Faagide praktiline rakendamine. Bakteriofaagid: rakenduse kaasaegsed aspektid, tulevikuväljavaated

Bakteriofaagide kui Vira kuningriigi esindajate eristavad omadused. Virulentsed faagid, interaktsiooni etapid bakterirakuga. Praktiline kasutamine bakteriofaagid

Virulentsed faagid põhjustavad produktiivne infektsioon, mille käigus toimub faagide paljunemine ja bakteriraku lüüs.

Virulentse faagi ja mikroobiraku interaktsiooni mehhanism:

1. Faagi adsorptsioon tundlikel rakkudel. Tekib komplementaarsete retseptorite juuresolekul bakterite rakuseinas ja faagiprotsessi filamentide otstes. Esiteks kinnitatakse faag niitide abil ja seejärel banaalse plaadi hammaste abil kindlalt rakuseina külge.

2. Faagi DNA sisenemine bakterirakku. Banaalses plaadis paikneva lüsosüümi abil hüdrolüüsitakse osa rakuseinast, protsessi kest väheneb ja sisemine varras läbistatakse rakumembraaniga. Faagi DNA molekul siseneb varda kanali kaudu rakku.

3. Intratsellulaarsete faagide areng. Faas-DNA toob geneetilise teabe bakterirakku. Toimub paljunemiseks vajalike komponentide biosüntees. peal varajased staadiumid Sünteesitakse "varajased valgud" - ensüümid, mis replitseerivad faagi DNA-d, et moodustada sellest palju koopiaid. Siis edasi rakulised ribosoomid moodustuvad struktuursed "hilised valgud".

4. Faagi morfogenees. Faagi küpsemine toimub raku erinevates osades kolme sõltumatu haru kaudu, mis on dissotsieerunud protsess. Eraldi moodustuvad faagipead – DNA molekuli ümber ehitatakse kapsiid. Sõltumatult ehitatakse protsessi üles. Protsessi filamendid sünteesitakse eraldi. Seejärel ühendatakse kõik faagi koostisosad virioonideks.

5. Bakteriraku lüüs ja faagi vabanemine. Lüüsimine toimub lüsosüümi toimel. Väljuge pungudes.

Bakteriofaagide range spetsiifilisus võimaldab neid kasutada faagide tüpiseerimiseks ja bakterikultuuride diferentseerimiseks, samuti väliskeskkonnas, näiteks veekogudes, näidamiseks.

Mikrobioloogilises praktikas kasutatakse laialdaselt bakterite faagitüübi määramise meetodit. See võimaldab mitte ainult määrata uuritava kultuuri liigilist kuuluvust, vaid ka selle fagotüüpi (fagovar). See on tingitud asjaolust, et sama liigi bakteritel on retseptorid, mis adsorbeerivad rangelt määratletud faage, mis seejärel põhjustavad nende lüüsi. Selliste tüübispetsiifiliste faagide komplektide kasutamine võimaldab uuritud kultuuride faagide tüpiseerimist nakkushaiguste epidemioloogilise analüüsi eesmärgil: (nakkuse allika ja selle edasikandumise viiside kindlaksmääramine)

II. Faage kasutatakse nakkushaiguste ennetamiseks ja raviks:

a) faagi profülaktika- meetod teatud arengu ennetamiseks bakteriaalsed infektsioonid spetsiifilise bakteriofaagi allaneelamisel. Kasutatakse koolera, düsenteeria, kõhutüüfuse jne ennetamiseks.

b) faagiteraapia on meetod bakteriaalsete infektsioonide raviks konkreetse faagi allaneelamise teel.(tüüfus, salmonella, düsenteeria, proteus, pseudomonas, stafülokokk, streptokokk, koli-faag ja kombineeritud ravimid. Neid kasutatakse ülaltoodud mikroorganismide põhjustatud nakkushaiguste ravis, samuti haava- ja anaeroobsete infektsioonide ravis.)

Genotüübi varieeruvus

Patogeensus -

Adhesioon

Invasioon

Agressioon.

4. Prokarüootide geneetilise aparaadi ehitus. Fenotüübiline ja genotüübiline varieeruvus. Bakterite patogeensuse geneetilised alused.

Prokarüootide geneetiline aparaat- ei oma tuumaümbrist ja seda esindab üks ringikujuline DNA molekul, milleks on kromosoom; asub tsütoplasmas, ei sisalda histooni valke. Ei ole võimeline mitoosiks

Fenotüübiline varieeruvus - modifikatsioonid (muutused rohkem kui ühes või mitmes tunnuses) – ei mõjuta genotüüpi. Fenotüübilised muutused toimuvad keskkonnategurite mõjul.Modifikatsioonid mõjutavad enamikku populatsiooni isendeid. Need ei ole päritud ja tuhmuvad aja jooksul, st naasevad algse fenotüübi juurde.

Genotüübi varieeruvus- bakterite omaduste muutmine, nende genotüübi mõjutamine. See on päritav, see on pikaajaline. Tekib mutatsioonide või geneetilise vahetuse (transformatsioon, konjugatsioon või transduktsioon) tulemusena

Patogeensus - liigitunnus, mis on pärilik, fikseeritud mikroorganismi genoomis, s.t see on genotüübiline tunnus, mis peegeldab mikroorganismi potentsiaalset võimet tungida makroorganismi ja selles paljuneda (invasiivsus), põhjustada kompleksi. patoloogilised protsessid mis tekivad haiguse ajal.

Patogeensustegurid hõlmavad mikroorganismide võimet kinnituda rakkude külge (adhesioon), settida nende pinnale (kolonisatsioon), tungida rakkudesse (invasioon) ja seista vastu organismi kaitseteguritele (agressioon).

Mõnda neist kodeerivad otseselt nukleoidgeenid (näiteks kapsel ja mõne liigi ensüümid). Teist osa kodeerivad pärilikkuse ekstrakromosomaalsed tegurid – plasmiidid ja episoomid. Plasmiidgeenid määravad tavaliselt patogeenide interaktsiooni epiteeliga, kromosomaalsed geenid aga bakterite rakuvälise olemasolu ja paljunemise elundites ja kudedes.

Adhesioon Struktuure, mis vastutavad mikroorganismi sidumise eest rakuga, nimetatakse adhesiinideks ja need paiknevad selle pinnal.Gramnegatiivsetel bakteritel tekib adhesioon pili I ja üldised tüübid. Grampositiivsetes bakterites on adhesiinid rakuseina valgud ja teikhoiinhapped. Teistes mikroorganismides täidavad seda funktsiooni rakusüsteemi erinevad struktuurid: pinnavalgud, lipopolüsahhariidid jne.

Invasioon ensüüm hüaluronidaas lagundab rakkudevahelise aine hulka kuuluvat hüaluroonhapet ja suurendab seeläbi limaskestade ja sidekoe läbilaskvust. Neuraminidaas lagundab neuramiinhapet, mis on osa limaskestade rakkude pinnaretseptoritest, mis aitab kaasa patogeeni tungimisele kudedesse.

Agressioon Agressioonifaktoriteks on: proteaasid – ensüümid, mis hävitavad immunoglobuliine; koagulaas - ensüüm, mis koaguleerib vereplasma; fibrinolüsiin - lahustav fibriini tromb; letsitinaas - ensüüm, mis toimib lihaskiudude, erütrotsüütide ja teiste rakkude membraanide fosfolipiididel .

Faagide praktiline rakendamine. Bakteriofaage kasutatakse infektsioonide laboratoorsel diagnoosimisel bakterite spetsiifilisel tuvastamisel, st fagovari (faagi tüübi) määramisel. Selleks kasutatakse faagide tüpiseerimise meetodit, mis põhineb faagide toime rangel spetsiifilisusel: erinevate diagnostiliste tüübispetsiifiliste faagide tilgad kantakse tassile tiheda toitesöötmega, millele on külvatud puhaskultuuri "muru". patogeenist. Bakteri faagifaag määratakse selle lüüsi põhjustanud faagi tüübi järgi (steriilse laigu, "naastu" või "negatiivse koloonia", faagi moodustumine). Faagi tüpiseerimise tehnikat kasutatakse nakkuse allika ja levikuviiside tuvastamiseks (epidemioloogiline märgistus). Sama fagovari bakterite eraldamine erinevatest patsientidest viitab nende ühisele nakkusallikale.

Faage kasutatakse ka mitmete bakteriaalsete infektsioonide raviks ja ennetamiseks. Nad toodavad tüüfuse, salmonella, düsenteeria, pseudomonase, stafülokoki, streptokoki faage ja kombineeritud preparaadid(koliproteiin, püobakteriofaagid jne). Bakteriofaagid määratakse vastavalt näidustustele suukaudselt, parenteraalselt või paikselt vedelate, tablettide, suposiitide või aerosoolide kujul.

Bakteriofaage kasutatakse laialdaselt geenitehnoloogia ja biotehnoloogia kui vektorid rekombinantse DNA saamiseks.

Praktikas kasutatavad bakteriofaagipreparaadid on faagi poolt lüüsitud vastavate mikroobide puljongikultuuri filtraat, mis sisaldab elusfaagi osakesi, aga ka nende lüüsimise käigus bakterirakkudest eraldunud lahustunud bakteriantigeene. Saadud preparaat – vedel bakteriofaag peaks nägema välja nagu täiesti läbipaistev kollane suurema või väiksema intensiivsusega vedelik.

Terapeutilistel ja profülaktilistel eesmärkidel võib faage valmistada happekindla kattega tablettidena. Tabletitud kuivfaag on ladustamise ajal stabiilsem ja mugavam kasutada. Üks tablett kuiva bakteriofaagi vastab 20-25 ml-le vedel preparaat. Kuiva ja vedela preparaadi säilivusaeg on 1 aasta. Vedelat bakteriofaagi tuleb hoida temperatuuril + 2 +10 C, kuivas - mitte kõrgemal kui +1 ° C, kuid seda võib hoida külmkapis ka negatiivsel temperatuuril.

Suukaudselt manustatud bakteriofaag püsib organismis 5-7 päeva. Reeglina ei kaasne bakteriofaagi võtmisega mingeid reaktsioone ega tüsistusi. Vastunäidustused vastuvõtmiseks puuduvad. Neid kasutatakse niisutamise, loputamise, losjoonide, tampoonide, süstide kujul ning süstitakse ka õõnsustesse - kõhu-, pleura-, liigese- ja põis, olenevalt patogeeni asukohast.

Diagnostilisi faage toodetakse nii vedelal kui ka kuival kujul ampullides Enne töö alustamist lahjendatakse kuiv bakteriofaag. Kui ampullidele on märgitud tiiter, tr, DRT (working titer dose), kasutatakse seda faagi lisability testis (Otto meetod) bakterite tuvastamiseks, kui on näidatud faagi tüüp, siis faagi tüpiseerimisel - allika määramiseks. infektsioonist.

Bakteriofaagi toime mikroobikultuurile vedelas keskkonnas ja tihedal söötmel

Otto meetod (kukkuv tilk)

Tehke uuritavast kultuurist tihe külvimuru. 5-10 minutit pärast külvi kantakse toitekeskkonna kuivatatud pinnale vedel diagnostiline faag. Nõu kallutatakse veidi, nii et faagi tilk levib agari pinnale. Tass asetatakse 18-24 tunniks termostaadi. Tulemust arvestatakse täielik puudumine kultuuri kasv faagi tilkade pealekandmise kohas.

Katsetage vedelal toitainekeskkonnal

Tehke uuritud kultuuri külvamine vedela söötmega kahte katseklaasi. Diagnostiline bakteriofaag lisatakse silmusena ühte katseklaasi (“O”). Pärast 18-20 tundi katseklaasis, kuhu bakteriofaagi ei lisatud (“K”), täheldatakse puljongi tugevat hägusust - külvatud kultuur on kasvanud. Katseklaasis olnud puljong, kuhu bakteriofaag lisati, jäi selle mõju all oleva kultuuri lüüsi tõttu läbipaistvaks.

Bakterite faagitüüpimine

Toimespektri järgi eristatakse järgmisi bakteriofaage: polüvalentsed, lüüsiga seotud bakteritüübid; teatud tüüpi monovalentsed, lüüsivad bakterid; tüüpilised, lüüsivad bakterite üksikud tüübid (variandid).

Näiteks võib ühte patogeense stafülokoki tüve lüüsida mitut tüüpi faagide poolt, seetõttu on kõik tüüpilised faagid (24) ja patogeensete stafülokokkide tüved ühendatud 4 rühma.

Faagide tüpiseerimise meetodil on suur tähtsus epidemioloogilisteks uuringuteks, kuna see võimaldab kindlaks teha patogeenide allika ja leviku viise. Sel eesmärgil määratakse patoloogilisest materjalist eraldatud puhaskultuuri fagovar tihedal toitainekeskkonnal, kasutades tüüpilisi diagnostilisi faage.

Mikroobikultuuri fagovar määratakse selle lüüsi põhjustanud faagi tüübi järgi.Ühe fagovari bakterite eraldamine erinevatest katsealustest näitab nakkusallikat.

Faagipreparaate kasutatakse nakkushaiguste raviks ja profülaktikaks, samuti diagnostikas - faagide tundlikkuse ja faagitüübi määramiseks mikroorganismide tuvastamisel. Faagide toime põhineb nende rangel spetsiifilisusel. Faagide terapeutiline ja profülaktiline toime tuleneb faagi enda lüütilisest aktiivsusest, samuti fagolüsaatides olevate hävitatud mikroobirakkude komponentide (antigeenide) immuniseerivast omadusest, eriti korduva kasutamise korral. Faagipreparaatide vastuvõtmisel kasutatakse faagide tõestatud tootmistüvesid ja vastavalt tüüpilisi mikroorganismide kultuure. Vedelas toitekeskkonnas olev bakterikultuur, mis on paljunemise logaritmilises faasis, nakatatakse faagi emasuspensiooniga.

Faagiga lüüsitud kultuur (tavaliselt järgmisel päeval) filtreeritakse läbi bakterifiltrite ja faagi sisaldavale filtraadile lisatakse säilitusainena kinosooli lahust.
Valmis faagipreparaat on selge vedelik kollakas värvus. Pikemaks säilitamiseks on mõned faagid saadaval kuivas vormis (tablettides). Sooleinfektsioonide ravis ja ennetamisel kasutatakse faage samaaegselt naatriumvesinikkarbonaadi lahusega, kuna mao happeline sisu hävitab faagi. Faag ei ​​püsi kehas kaua (5-7 päeva), mistõttu on soovitatav uuesti manustada.

Nõukogude Liidus toodeti haiguste raviks ja ennetamiseks järgmisi ravimeid: tüüfus, salmo-pella, düsenteeria, kolifaag, stafülokoki faag ja streptokokk. Praegu kasutatakse faage raviks ja profülaktikaks koos antibiootikumidega. Sellel rakendusel on tõhusam toime antibiootikumiresistentsetele bakterivormidele.

Diagnostilisi bakteriofaage kasutatakse laialdaselt patsiendilt või nakatunud keskkonnaobjektidelt eraldatud bakterite tuvastamiseks. Bakteriofaagide abil on nende kõrge spetsiifilisuse tõttu võimalik määrata bakteritüüpe ja suurema täpsusega ka üksikuid isoleeritud bakterite liike. Välja on töötatud Salmonella, Vibrio ja stafülokokkide perekonda kuuluvate bakterite faagidiagnostika ja faagitüübi määramine. Faagide tüpiseerimine aitab kindlaks teha nakkuse allika, uurida epidemioloogilisi seoseid ning teha vahet sporaadilistel ja epideemilistel haigusjuhtudel.
Faagide diagnostika ja faagide tüpiseerimine põhineb isoleeritud mikroorganismi kooskasvatamise põhimõttel vastava liigi või tüübi faagidega. positiivne tulemus arvestatakse uuritud kultuuri selgelt väljendunud lüüsi olemasolu liigifaagiga ja seejärel ühe tüüpilise faagiga.

CM. ZAKHARENKO, meditsiiniteaduste kandidaat, dotsent, Sõjaväe-meditsiini akadeemia neid. CM. Kirov, Peterburi

Bakteriofaagid on unikaalsed mikroorganismid, mille põhjal on nende omaduste ja omaduste poolest loodud spetsiaalne ravi- ja profülaktiliste ravimite rühm. Faagide ja bakterite vahelise interaktsiooni loomulikud füsioloogilised mehhanismid, mis on nende toime aluseks, võimaldavad ennustada lõpmatut hulka nii bakteriofaage endid kui ka võimalikud viisid nende rakendusi. Bakteriofaagide kollektsioonide laienedes ilmnevad kahtlemata uued sihtpatogeenid ning laieneb haiguste hulk, mille puhul faage saab kasutada nii monoteraapiana kui ka kompleksravi osana.

Jah, kasuta polüvalentne püobakteriofaag Sekstafaag nakatunud pankrease nekroosi ravis (akadeemik E. A. Wagneri nimeline Permi osariigi meditsiiniakadeemia) võimaldas kiiresti taastada homöostaasi peamised parameetrid ning patsientide elundite ja süsteemide funktsioonid. Oluliselt vähenes ka postoperatiivsete tüsistuste ja surmade arv: standardravi saanud patsientide rühmas oli suremus 100%, BF-i saanud trupis aga 16,6%.

BF-i preparaatide kahjutuse ja reaktogeensuse tõttu on neid võimalik kasutada pediaatrilises praktikas, sealhulgas vastsündinutel. Huvitav on Nižni Novgorodi laste piirkondliku kliinilise haigla kogemus, kus epidemioloogilise olukorra komplikatsiooni perioodil kasutati koos tavaliste epideemiavastaste meetmetega BP - Intesti-bakteriofaagi ja BP Pseucfomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa nosokomiaalse infektsiooni esinemissageduse 11-kordne vähenemine näitas BP kasutamise kõrget efektiivsust. BF-i preparaate võib määrata nii düsbakterioosi kui ka häirete raviks seedeelundkond ja limaskestade koloniseerumise vältimiseks seedetrakti oportunistlikud bakterid. BF-i mitmekomponentsed preparaadid sobivad ideaalselt esimeste seedetrakti häirete sümptomite koheseks leevendamiseks.

Tänaseks on ettevõte kavandanud mitmeid prioriteetsed valdkonnad terapeutiliste ja profülaktiliste bakteriofaagide väljatöötamine ja tootmine, mis on korrelatsioonis äsja esilekerkivate globaalsete suundumustega. Luuakse ja juurutatakse uusi preparaate: välja on töötatud hammaste ja enterobakterite vastane BF, käimas on Helicobacter pylori vastase faagipreparaadi loomine.

Ainult üks nende ravimite tootja - NPO Microgen, toodab teaduse ja innovaatilise arengu osakonna juhataja asetäitja Alla Lobastova aruande kohaselt aastas üle 2 miljoni pakendi. Kahjuks pole paljude arstide ideed bakteriofaagide kohta kaugeltki objektiivsed. Vähesed inimesed teavad, et sama patogeeni vastu aktiivsed bakteriofaagid võivad kuuluda erinevatesse perekondadesse, olla erineva elutsükliga jne. Näiteks P. aeruginosa bakteriofaagid kuuluvad perekondadesse Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, eluring või mõõdukas. Sama patogeeni erinevatel tüvedel võib olla erinev tundlikkus bakteriofaagide suhtes. Enamik eksperte teab (kuulnud, keegi kasutas) bakteriofaagide terapeutiliste ja profülaktiliste preparaatide vedelate ja tablettide ravimvormide olemasolust. Kuid nende spekter on palju laiem, mida võib seostada tingimusteta eelistega, eriti kombinatsioonis mitmesuguste manustamisviisidega (allaneelamine, manustamine klistiirides, aplikatsioonid, haavade ja limaskestade niisutamine, haavaõõnsustesse viimine jne). . Bakteriofaagide ilmsed eelised hõlmavad traditsiooniliselt spetsiifilist toimet üsna piiratud bakterite populatsioonile, piiratud aja olemasolu (kuni mikroorganismide sihtpopulatsiooni kaob), selliste bakterite puudumist. kõrvalmõjud kui mürgine ja allergilised reaktsioonid, düsbiootilised reaktsioonid jne Neid ravimeid saab kasutada mitmesuguste vanuserühmad ja raseduse ajal. Bakteriofaagid ise ei ole olulised allergeenid. Bakteriofaagipreparaatide talumatuse juhud on enamasti seotud reaktsiooniga toitainekeskkonna komponentidele. Kõik selle ravimirühma suuremad tootjad püüdlevad kasutatavate komponentide maksimaalse kvaliteedi poole, mis vähendab selliste reaktsioonide tõenäosust. Kasvava antibiootikumiresistentsuse kontekstis teevad mõned autorid ettepaneku käsitleda bakteriofaage kui parim alternatiiv antibiootikumid. Bakteriofaagide terapeutilised ja profülaktilised preparaadid on spetsiaalselt valitud kombinatsioonide kokteil (polüklonaalsete kõrge virulentsete bakteriviiruste kompleks, mis on spetsiaalselt valitud bakteriaalsete infektsioonide levinumate patogeenide rühmade vastu), mis põhineb tootja faagikollektsioonidel. Föderaalse riikliku ühtse ettevõtte NPO Microgen filiaalid Ufas, Permis ja Nižni Novgorodis on selliste ravimite kaasaegsed tootmiskeskused. Võimalus luua kohandatud patogeensed mikroorganismid Bakteriofaagide terapeutilised ja profülaktilised preparaadid on selle preparaatide rühma teine ​​suur eelis. Bakterite resistentsuse kasv antimikroobsete ravimite suhtes ja tänapäevaste nakkushaiguste sageli esinev polüetioloogia nõuavad kombineeritud antibiootikumravi (kaks, kolm ja mõnikord rohkem antimikroobsed ained). Valiku jaoks tõhus skeem antibiootikumravi puhul tuleb lisaks bakterite tegelikule tundlikkusele ravimi suhtes arvestada piisavalt suur number tegurid. Faagiteraapial on ka selles osas teatud eelised. Ühest küljest ei kaasne bakteriofaagide kombinatsiooni kasutamisega nende omavaheline koostoime ja see ei too kaasa muutusi nende kasutusskeemides. Olemasolevas terapeutiliste bakteriofaagide komplektis on mitmeid hästi tõestatud kombinatsioone - bakteriofaag coliproteus, püobakteriofaag polüvalentne, intesti-bakteriofaag. Teisest küljest bakterid seda ei tee ühised mehhanismid resistentsus antibiootikumide ja faagide suhtes, seetõttu saab neid kasutada nii siis, kui patogeen on ühe ravimi suhtes resistentne, kui ka kombinatsioonis "antibiootikum + bakteriofaag". See kombinatsioon on eriti tõhus mikroobide biokilede hävitamiseks. Eksperiment näitab seda veenvalt kombineeritud rakendus raua antagonistid ja bakteriofaag võivad häirida Klebsiella pneumoniae biokilede moodustumist. Samal ajal märgitakse nii mikroobipopulatsioonide arvu olulist vähenemist kui ka "noorte" rakkude arvu vähenemist. Üks veel oluline omadus Bakteriofaagide toime on selline nähtus nagu apoptoosi esilekutsumine. Mõnel E. coli tüvel on geenid, mis põhjustavad rakusurma pärast T4 bakteriofaagi sisestamist. Seega, vastuseks T4 faagi hiliste geenide ekspressioonile blokeerib lit geen (kodeerib proteaasi, mis hävitab valgusünteesiks vajaliku EF-Tu elongatsioonifaktori) kõigi rakuvalkude sünteesi. PrrC geen kodeerib nukleaasi, mis lõikab lüsiini tRNA-d. Nukleaasi aktiveerib T4 faagi stp geeni saadus. T4-faagiga nakatunud rakkudes põhjustavad rex-geenid (mis kuuluvad faagi genoomi ja ekspresseeritakse lüsogeensetes rakkudes) ioonikanalite moodustumist, mis viib elutähtsate ioonide kadumiseni rakkude poolt ja seejärel surmani. T4 faag ise võib takistada rakusurma, sulgedes kanalid oma valkude, rII geenide produktidega. Bakterite resistentsuse kujunemisel antibiootikumi suhtes tuleb otsida uusi võimalusi aktiivse molekuli või põhimõtteliselt uute ainete muutmiseks. Kahjuks eest viimased aastad uute antibiootikumide kasutuselevõtu tempo on oluliselt aeglustunud. Bakteriofaagidega on olukord põhimõtteliselt erinev. Suurte tootjate kollektsioonides on kümneid valmis bakteriofaagi tüvesid ning neid täiendatakse pidevalt uute aktiivsete faagidega. Isoleeritud patogeenide bakteriofaagide suhtes tundlikkuse pideva jälgimise tõttu kohandavad tootjad piirkondadesse tarnitavaid faagi koostisi. Tänu kohandatud bakteriofaagidele on võimalik kõrvaldada antibiootikumiresistentsete tüvede põhjustatud haiglanakkuste puhanguid.

Kell suukaudne tarbimine bakteriofaagid jõuavad kiiresti nakkuse lokaliseerimise koldesse: mäda-põletikuliste haigustega patsientidel suukaudsel manustamisel satuvad faagid verre tunni aja pärast, 1–1,5 tunni pärast tuvastatakse need bronhopulmonaalsest eksudaadist ja põletushaavade pinnalt, 2 pärast tundi - uriinist ja ka traumaatilise ajukahjustusega patsientide tserebrospinaalvedelikust.

Seega on bakteriofaagid unikaalsed mikroorganismid, mille põhjal on nende omaduste ja omaduste poolest loodud spetsiaalne ravi- ja profülaktiliste preparaatide rühm. Faagide ja bakterite vahelise koostoime loomulikud füsioloogilised mehhanismid, mis on nende toime aluseks, võimaldavad ennustada mõlema bakteriofaagi enda ja nende võimalike kasutusviiside lõpmatut mitmekesisust. Bakteriofaagide kollektsioonide laienedes ilmnevad kahtlemata uued sihtpatogeenid ning laieneb haiguste hulk, mille puhul faage saab kasutada nii monoteraapiana kui ka kompleksravi osana. Kaasaegne võte edasine saatus faagiteraapia peaks põhinema nii nende toime kõrgel spetsiifilisusel kui ka vajadusel järgida rangelt kõiki faagiteraapia reegleid. Bakteriofaagide vastandamine mis tahes etiotroopse ravi vahenditega on ekslik.

Eelmise sajandi keskel astus bioloogiateadus pöördelise sammu edasi, luues elussüsteemide toimimiseks molekulaarse aluse. Pärilike molekulide keemilise olemuse kindlaksmääramise, geneetilise koodi dekodeerimise ja geenimanipulatsiooni tehnoloogiate loomiseni viinud edukas uurimistöös oli tohutu roll eelmise sajandi alguses avastatud bakteriofaagidel. Praeguseks on need bakteriaalsed viirused omandanud palju inimestele kasulikke "kutsealasid": neid kasutatakse mitte ainult ohutute antibakteriaalsete ravimitena, vaid ka desinfektsioonivahenditena ja isegi elektrooniliste nanoseadmete loomise alusena.

Kui 1930. a rühm teadlasi võttis käsile elussüsteemide toimimise probleemid, seejärel pöörasid nad lihtsamaid mudeleid otsides tähelepanu bakteriofaagid- bakteriaalsed viirused. Lõppude lõpuks pole bioloogiliste objektide hulgas midagi lihtsamat kui bakteriofaagid, pealegi saab neid lihtsalt ja kiiresti kasvatada ja analüüsida ning viiruste geneetilised programmid on väikesed.

Faag on minimaalse suurusega looduslik struktuur, mis sisaldab tihedalt pakitud geneetilist programmi (DNA või RNA), milles pole midagi üleliigset. See programm on suletud valgukestasse, mis on varustatud minimaalse seadmete komplektiga selle bakterirakku viimiseks. Bakteriofaagid ei saa ise paljuneda ja selles mõttes ei saa neid pidada täisväärtuslikeks elusobjektideks. Nende geenid hakkavad töötama ainult bakterites, kasutades selleks bakterirakus olemasolevaid biosünteetilisi süsteeme ja sünteesiks vajalikke molekulide varusid. Kuid nende viiruste geneetilised programmid ei erine põhimõtteliselt keerukamate organismide programmidest, nii et katsed bakteriofaagidega võimaldasid kindlaks teha aluspõhimõtted genoomi struktuur ja toimimine.

Hiljem said need teadmised ja uurimistöö käigus välja töötatud meetodid aluseks bioloogia- ja arstiteaduse arengule ning laiaulatuslikele biotehnoloogilistele rakendustele.

Võitlejad patogeenide vastu

Esimesed katsed kasutada bakteriofaage nakkushaiguste raviks tehti peaaegu kohe pärast nende avastamist, kuid teadmiste puudumine ja tolleaegsed ebatäiuslikud biotehnoloogiad ei võimaldanud neil täit edu saavutada. Sellegipoolest näitas edasine kliiniline praktika bakteriofaagide eduka kasutamise põhimõttelist võimalust nakkushaigused seedetrakt, urogenitaalsüsteem, patsientide ägedate mäda-septiliste seisundite korral, kirurgiliste infektsioonide raviks jne.

Võrreldes antibiootikumidega on bakteriofaagidel mitmeid eeliseid: nad ei põhjusta kõrvalnähte, pealegi on nad rangelt spetsiifilised teatud tüüpi bakteritele, mistõttu nende kasutamisel inimese normaalne mikrobioom ei häiri. Probleeme tekitab aga ka selline kõrge selektiivsus: patsiendi edukaks raviks on vaja täpselt teada nakkustekitajat ja valida bakteriofaag individuaalselt.

Faage võib kasutada ka profülaktiliselt. Näiteks Moskva epidemioloogia ja mikrobioloogia uurimisinstituut. G. N. Gabrichevsky töötas välja bakteriofaagide kokteilil põhineva profülaktilise toote "FOODFAG", mis vähendab ägeda infektsiooni riski. sooleinfektsioonid. Kliinilised uuringud on näidanud, et iganädalane ravimi tarbimine võimaldab teil vabaneda hemolüüsivast Escherichia colist ja muudest patogeensetest ja oportunistlikud bakterid põhjustab soole düsbioosi.

Bakteriofaagid ravivad mitte ainult inimeste, vaid ka kodu- ja põllumajandusloomade nakkushaigusi: lehmade mastiiti, vasikatel ja sigadel koli- ja escherichioos, kanade salmonelloosi... Eriti mugav on faagipreparaate kasutada vesiviljelusel – tööstuslikult kasvatatud kalade ja krevettide töötlemine, sest need püsivad vees kaua. Bakteriofaagid aitavad ka taimi kaitsta, kuigi faagitehnoloogiate kasutamine on sel juhul mõju tõttu keeruline looduslikud tegurid, nagu päikesevalgus ja vihm, on viirustele kahjulikud.

Faagidel võib olla suur roll toidu mikrobioloogilise ohutuse säilitamisel, kuna antibiootikumide ja keemiliste ainete kasutamine toiduainetööstuses seda probleemi ei lahenda, samas vähendab toodete keskkonnasõbralikkuse taset. Probleemi enda tõsidusest annab tunnistust statistika: näiteks USA-s ja Venemaal registreeritakse aastas kuni 40 tuhat salmonelloosijuhtu, millest 1% sureb. Selle nakkuse levikut seostatakse suures osas eri tüüpi kodulindude kasvatamise, töötlemise ja tarbimisega ning katsed kasutada selle vastu võitlemiseks bakteriofaage on andnud paljulubavaid tulemusi.

Jah, Ameerika ettevõte Intralytix toodab faagipreparaate listerioosi, salmonelloosi ja Escherichia coli bakteriaalse saastumise vastu võitlemiseks. Need on heaks kiidetud kasutamiseks lisaainetena, mis takistavad bakterite kasvu toidul – neid pihustatakse liha- ja linnulihatoodetele, samuti juur- ja puuviljadele. Katsed on näidanud, et bakteriofaagide kokteili saab edukalt kasutada ka elusate tiigikalade transpordil ja müügil, et vähendada mitte ainult vee, vaid ka kala enda bakteriaalset saastumist.

Bakteriofaagide ilmne rakendus on desinfitseerimine, see tähendab bakterite hävitamist kohtades, kus neid ei tohiks olla: haiglates, edasi toiduainete tootmine jne Selleks Briti firma Fikseeritud faag töötas välja meetodi faagipreparaatide pindadele kinnitamiseks, mis tagab säilivuse bioloogiline aktiivsus faagid kuni kolm aastat.

Bakteriofaagid - molekulaarbioloogia "Drosophila".

1946. aastal kuulutati 11. sümpoosionil kuulsas Ameerika laboris Cold Spring Harboris välja teooria "üks geen – üks ensüüm". Bakterioloog A. Hershey ja "endine" füüsik, molekulaarbioloog M. Delbrück teatasid geneetiliste tunnuste vahetusest erinevate faagide vahel, nakatades samal ajal Escherichia coli rakke. See avastus, mis tehti ajal, mil geeni füüsiline kandja polnud veel teada, andis tunnistust, et "rekombinatsiooni" fenomen – geneetiliste tunnuste segunemine on iseloomulik mitte ainult kõrgematele organismidele, vaid ka viirustele. Selle nähtuse avastamine võimaldas hiljem üksikasjalikult uurida replikatsiooni molekulaarseid mehhanisme. Hiljem võimaldasid katsed bakteriofaagidega paika panna geneetiliste programmide ülesehituse ja toimimise põhimõtted.

1952. aastal tõestasid A. Hershey ja M. Chase eksperimentaalselt, et bakteriofaagi T2 pärilik informatsioon ei ole kodeeritud valkudes, nagu paljud teadlased arvasid, vaid DNA molekulides (Hershey & Chase, 1952). Teadlased jälgisid paljunemisprotsessi kahes bakteriofaagirühmas, millest üks kandis radioaktiivselt märgistatud valke ja teine ​​DNA molekule. Pärast bakterite nakatamist selliste faagidega selgus, et nakatunud rakku edastatakse ainult viiruse DNA, mis oli tõendiks selle rolli kohta päriliku teabe säilitamisel ja edastamisel.

Samal aastal leidsid Ameerika geneetikud D. Lederberg ja N. Zindler kahe Salmonella tüve ja P22 bakteriofaagiga tehtud katses, et bakteriofaag on võimeline paljunemise ajal kaasama peremeesbakteri DNA fragmente ja kandma need edasi teistele bakteritele. nakatumisel (Zinder & Lederberg, 1952). Seda geeniülekande nähtust doonorbakterilt retsipientbakterile on nimetatud "transduktsiooniks". Katse tulemused said järjekordseks kinnituseks DNA rolli kohta päriliku teabe edastamisel.

1969. aastal said A. Hershey, M. Delbrück ja nende kolleeg S. Luria Nobeli preemia laureaatideks "avastuste eest, mis puudutavad viiruste replikatsioonimehhanismi ja geneetilist struktuuri".

1972. aastal, uurides E. coli DNA replikatsiooni (rakulise teabe kopeerimise) protsessi, kasutasid R. Bird ja kolleegid bakteriofaage sondidena, mis on võimelised integreeruma bakteriraku genoomi ja leidsid, et replikatsiooniprotsess kulgeb mööda kromosoomi kahes suunas. (Stent, 1974).

Seitse päeva loomist

Kaasaegsed sünteetilise bioloogia meetodid võimaldavad mitte ainult faagigenoomides teha mitmesuguseid modifikatsioone, vaid ka luua täiesti kunstlikke aktiivseid faage. Tehnoloogiliselt pole see keeruline, tuleb lihtsalt sünteesida faagi genoom ja viia see bakterirakku ning seal käivitatakse kõik valkude sünteesiks ja uute faagiosakeste kokkupanemiseks vajalikud protsessid. Kaasaegsetes laborites võtab see töö aega vaid paar päeva.

Faagide spetsiifilisuse muutmiseks ja nende efektiivsuse suurendamiseks kasutatakse geneetilisi modifikatsioone. terapeutiline toime. Selleks on kõige agressiivsemad faagid varustatud äratundmisstruktuuridega, mis seovad need sihtbakteritega. Samuti sisestatakse viiruse genoomi täiendavalt geenid, mis kodeerivad bakteritele toksilisi valke, mis häirivad ainevahetust – sellised faagid on bakteritele surmavamad.

Bakteritel on antibiootikumide ja bakteriofaagide vastu mitu kaitsemehhanismi, millest üks on viiruse genoomide hävitamine. restriktsiooniensüümid toimides spetsiifilistele nukleotiidjärjestustele. Faagide terapeutilise aktiivsuse suurendamiseks saab geneetilise koodi degeneratsiooni tõttu nende geenide järjestusi "ümber vormindada" selliselt, et minimeerida ensüümide suhtes "tundlike" nukleotiidjärjestuste arvu, säilitades samal ajal nende geenide järjestuse. kodeerimise omadused.

Universaalne viis bakterite kaitsmiseks kõigi välismõjude eest – nn biofilmid, DNA, polüsahhariidide ja valkude kiled, mida bakterid koos loovad ja kuhu ei tungi ei antibiootikumid ega ravivalgud. Sellised biofilmid on peavalu arstid, kuna need aitavad kaasa hambaemaili hävitamisele, moodustuvad implantaatide, kateetrite, tehisliigeste pinnale ja ka hingamisteed, naha pinnal jne. Biokilede vastu võitlemiseks konstrueeriti spetsiaalsed bakteriofaagid, mis sisaldasid geeni, mis kodeerib spetsiaalset lüütilist ensüümi, mis hävitab bakteripolümeere.

Ensüümid "bakteriofaagist"

Bakteriofaagide uurimise tulemusena avastati suur hulk ensüüme, mida tänapäeval laialdaselt kasutatakse molekulaarbioloogias ja geenitehnoloogias.

Üks selline näide on restriktsiooniensüümid, rühm bakteriaalseid nukleaase, mis lõhustavad DNA-d. Veel 1950. aastate alguses. Leiti, et ühe bakteritüve rakkudest eraldatud bakteriofaagid paljunevad sageli lähedalt seotud tüves halvasti. Selle nähtuse avastamine tähendas, et bakteritel on süsteem viiruste paljunemise pärssimiseks (Luria & Human, 1952). Selle tulemusena avastati ensümaatiline restriktsiooni-modifikatsiooni süsteem, mille abil bakterid hävitasid rakku sattunud võõr-DNA. Restriktsiooniensüümide (restriktsiooni endonukleaaside) eraldamine andis molekulaarbioloogidele hindamatu vahendi DNA-ga manipuleerimiseks: sisestage üks järjestus teise või lõigake välja vajalikud ahelafragmendid, mis lõpuks viis rekombinantse DNA tehnoloogia väljatöötamiseni.

Teine molekulaarbioloogias laialdaselt kasutatav ensüüm on bakteriofaagi T4 DNA ligaas, mis "ristseob" kaheahelaliste DNA ja RNA molekulide "kleepuvad" ja "nürid" otsad. Ja hiljuti on ilmunud selle ensüümi suurema aktiivsusega geneetiliselt muundatud variandid.

Suurem osa laboripraktikas kasutatavatest RNA ligaasidest, mis "õmblevad" üheahelalisi RNA ja DNA molekule, pärinevad samuti bakteriofaagidest. Looduses kasutatakse neid peamiselt purustatud RNA molekulide parandamiseks. Teadlased kasutavad kõige sagedamini bakteriofaagi T4 RNA ligaasi, mis võib nende märgistamiseks RNA molekulidele "õmmelda" üheahelalisi polünukleotiide. Seda tehnikat kasutatakse RNA struktuuri analüüsimiseks, RNA-valgu sidumissaitide otsimiseks, oligonukleotiidide sünteesiks jne. Viimasel ajal on tavapäraselt kasutatavate ensüümide hulgas ilmunud termostabiilsed RNA ligaasid, mis on eraldatud bakteriofaagidest rm378 ja TS2126 (Nordberg Karlsson et al., 2010). Hjorleifsdottir, 2014).

Bakteriofaagidest saadi ka osa teisest ülitähtsate ensüümide rühmast, polümeraasidest. Näiteks väga "täpne" bakteriofaagi T7 DNA polümeraas, mis on leidnud rakendust erinevates molekulaarbioloogia valdkondades, näiteks kohtsuunatud mutagenees, kuid mida kasutatakse peamiselt DNA primaarstruktuuri määramiseks.

On pakutud välja keemiliselt modifitseeritud T7 faagi DNA polümeraas nagu ideaalne tööriist DNA sekveneerimiseks juba 1987. aastal (Tabor & Richardson, 1987). Selle polümeraasi modifitseerimine on suurendanud selle efektiivsust mitu korda: DNA polümerisatsiooni kiirus ulatub sel juhul üle 300 nukleotiidi sekundis, nii et seda saab kasutada suurte DNA fragmentide amplifitseerimiseks. Sellest ensüümist sai sekvenaasi eelkäija, geneetiliselt muundatud ensüüm, mis on optimeeritud DNA sekveneerimiseks Sangeri reaktsioonis. Sequenase on erinev kõrge efektiivsusega ja võime lisada DNA järjestusse nukleotiidi analooge, mida kasutatakse sekveneerimistulemuste parandamiseks.

Bakteriofaagide päritolu on ka peamised molekulaarbioloogias kasutatavad RNA polümeraasid (DNA-sõltuvad RNA polümeraasid) – ensüümid, mis katalüüsivad transkriptsiooniprotsessi (RNA koopiate lugemine DNA matriitsist). Nende hulka kuuluvad SP6, T7 ja T3 RNA polümeraasid, mis on nimetatud vastavate bakteriofaagide SP6, T7 ja T3 järgi. Kõiki neid ensüüme kasutatakse antisenss-RNA transkriptide, märgistatud RNA sondide jne in vitro sünteesiks.

Esimene täielikult sekveneeritud DNA genoom oli φ174 faagi genoom, üle 5000 nukleotiidi pikk (Sanger et al., 1977). Selle dekodeerimise viis läbi rühm inglise biokeemikut F. Sangerit, kes oli kuulsa samanimelise DNA sekveneerimismeetodi looja.

Polünukleotiidkinaasid katalüüsivad fosfaatrühma ülekandumist ATP molekulilt nukleiinhappemolekuli 5'-otsa, 5'-fosfaatrühmade vahetust või mononukleotiidide 3'-otste fosforüülimist. Laboratoorses praktikas kasutatakse kõige laialdasemalt bakteriofaagi T4 polünukleotiidkinaasi. Seda kasutatakse tavaliselt katsetes DNA märgistamiseks fosfori radioaktiivse isotoobiga. Polünukleotiidkinaasi kasutatakse ka restriktsioonisaitide otsimiseks, DNA ja RNA sõrmejälgede võtmiseks, DNA või RNA ligaaside substraatide sünteesiks.

Molekulaarbioloogilistes katsetes kasutatakse bakteriofaagi ensüüme, nagu T4 faagi polünukleotiidkinaas, mida tavaliselt kasutatakse DNA märgistamiseks fosfori radioaktiivse isotoobiga, DNA ja RNA sõrmejälgede võtmist jne, samuti DNA-d lõhustavaid ensüüme, mida kasutatakse üksiku saamiseks. -ahelalised DNA matriitsid, kasutatakse laialdaselt ka molekulaarbioloogilistes katsetes nukleotiidide polümorfismi sekveneerimiseks ja analüüsimiseks.

Sünteetilise bioloogia meetodeid kasutades oli võimalik välja töötada ka bakteriofaage, mis olid relvastatud kõige keerukamate relvadega, mida bakterid faagide endi vastu kasutavad. See on umbes bakteriaalsete CRISPR-Cas süsteemide kohta, mis kujutavad endast DNA-d lõhustava ensüümi nukleaasi ja RNA järjestuse kompleksi, mis suunab selle ensüümi toime viiruse genoomi spetsiifilisele fragmendile. Faagi DNA tükk toimib "osutajana", mille bakter salvestab "mälu jaoks" spetsiaalsesse geeni. Kui sarnane fragment leitakse bakteri seest, hävitab see valgu-nukleotiidi kompleks selle.

Olles välja selgitanud CRISPR-Cas süsteemide töömehhanismi, püüdsid teadlased varustada faagid ise sarnase "relvaga", mille jaoks oli nukleaasi kodeeriv geenide kompleks, mis adresseerib bakteri genoomi teatud piirkondadega komplementaarseid RNA järjestusi. sisestatud nende genoomi. "Sihtmärgiks" võivad olla mitme ravimiresistentsuse eest vastutavad geenid. Katseid kroonis täielik edu – sellised faagid mõjutasid suure efektiivsusega baktereid, millele nad olid "häälestatud".

Faagi antibiootikumid

Terapeutilistel eesmärkidel ei pea faage otseselt kasutama. Bakteriofaagid on miljonite aastate jooksul evolutsiooni käigus välja töötanud spetsiifiliste valkude arsenali – vahendid sihtmärkmikroorganismide äratundmiseks ja ohvri biopolümeeridega manipuleerimiseks, mille põhjal saab luua antibakteriaalseid ravimeid. Seda tüüpi kõige lootustandvamad valgud on endolüsiini ensüümid, mida faagid kasutavad bakterist väljumisel rakuseina hävitamiseks. Iseenesest on need ained võimsad. antibakteriaalsed ained, inimestele mittetoksiline. Nende toime tõhusust ja suunda saab suurendada, muutes neis adresseerimisstruktuure – teatud bakteritega spetsiifiliselt seonduvaid valke.

Enamik baktereid jagunevad rakuseina ehituse järgi grampositiivseteks, mille membraan on kaetud väga paksu peptidoglükaanide kihiga, ja gramnegatiivseteks, mille puhul peptidoglükaanikiht asub kahe membraani vahel. Looduslike endolüsiinide kasutamine on eriti efektiivne grampositiivsete bakterite (stafülokokid, streptokokid jne) puhul, kuna nende peptidoglükaanikiht asub väljaspool. Gramnegatiivsed bakterid (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Escherichia coli jt) on vähem ligipääsetavad sihtmärgid, kuna ensüüm peab läbima bakteri välismembraani, et jõuda sisemise peptidoglükaani kihini.

Selle probleemi lahendamiseks loodi nn artilüsiinid – looduslike endolüsiinide modifitseeritud variandid, mis sisaldavad polükatioonseid või amfipaatilisi peptiide, mis destabiliseerivad välismembraani ja tagavad endolüsiini kohaletoimetamise otse peptidoglükaani kihti. Artilysiinidel on kõrge bakteritsiidne toime ja need on juba osutunud efektiivseks koerte keskkõrvapõletiku ravis (Briers et al., 2014).

Näiteks modifitseeritud endolüsiinist, mis toimib selektiivselt teatud bakteritele, on Kanada ettevõtte ravim P128. Ganga Gen Inc.. See on endolüsiini bioloogiliselt aktiivne fragment, mis on seotud lüsostafiiniga, sihtmärgiks oleva valgu molekuliga, mis seondub stafülokoki rakkude pinnaga. Saadud kimäärsel valgul on kõrge aktiivsus erinevate stafülokoki tüvede, sealhulgas mitme ravimiresistentsuse tüvede vastu.

Bakterite "loendurid".

Bakteriofaagid ei toimi mitte ainult mitmekülgse ravi- ja "desinfitseeriva" vahendina, vaid ka mugava ja täpse analüüsivahendina mikrobioloogile. Näiteks on need oma kõrge spetsiifilisuse tõttu looduslikud analüütilised reaktiivid teatud tüüpi ja tüve bakterite tuvastamiseks.

Sellise uuringu kõige lihtsamas versioonis lisatakse Petri tassile tilkhaaval erinevaid diagnostilisi bakteriofaage koos bakterikultuuriga nakatatud toitekeskkonnaga. Kui bakter osutub faagi suhtes tundlikuks, siis selles bakteriaalse "muru" kohas moodustub "plaak" - läbipaistev ala tapetud ja lüüsitud bakterirakkudega.

Analüüsides faagide paljunemist sihtbakterite juuresolekul, saab kvantifitseerida viimaste arvukuse. Kuna faagiosakeste arv lahuses suureneb proportsionaalselt selles sisalduvate bakterirakkude arvuga, piisab bakteriofaagi tiitri määramisest, et hinnata bakterite arvu.

Sellise analüütilise reaktsiooni spetsiifilisus ja tundlikkus on üsna kõrged ning protseduurid ise on lihtsalt teostatavad ega vaja keerukaid seadmeid. On oluline, et bakteriofaagidel põhinevad diagnostikasüsteemid annaksid signaali elava patogeeni olemasolust, samas kui teised meetodid, nagu PCR ja immunoanalüütilised meetodid, näitavad ainult sellesse bakterisse kuuluvate biopolümeeride olemasolu. Seda tüüpi diagnostikameetodid sobivad eriti hästi kasutamiseks keskkonnauuringutes, samuti toiduainetööstuses ja põllumajandus.

Nüüd kasutatakse erinevate mikroorganismide tüvede tuvastamiseks ja kvantifitseerimiseks spetsiaalseid meetodeid. võrdlusliigid faagid. Väga kiire, töötab peaaegu reaalajas analüütilised süsteemid saab luua geneetiliselt muundatud bakteriofaagide baasil, mis bakterirakku sisenedes käivitavad reporterfluorestseeruvate (või luminestsentsvõimeliste) valkude sünteesi, nagu nt. lutsiferaas. Vajalike substraatide lisamisel sellisesse söötmesse ilmub sinna luminestsentssignaal, mille väärtus vastab bakterite sisaldusele proovis. Sellised "valgusmärgisega" faagid on välja töötatud ohtlike patogeenide – katku tekitajate – avastamiseks, siberi katk, tuberkuloos ja taimeinfektsioonid.

Tõenäoliselt on modifitseeritud faagide abil võimalik lahendada ka pikalt kestnud globaalse tähtsusega probleem - arendada odavaid ja kiired meetodid Tuberkuloosi tekitajate tuvastamine varajases staadiumis haigused. See ülesanne on väga raske, kuna mükobakterid, põhjustades tuberkuloosi, mida iseloomustab laboritingimustes kasvatamisel äärmiselt aeglane kasv. Seetõttu on haiguse diagnoosimine traditsioonilised meetodid võib kuluda kuni mitu nädalat.

Faagitehnoloogia muudab selle ülesande lihtsamaks. Selle olemus seisneb selles, et analüüsitud vereproovidele lisatakse bakteriofaag D29, mis on võimeline nakatama. lai valik mükobakterid. Seejärel bakteriofaagid eraldatakse ja proov segatakse kiiresti kasvava mittepatogeense mükobakterite kultuuriga, mis on samuti selle bakteriofaagi suhtes tundlik. Kui algselt leidus veres mükobaktereid, mis olid nakatunud faagidega, siis bakteriofaagi tootmist jälgitakse ka uues kultuuris. Nii saab tuvastada üksikuid mükobakterirakke ja diagnostiline protsess ise väheneb 2–3 nädalalt 2–5 päevale (Swift & Rees, 2016).

Faagi kuvamine

Tänapäeval kasutatakse bakteriofaage laialdaselt lihtsad süsteemid soovitud omadustega valkude tootmiseks. See on see, mis töötati välja 1980. aastatel. äärmiselt tõhus molekulaarse valiku tehnika - faagi ekraan. Selle termini pakkus välja ameeriklane J. Smith, kes tõestas, et Escherichia coli bakteriofaagide põhjal on võimalik luua elujõuline modifitseeritud viirus, mis kannab oma pinnal võõrvalku. Selleks viiakse faagi genoomi vastav geen, mis sulandub ühte pinnaviiruse valku kodeeriva geeniga. Selliseid modifitseeritud bakteriofaage saab eraldada segust metsiktüüpi faagidega, kuna "võõras" valk on võimeline seonduma spetsiifiliste antikehadega (Smith, 1985).

Smithi katsetest järgnesid kaks olulisi leide: esiteks on rekombinantse DNA tehnoloogia abil võimalik luua 10 6 - 10 14 faagiosakesest koosnevaid populatsioone, millel on tohutu mitmekesisus ja millest igaüks kannab oma pinnal erinevad variandid valgud. Selliseid populatsioone nimetatakse kombinatoorsed faagi raamatukogud. Teiseks, isoleerides populatsioonist spetsiifilise faagi (näiteks millel on võime seostuda teatud valgu või orgaanilise molekuliga), saab seda faagi paljundada bakterirakud ja hankige antud omadustega piiramatu arv lapsi.

Faagi kuvamine toodab tänapäeval valke, mis võivad selektiivselt seostuda terapeutiliste sihtmärkidega, näiteks nendega, mis on eksponeeritud M13 faagi pinnal, mis suudavad ära tunda kasvajarakke ja suhelda nendega. Nende valkude roll faagiosakeses on nukleiinhapet “pakendada”, seega sobivad nad hästi geeniteraapia ravimite loomiseks, ainult et sellisel juhul moodustavad nad osakese juba koos terapeutilise nukleiinhappega.

Tänapäeval on faagikuvaril kaks peamist rakendusvaldkonda. Peptiidipõhist tehnoloogiat kasutatakse retseptorite uurimiseks ja antikehade sidumiskohtade kaardistamiseks, immunogeenide ja nanovaktsiinide kavandamiseks ning ensüümvalkude substraadi sidumiskohtade kaardistamiseks. Valkudel ja valgudomeenidel põhinev tehnoloogia – soovitud omadustega antikehade valimiseks, valgu-ligandi interaktsioonide uurimiseks, ekspresseeritud komplementaarsete DNA fragmentide skriinimiseks ja valkude sihipärasteks modifikatsioonideks.

Faagidisplei abil on võimalik sisestada äratundmisrühmi igat tüüpi pinnaviiruse valkudesse, samuti peamisse bakteriofaagi keha moodustavasse valku. Soovitud omadustega peptiidide sisestamisega pinnavalkudesse on võimalik saada terve rida väärtuslikke biotehnoloogilisi tooteid. Näiteks kui see peptiid jäljendab valku ohtlik viirus või bakterid, äratuntavad immuunsussüsteem, siis selline modifitseeritud bakteriofaag on vaktsiin, mida saab lihtsalt, kiiresti ja ohutult välja töötada.

Kui bakteriofaagi terminaalne pinnavalk on "adresseeritud" vähirakkudele ja reporterrühmad (näiteks fluorestseeruvad või magnetilised) on kinnitatud mõne teise pinnavalgu külge, saadakse vahend kasvajate tuvastamiseks. Ja kui osakese külge on kinnitatud ka tsütotoksiline ravim (ja tänapäevane bioorgaaniline keemia teeb seda lihtsaks), siis saame ravimi, mis on suunatud vähirakkudele.

Valgufaagide esituse üheks oluliseks rakenduseks on rekombinantsete antikehade faagiraamatukogude loomine, kus fd või M13 faagiosakeste pinnal paiknevad immunoglobuliinide antigeeni siduvad fragmendid. Inimese antikehade raamatukogud pakuvad erilist huvi, kuna selliseid antikehi saab kasutada teraapias ilma piiranguteta. Viimastel aastatel on ainuüksi USA ravimiturul müüdud kümmekond sellel meetodil konstrueeritud terapeutilist antikeha.

"Tööstuslikud" faagid

Faagikuvamise metoodika on leidnud ka üsna ootamatuid rakendusi. Bakteriofaagid on ju eelkõige teatud struktuuriga nanosuuruses osakesed, mille pinnal paiknevad valgud, millele saab faagikuvari abil “andada” omadused, mis seonduvad spetsiifiliselt soovitud molekulidega. Sellised nanoosakesed avanevad kõige laiemad võimalused luua etteantud arhitektuuriga materjale ja "tarku" molekulaarseid nanoseadmeid, samas kui nende tootmistehnoloogiad on keskkonnasõbralikud.

Kuna viirus on teatud mõõtmete suhtega üsna jäik struktuur, võimaldab see asjaolu kasutada seda teadaoleva pindala ja soovitud pooride jaotusega poorsete nanostruktuuride saamiseks struktuuris. Nagu teada, on katalüsaatori pindala selle tõhususe määrav kriitiline parameeter. Ja olemasolevad tehnoloogiad kõige õhema metallide ja nende oksiidide kihi moodustamiseks bakteriofaagide pinnal võimaldavad saada katalüsaatoreid, millel on antud mõõtmega äärmiselt arenenud korrapärane pind. (Lee et al., 2012).

MIT-i teadlane A. Belcher kasutas bakteriofaagi M13 mallina roodiumi ja nikli nanoosakeste ja nanojuhtmete kasvatamiseks tseeriumoksiidi pinnal. Saadud katalüsaatori nanoosakesed hõlbustavad etanooli muundamist vesinikuks; seega võib see katalüsaator olla väga kasulik olemasolevate vesinikkütuseelementide uuendamiseks ja uute loomiseks. Viiruse mallil kasvatatud katalüsaator erineb sarnase koostisega "tavalisest" katalüsaatorist suurema stabiilsuse poolest, see on vähem vastuvõtlik vananemisele ja pinna deaktiveerumisele (Nam et al. . , 2012).

Filamentsete faagide kulla ja indiumdioksiidiga katmisel saadi elektrokroomsed materjalid – elektrivälja muutumisel värvi muutvad poorsed nanokiled, mis on võimelised reageerima elektrivälja muutusele poolteist korda kiiremini kui teadaolevad analoogid. Sellised materjalid on paljulubavad energiasäästlike üliõhukese ekraaniga seadmete loomisel (Nam et al., 2012).

Massachusettsis Tehnoloogiainstituut bakteriofaagid said aluseks väga võimsate ja ülimalt kompaktsete elektriakude tootmisel. Selleks kasutati elusaid, geneetiliselt muundatud M13 faage, mis on inimesele kahjutud ja suudavad pinnale kinnitada erinevaid metalliioone. Nende viiruste isekoostumise tulemusena saadi etteantud konfiguratsiooniga struktuurid, mis metalliga katmisel moodustasid üsna pikad nanojuhtmed, millest sai anoodi ja katoodi alus. Anoodi materjali isemoodutamisel kasutati viirust, mis oli võimeline siduma kulda ja koobaltoksiidi, katoodi jaoks - mis on võimeline kinnitama raudfosfaati ja hõbedat. Viimasel faagil oli ka võime "korjata" üles süsinik-nanotoru otsad tänu molekulaarsele äratundmisele, mis on vajalik tõhusa elektronide ülekande tagamiseks.

Päikesepatareide jaoks on loodud materjale ka bakteriofaagi M13, titaandioksiidi ja ühe seinaga süsinik-nanotorude komplekside põhjal (Dang et al., 2011).

Viimaseid aastaid on iseloomustanud ulatuslikud bakteriofaagide uuringud, mis leiavad uusi rakendusi mitte ainult teraapias, vaid ka bio- ja nanotehnoloogiates. Nende ilmne praktiline tulemus peaks olema personaliseeritud meditsiini uue võimsa suuna esilekerkimine, samuti terve rea tehnoloogiate loomine toiduainetööstuses, veterinaarmeditsiinis, põllumajanduses ja kaasaegsete materjalide tootmises. Loodame, et bakteriofaagide uurimise teine ​​sajand toob sama palju avastusi kui esimene.

Kirjandus
1. Bakteriofaagid: bioloogia ja rakendused / Toim.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Teadusmaailm. 2012. aasta.
2. Stent G., Kalindar R. Molekulaargeneetika. M.: Mir. 1974. 614 lk.
3. Tikunova N. V., Morozova V. V. Filamentsel bakteriofaagil põhinev faagikuva: rakendus rekombinantsete antikehade valimiseks // Acta Naturae. 2009. nr 3. C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bakteriofaag: geneetika ja molekulaarbioloogia. Horizon Scientific Press, 2007.