места, където не трябва да бъдат: в болници, на хранителна продукцияи т. За целта британска компания Фиксиран фагразработи метод за фиксиране на фагови препарати върху повърхности, който гарантира запазването на биологична активностфаги до три години.

Бактериофаги - "дрозофила" на молекулярната биология

През 1946 г. на 11-ия симпозиум в известната американска лаборатория в Колд Спринг Харбър е провъзгласена теорията за "един ген - един ензим". Бактериологът А. Хърши и "бившият" физик, молекулярен биолог М. Делбрюк съобщават за обмена на генетични черти между различни фаги при едновременно заразяване на клетките на Escherichia coli. Това откритие, направено във време, когато физическият носител на гена все още не е известен, свидетелства, че явлението "рекомбинация" - смесването на генетични признаци, е характерно не само за висшите организми, но и за вирусите. Откриването на този феномен впоследствие направи възможно подробното изследване на молекулярните механизми на репликация. По-късно експериментите с бактериофаги позволиха да се установят принципите на структурата и действието на генетичните програми.

През 1952 г. A. Hershey и M. Chase експериментално доказаха, че наследствената информация на бактериофага Т2 не е кодирана в протеини, както смятат много учени, а в ДНК молекули (Hershey & Chase, 1952). Изследователите проследиха процеса на възпроизвеждане в две групи бактериофаги, едната носеща радиомаркирани протеини, а другата носеща ДНК молекули. След заразяване на бактерии с такива фаги се оказа, че само вирусна ДНК се предава в заразената клетка, което послужи като доказателство за нейната роля в съхранението и предаването на наследствена информация.

През същата година американските генетици Д. Ледерберг и Н. Зиндлер, в експеримент, включващ два щама Salmonella и бактериофага Р22, установиха, че бактериофагът е способен да включва ДНК фрагменти на бактерията гостоприемник по време на възпроизвеждане и да ги предава на други бактерии при инфекция (Zinder & Lederberg, 1952). Това явление на генен трансфер от бактерия донор към бактерия реципиент е наречено "трансдукция". Резултатите от експеримента станаха още едно потвърждение за ролята на ДНК в предаването на наследствена информация.

През 1969 г. А. Хърши, М. Делбрюк и техният колега С. Лурия стават Нобелови лауреати "за техните открития относно механизма на репликация и генетичната структура на вирусите".

През 1972 г., докато изучават процеса на репликация (копиране на клетъчна информация) на ДНК на E. coli, Р. Бърд и колегите му използват бактериофаги като сонди, способни да се интегрират в генома на бактериалната клетка и откриват, че процесът на репликация протича в две посоки по протежение на хромозомата (Стент, 1974 г.).

Седем дни на сътворението

Съвременните методи на синтетичната биология позволяват не само да се правят различни модификации на геномите на фагите, но и да се създават напълно изкуствени активни фаги. Технологично това не е трудно, просто трябва да синтезирате генома на фага и да го въведете в бактериална клетка и там ще започне всички процеси, необходими за синтеза на протеини и сглобяването на нови частици на фага. В съвременните лаборатории тази работа ще отнеме само няколко дни.

Генетичните модификации се използват за промяна на спецификата на фагите и повишаване на тяхната ефективност. терапевтичен ефект. За да направят това, най-агресивните фаги са снабдени със структури за разпознаване, които ги свързват с целевите бактерии. Също така, гени, кодиращи токсични протеини за бактерии, които нарушават метаболизма, се вмъкват допълнително във вирусни геноми - такива фаги са по-смъртоносни за бактериите.

Бактериите имат няколко защитни механизма срещу антибиотици и бактериофаги, един от които е разрушаването на вирусните геноми. рестрикционни ензимидействащи върху специфични нуклеотидни последователности. За да се увеличи терапевтичната активност на фагите, поради израждането на генетичния код, последователностите на техните гени могат да бъдат „преформатирани“ по такъв начин, че да се сведе до минимум броят на нуклеотидните последователности, които са „чувствителни“ към ензимите, като същевременно се запазят техните кодиращи свойства.

Универсален начин за защита на бактериите от всякакви външни влияния – т.нар биофилми, филми от ДНК, полизахариди и протеини, които бактериите създават заедно и където не проникват нито антибиотици, нито терапевтични протеини. Такива биофилми са главоболиелекари, тъй като допринасят за разрушаването на зъбния емайл, се образуват на повърхността на импланти, катетри, изкуствени стави, както и в респираторен тракт, върху повърхността на кожата и др. За борба с биофилмите са конструирани специални бактериофаги, съдържащи ген, кодиращ специален литичен ензим, който разрушава бактериалните полимери.

Ензими "от бактериофаг"

Голям брой ензими, които днес се използват широко в молекулярната биология и генното инженерство, са открити в резултат на изследване на бактериофаги.

Един такъв пример са рестрикционните ензими, група бактериални нуклеази, които разцепват ДНК. Още в началото на 1950 г. Установено е, че бактериофагите, изолирани от клетки на един щам бактерии, често се възпроизвеждат лошо в близък щам. Откриването на този феномен означава, че бактериите имат система за потискане на възпроизвеждането на вируси (Luria & Human, 1952). В резултат на това е открита ензимна рестрикционно-модифицираща система, с помощта на която бактериите унищожават чужда ДНК, навлязла в клетката. Изолирането на рестрикционни ензими (рестрикционни ендонуклеази) даде на молекулярните биолози безценен инструмент за манипулиране на ДНК: вмъкване на една последователност в друга или изрязване на необходимите верижни фрагменти, което в крайна сметка доведе до развитието на рекомбинантна ДНК технология.

Друг ензим, широко използван в молекулярната биология, е бактериофаг Т4 ДНК лигаза, която „омрежва“ „лепкавите“ и „тъпите“ краища на двойноверижни ДНК и РНК молекули. А наскоро се появиха генетично модифицирани варианти на този ензим с по-голяма активност.

Повечето от използваните в лабораторната практика РНК лигази, които „зашиват” едноверижни РНК и ДНК молекули, също произхождат от бактериофаги. В природата те служат главно за възстановяване на счупени РНК молекули. Изследователите най-често използват РНК лигаза на бактериофаг Т4, която може да „зашие“ едноверижни полинуклеотиди върху РНК молекули, за да ги маркира. Тази техника се използва за анализиране на структурата на РНК, търсене на места за свързване на РНК-протеин, олигонуклеотиден синтез и др. Напоследък сред рутинно използваните ензими се появиха термостабилни РНК лигази, изолирани от бактериофаги rm378 и TS2126 (Nordberg Karlsson, et al., 2010 ; Hjorleifsdottir, 2014).

От бактериофагите са получени и някои от друга група изключително важни ензими, полимеразите. Например много „прецизната“ бактериофаг Т7 ДНК полимераза, намерила приложение в различни области на молекулярната биология, като сайт-насочена мутагенеза, но се използва главно за определяне на първичната структура на ДНК.

Химически модифицирана Т7 фагова ДНК полимераза е предложена като перфектен инструментза секвениране на ДНК още през 1987 г. (Tabor & Richardson, 1987). Модификацията на тази полимераза увеличи нейната ефективност няколко пъти: скоростта на ДНК полимеризация в този случай достига повече от 300 нуклеотида в секунда, така че може да се използва за амплифициране на големи ДНК фрагменти. Този ензим стана предшественик на секвеназа, генетично модифициран ензим, оптимизиран за секвениране на ДНК в реакцията на Sanger. Секвеназата е различна висока ефективности способността да се включат нуклеотидни аналози в ДНК последователността, които се използват за подобряване на резултатите от секвенирането.

Основните РНК полимерази, използвани в молекулярната биология (ДНК-зависими РНК полимерази) - ензими, които катализират процеса на транскрипция (четене на РНК копия от ДНК шаблона) - също произхождат от бактериофаги. Те включват SP6, T7 и T3 РНК полимерази, наречени на съответните бактериофаги SP6, T7 и T3. Всички тези ензими се използват за in vitro синтез на антисенс РНК транскрипти, белязани РНК сонди и др.

Първият напълно секвениран ДНК геном беше геномът на фага φ174, дълъг над 5000 нуклеотида (Sanger et al., 1977). Това декодиране е извършено от група английски биохимик Ф. Сангер, създател на известния едноименен метод за секвениране на ДНК.

Полинуклеотид киназите катализират трансфера на фосфатна група от ATP молекула към 5' края на молекулата на нуклеиновата киселина, обмена на 5' фосфатни групи или фосфорилирането на 3' краищата на мононуклеотидите. В лабораторната практика най-широко се използва бактериофаг Т4 полинуклеотид киназа. Обикновено се използва в експерименти за маркиране на ДНК с радиоактивен изотоп на фосфора. Полинуклеотид киназата се използва също за търсене на рестрикционни сайтове, ДНК и РНК пръстови отпечатъци, синтез на субстрати за ДНК или РНК лигази.

В молекулярно-биологични експерименти ензимите на бактериофаги като полинуклеотид киназа на фаг Т4, обикновено използвани за маркиране на ДНК с радиоактивен изотоп на фосфор, ДНК и РНК пръстови отпечатъци и др., както и ензими, които разцепват ДНК, които се използват за получаване на едноверижна ДНК матриците също се използват широко в молекулярно-биологични експерименти за секвениране и анализ на нуклеотиден полиморфизъм.

Използвайки методите на синтетичната биология, също беше възможно да се разработят бактериофаги, въоръжени с най-сложните оръжия, които бактериите използват срещу самите фаги. Това е заотносно бактериалните системи CRISPR-Cas, които са комплекс от ензима нуклеаза, който разцепва ДНК и последователността на РНК, която насочва действието на този ензим върху специфичен фрагмент от вирусния геном. Част от ДНК на фага служи като „указател“, който бактерията съхранява „за памет“ в специален ген. Когато подобен фрагмент се открие вътре в бактерия, този протеиново-нуклеотиден комплекс я унищожава.

След като разбраха механизма на работа на системите CRISPR-Cas, изследователите се опитаха да оборудват самите фаги с подобно „оръжие“, за което беше комплекс от гени, кодиращи нуклеаза и адресиращи РНК последователности, допълващи специфични региони на бактериалния геном. въведени в техния геном. „Мишена“ могат да бъдат гените, отговорни за множествената лекарствена резистентност. Експериментите бяха увенчани с пълен успех - такива фаги с голяма ефективност повлияха на бактериите, към които бяха "настроени".

Фагови антибиотици

За терапевтични цели не е необходимо фагите да се използват директно. В продължение на милиони години еволюция бактериофагите са разработили арсенал от специфични протеини - инструменти за разпознаване на целевите микроорганизми и манипулиране на биополимерите на жертвата, на базата на които могат да се създават антибактериални лекарства. Най-обещаващите протеини от този тип са ендолизиновите ензими, които фагите използват, за да разрушат клетъчната стена при излизане от бактерията. Сами по себе си тези вещества са мощни. антибактериални средства, нетоксичен за хората. Ефективността и посоката на тяхното действие може да се повиши чрез промяна на адресиращите структури в тях - протеини, които се свързват специфично с определени бактерии.

Повечето бактерии се разделят според структурата на клетъчната стена на грам-положителни, чиято мембрана е покрита с много дебел слой пептидогликани, и грам-отрицателни, при които пептидогликановият слой е разположен между две мембрани. Използването на естествени ендолизини е особено ефективно при грам-положителни бактерии (стафилококи, стрептококи и др.), тъй като техният пептидогликанов слой е разположен отвън. Грам-отрицателните бактерии (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli и др.) са по-малко достъпна цел, тъй като ензимът трябва да проникне през външната бактериална мембрана, за да достигне вътрешния слой пептидогликан.

За да се преодолее този проблем, са създадени така наречените артилизини - модифицирани версии на естествени ендолизини, съдържащи поликатионни или амфипатични пептиди, които дестабилизират външната мембрана и осигуряват доставката на ендолизин директно към пептидогликановия слой. Артилизините имат висока бактерицидна активност и вече е доказано, че са ефективни при лечението на възпаление на средното ухо при кучета (Briers et al., 2014).

Пример за модифициран ендолизин, който селективно действа върху определени бактерии е препаратът P128 на канадската компания Ganga Gen Inc.. Това е биологично активен фрагмент от ендолизин, свързан с лизостафин, насочена протеинова молекула, която се свързва с повърхността на стафилококови клетки. Полученият химерен протеин има висока активност срещу различни щамове стафилококи, включително тези с резистентност към множество лекарства.

"Броячи" на бактерии

Бактериофагите служат не само като универсален терапевтичен и "дезинфекционен" агент, но и като удобен и точен аналитичен инструмент за микробиолога. Например, поради високата си специфичност, те са естествени аналитични реагенти за откриване на бактерии от определен вид и щам.

В най-простата версия на такова изследване различни диагностични бактериофаги се добавят на капки към петриево блюдо с хранителна среда, инокулирана с бактериална култура. Ако бактерията се окаже чувствителна към фага, то на това място от бактериалната "морава" се образува "плака" - прозрачен участък с убити и лизирани бактериални клетки.

Чрез анализиране на размножаването на фаги в присъствието на целеви бактерии, може да се определи количествено изобилието на последните. Тъй като броят на фаговите частици в разтвора ще се увеличи пропорционално на броя на бактериалните клетки, съдържащи се в него, достатъчно е да се определи титърът на бактериофага, за да се оцени броят на бактериите.

Специфичността и чувствителността на такава аналитична реакция е доста висока, а самите процедури са лесни за изпълнение и не изискват сложно оборудване. Важно е диагностичните системи, базирани на бактериофаги, да сигнализират за наличието на жив патоген, докато други методи, като PCR и имуноаналитични методи, показват само наличието на биополимери, принадлежащи на тази бактерия. Този тип диагностични методи са особено подходящи за използване в екологични изследвания, както и в хранително-вкусовата промишленост и селско стопанство.

Сега се използват специални методи за идентифициране и количествено определяне на различни щамове микроорганизми. референтни видовефаги. Много бърз, работи почти в реално време аналитични системимогат да бъдат създадени на базата на генетично модифицирани бактериофаги, които, когато навлязат в бактериална клетка, предизвикват синтеза на репортерни флуоресцентни (или способни на луминесценция) протеини, като напр. луцифераза. Когато към такава среда се добавят необходимите субстрати, в нея ще се появи луминисцентен сигнал, чиято стойност съответства на съдържанието на бактерии в пробата. Такива "светлинно маркирани" фаги са разработени за откриване на опасни патогени - причинители на чума, антракс, туберкулоза и растителни инфекции.

Вероятно с помощта на модифицирани фаги ще бъде възможно да се реши и дългогодишният проблем от световно значение - да се разработят евтини и бързи методиоткриване на причинители на туберкулоза ранна фазазаболявания. Тази задача е много трудна, тъй като микобактериите, причиняващи туберкулоза, се характеризират с изключително бавен растеж при култивиране в лабораторни условия. Следователно диагнозата на заболяването традиционни методиможе да отнеме до няколко седмици.

Фаговата технология улеснява тази задача. Същността му е, че към пробите от анализираната кръв се добавя бактериофаг D29, способен да инфектира широк обхватмикобактерии. След това бактериофагите се разделят и пробата се смесва с бързо растяща непатогенна култура от микобактерии, също чувствителни към този бактериофаг. Ако първоначално в кръвта е имало микобактерии, които са били заразени с фаги, тогава производството на бактериофаг ще се наблюдава и в новата култура. По този начин могат да бъдат открити единични клетки от микобактерии, а самият диагностичен процес се намалява от 2–3 седмици на 2–5 дни (Swift & Rees, 2016).

Фагов дисплей

Днес бактериофагите се използват широко като прости системиза производството на протеини с желани свойства. Това е този, разработен през 80-те години. изключително ефективна техника за молекулярна селекция - фагов дисплей. Този термин е предложен от американеца Дж. Смит, който доказва, че на базата на бактериофаги от Escherichia coli е възможно да се създаде жизнеспособен модифициран вирус, който носи на повърхността си чужд протеин. За да направите това, съответният ген се въвежда в генома на фага, който се слива с гена, кодиращ един от повърхностните вирусни протеини. Такива модифицирани бактериофаги могат да бъдат изолирани от смес с фаги от див тип поради способността на "чужд" протеин да се свързва със специфични антитела (Smith, 1985).

От експериментите на Смит последваха два важни открития: първо, използвайки рекомбинантна ДНК технология, е възможно да се създадат популации от 10 6 -10 14 фагови частици, огромно разнообразие, всяка от които носи на повърхността си различни вариантипротеини. Такива популации се наричат комбинаторни фагови библиотеки. Второ, чрез изолиране на специфичен фаг от популация (например, притежаващ способността да се свързва с определен протеин или органична молекула), този фаг може да бъде размножен в бактериални клеткии вземете неограничен брой деца с дадените свойства.

Фаговият дисплей днес произвежда протеини, които могат селективно да се свързват с терапевтични мишени, като тези, изложени на повърхността на фага M13, които могат да разпознават и взаимодействат с туморни клетки. Ролята на тези протеини във фаговата частица е да „опаковат“ нуклеиновата киселина; следователно те са много подходящи за създаване на лекарства за генна терапия, само в този случай те образуват частица вече с терапевтична нуклеинова киселина.

Днес има две основни области на приложение на фаговия дисплей. Технологията, базирана на пептиди, се използва за изследване на рецептори и картографиране на местата за свързване на антитела, проектиране на имуногени и нановаксини и картографиране на местата за свързване на субстрати за ензимни протеини. Технология, базирана на протеини и протеинови домени - за селекция на антитела с желани свойства, изследване на взаимодействията протеин-лиганд, скрининг на експресирани комплементарни ДНК фрагменти и целеви модификации на протеини.

Използвайки фагов дисплей, е възможно да се въведат групи за разпознаване във всички видове повърхностни вирусни протеини, както и в основния протеин, който образува тялото на бактериофага. Чрез въвеждане на пептиди с желани свойства в повърхностните протеини може да се получи цял набор от ценни биотехнологични продукти. Например, ако този пептид имитира протеин опасен вирусили бактерии, разпознаваеми имунна система, тогава такъв модифициран бактериофаг е ваксина, която може да бъде разработена лесно, бързо и безопасно.

Ако крайният повърхностен протеин на бактериофага е "адресиран" към раковите клетки и репортерните групи (например флуоресцентни или магнитни) са прикрепени към друг повърхностен протеин, тогава ще се получи средство за откриване на тумори. И ако към частицата се добави цитотоксично лекарство (и съвременната биоорганична химия улеснява това), тогава получаваме лекарство, което е насочено срещу раковите клетки.

Едно от важните приложения на протеиновия фагов дисплей е създаването на фагови библиотеки от рекомбинантни антитела, където антиген-свързващи фрагменти от имуноглобулини са разположени на повърхността на fd или M13 фагови частици. Библиотеките с човешки антитела са от особен интерес, тъй като такива антитела могат да се използват в терапията без ограничения. През последните години около дузина терапевтични антитела, конструирани по този метод, са продадени само на фармацевтичния пазар в САЩ.

"Индустриални" фаги

Методологията на фаговия дисплей също намери доста неочаквани приложения. В края на краищата бактериофагите са предимно наноразмерни частици с определена структура, на чиято повърхност са разположени протеини, които с помощта на фагов дисплей могат да бъдат „осигурени“ със свойствата да се свързват специфично с желаните молекули. Такива наночастици се отварят най-широките възможностида създават материали със зададена архитектура и "умни" молекулярни наноустройства, като технологиите за тяхното производство ще бъдат екологични.

Тъй като вирусът е доста твърда структура с определено съотношение на размерите, това обстоятелство прави възможно използването му за получаване на порести наноструктури с известна повърхност и желано разпределение на порите в структурата. Както е известно, повърхностната площ на катализатора е критичният параметър, определящ неговата ефективност. А съществуващите технологии за образуване на най-тънкия слой от метали и техните оксиди върху повърхността на бактериофагите позволяват да се получат катализатори с изключително развита правилна повърхност с даден размер. (Лий и др., 2012 г.).

Изследователят от Масачузетския технологичен институт А. Белчър използва бактериофаг М13 като матрица за растеж на наночастици и нанонита от родий и никел върху повърхността на цериев оксид. Получените наночастици на катализатора улесняват превръщането на етанол във водород; по този начин този катализатор може да бъде много полезен за надграждане на съществуващи и създаване на нови водородни горивни клетки. Катализаторът, отгледан върху вирусна матрица, се различава от „конвенционалния“ катализатор с подобен състав по по-висока стабилност, той е по-малко склонен към стареене и повърхностно дезактивиране (Nam et al. . , 2012).

Чрез покриване на нишковидни фаги със златен и индиев диоксид са получени електрохромни материали - порести нанофилми, които променят цвета си при промяна на електрическото поле, способни да реагират на промяна в електрическото поле един път и половина по-бързо от известните аналози. Такива материали са обещаващи за създаване на енергоспестяващи устройства с ултратънък екран (Nam et al., 2012).

В Масачузетс Технологичен институтбактериофагите станаха основа за производството на много мощни и изключително компактни електрически батерии. За целта са използвани живи, генетично модифицирани M13 фаги, които са безвредни за хората и способни да прикрепят различни метални йони към повърхността. В резултат на самосглобяването на тези вируси са получени структури с дадена конфигурация, които, покрити с метал, образуват доста дълги нанонижи, които стават основата на анода и катода. При самоформиране на анодния материал е използван вирус, способен да прикрепя злато и кобалтов оксид, за катод - способен да прикрепя железен фосфат и сребро. Последният фаг също притежава способността да "вдига" краищата на въглеродна нанотръба поради молекулярно разпознаване, което е необходимо за осигуряване на ефективен трансфер на електрони.

Създадени са и материали за слънчеви клетки на базата на комплекси от бактериофаг M13, титанов диоксид и едностенни въглеродни нанотръби (Dang et al., 2011).

Последните години бяха белязани от задълбочени изследвания на бактериофагите, които намират нови приложения не само в терапията, но и в био- и нанотехнологиите. Техният очевиден практически резултат трябва да бъде появата на ново мощно направление на персонализираната медицина, както и създаването на цял набор от технологии в хранително-вкусовата промишленост, ветеринарната медицина, селското стопанство и в производството на съвременни материали. Очакваме, че вторият век на изследване на бактериофагите ще донесе толкова открития, колкото и първият.

Литература
1. Бактериофаги: биология и приложения / Ед.: Е. Кътър, А. Сулаквелидзе. М.: Научен свят. 2012 г.
2. Стент Г., Калиндар Р. Молекулярна генетика. М.: Мир. 1974. 614 стр.
3. Тикунова Н. В., Морозова В. В. Фагов дисплей на базата на нишковидни бактериофаги: приложение за селекция на рекомбинантни антитела // Acta Naturae. 2009. № 3. C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Бактериофаг: генетика и молекулярна биология. Horizon Scientific Press, 2007.