Bakteriofágok: az alkalmazás modern vonatkozásai, jövőbeli kilátások. A fágok alkalmazása az orvostudományban és a mikrobiológiában

A múlt század közepén a biológia tudomány forradalmi lépést tett az élő rendszerek működésének molekuláris alapjainak megteremtésével. Óriási szerepe volt abban a sikeres kutatásban, amely az öröklődő molekulák kémiai természetének meghatározásához, a dekódoláshoz vezetett genetikai kódés a múlt század elején felfedezett génmanipulációs technológiák, bakteriofágok megalkotása játszott. A mai napig ezek a bakteriális vírusok sok hasznos „szakmát” sajátítottak el az ember számára: nemcsak biztonságos antibakteriális gyógyszerként, hanem fertőtlenítőként is használják, sőt elektronikus nanoeszközök létrehozásának alapjául is szolgálnak.

Amikor az 1930-as években tudósok egy csoportja foglalkozott az élő rendszerek működésének problémáival, majd a legegyszerűbb modelleket keresve felfigyeltek a bakteriofágok- bakteriális vírusok. A biológiai objektumok között ugyanis nincs egyszerűbb a bakteriofágoknál, ráadásul könnyen és gyorsan termeszthetők, elemezhetők, a vírusgenetikai programok pedig kicsik.

A fág egy minimális méretű természetes szerkezet, amely egy sűrűn csomagolt genetikai programot (DNS vagy RNS) tartalmaz, amelyben nincs semmi felesleges. Ez a program egy fehérjehéjba van zárva, amely minimális eszközökkel van felszerelve a baktériumsejtbe való bejutáshoz. A bakteriofágok nem képesek önmagukban szaporodni, és ebben az értelemben nem tekinthetők teljes értékű élő tárgyaknak. Génjeik csak a baktériumokban kezdenek működni, felhasználva a baktériumsejtben elérhető bioszintetikus rendszereket és a szintézishez szükséges molekulatartalékokat. Ezeknek a vírusoknak a genetikai programja azonban alapvetően nem különbözik többekétől összetett organizmusok Ezért a bakteriofágokkal végzett kísérletek lehetővé tették a genom felépítésének és működésének alapvető elveinek megállapítását.

A későbbiekben ezek az ismeretek és a kutatás során kidolgozott módszerek a biológiai és orvostudomány fejlődésének, valamint a biotechnológiai alkalmazások széles skálájának alapjául szolgáltak.

Harcol a kórokozók ellen

Az első kísérletek bakteriofágok kezelésére fertőző betegségek felfedezésük után szinte azonnal vállalták, de az ismeretek hiánya és az akkori tökéletlen biotechnológiák nem tette lehetővé a teljes sikert. Mindazonáltal a további klinikai gyakorlat megmutatta a bakteriofágok sikeres alkalmazásának alapvető lehetőségét fertőző betegségekben. gyomor-bél traktus, urogenitális rendszer, betegek akut gennyes-szeptikus állapotában, műtéti fertőzések kezelésére stb.

Az antibiotikumokhoz képest a bakteriofágok számos előnnyel rendelkeznek: nem okoznak mellékhatások, ráadásul szigorúan bizonyos típusú baktériumokra specifikusak, így használatuk során a normál emberi mikrobióma nem károsodik. Az ilyen nagy szelektivitás azonban problémákat is okoz: a beteg sikeres kezeléséhez pontosan ismerni kell a fertőző ágenst, és egyedileg kell kiválasztani a bakteriofágot.

A fágok profilaktikusan is használhatók. Például a Moszkvai Epidemiológiai és Mikrobiológiai Kutatóintézet. G. N. Gabrichevsky kifejlesztette a "FOODFAG" profilaktikus terméket bakteriofágok koktélján, amely csökkenti az akut fertőzés kockázatát. bélfertőzések. Klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy a gyógyszer heti bevitele lehetővé teszi, hogy megszabaduljon a hemolizáló Escherichia colitól és más patogén és opportunista baktériumoktól, diszbakteriózist okozva belek.

A bakteriofágok nemcsak az emberek, hanem a házi- és haszonállatok fertőző betegségeit is kezelik: tehenek tőgygyulladását, borjak és sertések colibacillózisát és escherichiosisát, csirkék szalmonellózisát... Különösen kényelmes a fágkészítmények alkalmazása akvakultúra esetén - pl. iparilag termesztett halak és garnélarák kezelése, mert hosszú ideig vízben maradnak. A bakteriofágok a növények védelmét is segítik, bár a fágtechnológiák alkalmazása ebben az esetben nehézkes a vírusokat káros természeti tényezők, például a napfény és az eső hatása miatt.

A fágok nagy szerepet játszhatnak az élelmiszerek mikrobiológiai biztonságának megőrzésében, hiszen az élelmiszeriparban az antibiotikumok és vegyszerek alkalmazása nem oldja meg ezt a problémát, ugyanakkor csökkenti a termékek környezetbarát jellegét. Maga a probléma súlyosságát statisztikák is bizonyítják: például az Egyesült Államokban és Oroszországban évente akár 40 ezer szalmonellózisos esetet regisztrálnak, ebből 1%-a meghal. Ennek a fertőzésnek a terjedése nagyrészt a különféle baromfifajták tenyésztésével, feldolgozásával és fogyasztásával függ össze, és a bakteriofágok felhasználására tett kísérletek a leküzdésére ígéretes eredményeket mutattak.

Igen, egy amerikai cég Intralytix fágkészítményeket gyárt a listeriosis, a szalmonellózis és az Escherichia coli által okozott bakteriális fertőzés leküzdésére. Adalékanyagként használhatók, amelyek megakadályozzák a baktériumok elszaporodását az élelmiszereken - hús- és baromfitermékekre, valamint zöldségekre és gyümölcsökre permetezik. Kísérletek kimutatták, hogy a bakteriofágok koktélja sikeresen alkalmazható élő tavi halak szállítása és értékesítése során is, hogy csökkentse nemcsak a víz, hanem magának a halnak a bakteriális szennyeződését is.

A bakteriofágok nyilvánvaló alkalmazása az fertőtlenítés, vagyis a baktériumok elpusztítása olyan helyeken, ahol nem lenne szabad: kórházakban, élelmiszergyárakban stb. Erre a célra a brit cég Fix Phage módszert dolgozott ki fágpreparátumok felületeken történő rögzítésére, amely biztosítja a tartósítást biológiai aktivitás fágok legfeljebb három évig.

Bakteriofágok - a molekuláris biológia "Drosophila".

1946-ban, a híres amerikai laboratóriumban, Cold Spring Harborban tartott 11. szimpóziumon kihirdették az „egy gén – egy enzim” elméletét. A. Hershey bakteriológus és M. Delbrück "egykori" fizikus, molekuláris biológus genetikai tulajdonságok cseréjéről számolt be a különböző fágok között, miközben egyidejűleg megfertőzték az Escherichia coli sejteket. Ez a felfedezés, amely akkor történt, amikor még nem ismerték a gén fizikai hordozóját, arról tanúskodott, hogy a "rekombináció" jelensége - a genetikai tulajdonságok keveredése - nemcsak a magasabb rendű élőlényekre, hanem a vírusokra is jellemző. A jelenség felfedezése ezt követően lehetővé tette a replikáció molekuláris mechanizmusainak részletes tanulmányozását. Később a bakteriofágokkal végzett kísérletek lehetővé tették a genetikai programok felépítésének és működésének elveinek megállapítását.

1952-ben A. Hershey és M. Chase kísérleti úton bebizonyították, hogy a T2 bakteriofág örökletes információit nem a fehérjék kódolják, ahogy azt sok tudós hitte, hanem a DNS-molekulák (Hershey & Chase, 1952). A kutatók a szaporodási folyamatot a bakteriofágok két csoportjában követték nyomon, az egyik radioaktívan jelölt fehérjéket, a másik pedig DNS-molekulákat hordozott. A baktériumok ilyen fágokkal való megfertőzése után kiderült, hogy a fertőzött sejtbe csak a vírus DNS kerül be, ami bizonyítékul szolgált az örökletes információk tárolásában és továbbításában betöltött szerepére.

Ugyanebben az évben D. Lederberg és N. Zindler amerikai genetikusok a Salmonella két törzsével és a P22 bakteriofággal végzett kísérletben azt találták, hogy a bakteriofág képes beépíteni a gazdabaktérium DNS-fragmenseit a szaporodás során, és átadni azokat más baktériumoknak. fertőzés esetén (Zinder és Lederberg, 1952). A donor baktériumból a befogadó baktériumba történő géntranszfernek ezt a jelenségét „transzdukciónak” nevezték. A kísérlet eredményei újabb megerősítést jelentettek a DNS szerepére az öröklődő információk továbbításában.

1969-ben A. Hershey, M. Delbrück és kollégájuk, S. Luria Nobel-díjasok lettek "a vírusok replikációs mechanizmusával és genetikai szerkezetével kapcsolatos felfedezéseikért".

1972-ben az E. coli DNS replikációjának (sejtinformációinak másolásának) tanulmányozása során R. Bird és munkatársai bakteriofágokat használtak próbaként, amelyek képesek integrálódni a baktériumsejt genomjába, és megállapították, hogy a replikációs folyamat két irányban megy végbe a kromoszóma mentén. (Stent, 1974).

A teremtés hét napja

A szintetikus biológia modern módszerei nemcsak a fággenomok különféle módosításait teszik lehetővé, hanem teljesen mesterséges aktív fágok létrehozását is. Technológiailag ez nem nehéz, csak meg kell szintetizálni a fág genomot, és be kell juttatni egy baktériumsejtbe, és ott beindítja a fehérjék szintéziséhez és az új fágrészecskék összeállításához szükséges összes folyamatot. A modern laboratóriumokban ez a munka csak néhány napot vesz igénybe.

A genetikai módosításokat a fágok specifitásának megváltoztatására és hatékonyságuk növelésére használják. terápiás hatás. Ennek érdekében a legagresszívebb fágokat felismerő struktúrákkal látják el, amelyek a célbaktériumokhoz kötik őket. Ezenkívül az anyagcserét megzavaró baktériumok számára toxikus fehérjéket kódoló géneket is beépítik a vírusgenomokba – az ilyen fágok halálosabbak a baktériumok számára.

A baktériumoknak számos védekezési mechanizmusuk van az antibiotikumokkal és bakteriofágokkal szemben, ezek egyike a vírusgenomok elpusztítása. restrikciós enzimek specifikus nukleotidszekvenciákra ható. A fágok terápiás aktivitásának növelése érdekében a genetikai kód degeneráltsága miatt génjeik szekvenciái „újraformázhatók” oly módon, hogy az enzimekre „érzékeny” nukleotid szekvenciák száma minimális legyen, miközben a szekvenciájuk megmarad. kódolási tulajdonságok.

Univerzális módja annak, hogy megvédjük a baktériumokat mindentől külső hatások- úgy hívják biofilmek, DNS-filmek, poliszacharidok és fehérjék, amelyeket a baktériumok együtt hoznak létre, és amelyekbe sem az antibiotikumok, sem a terápiás fehérjék nem hatolnak be. Ilyen biofilmek fejfájás az orvosok, mivel hozzájárulnak a fogzománc pusztításához, az implantátumok felületén, katétereken, műízületeken, valamint légutak, a bőr felszínén stb. A biofilmek leküzdésére speciális bakteriofágokat építettek, amelyek egy speciális, bakteriális polimereket elpusztító lítikus enzimet kódoló gént tartalmaznak.

Enzimek "bakteriofágból"

A bakteriofágokon végzett kutatások eredményeként számos olyan enzimet fedeztek fel, amelyeket ma széles körben használnak a molekuláris biológiában és a géntechnológiában.

Ilyen például a restrikciós enzimek, a DNS-t hasító bakteriális nukleázok csoportja. Még az 1950-es évek elején. Azt találták, hogy az egyik baktériumtörzs sejtjéből izolált bakteriofágok gyakran rosszul szaporodnak egy közeli rokon törzsben. Ennek a jelenségnek a felfedezése azt jelentette, hogy a baktériumok rendelkeznek egy rendszerrel, amely elnyomja a vírusok szaporodását (Luria & Human, 1952). Ennek eredményeként egy enzimatikus restrikciós-módosító rendszert fedeztek fel, melynek segítségével a baktériumok elpusztították a sejtbe került idegen DNS-t. A restrikciós enzimek (restrikciós endonukleázok) izolálása felbecsülhetetlen értékű eszközt adott a molekuláris biológusoknak a DNS manipulálására: egyik szekvenciát a másikba illeszteni, vagy a szükséges láncrészleteket kivágni, ami végül a rekombináns DNS technológia kifejlesztéséhez vezetett.

Egy másik, a molekuláris biológiában széles körben használt enzim a bakteriofág T4 DNS-ligáz, amely a kettős szálú DNS- és RNS-molekulák „ragadós” és „tompa” végeit „keresztezi”. A közelmúltban pedig ennek az enzimnek nagyobb aktivitású, genetikailag módosított változatai jelentek meg.

A laboratóriumi gyakorlatban használt, egyszálú RNS- és DNS-molekulákat "varr" RNS-ligázok többsége is bakteriofágokból származik. A természetben elsősorban a törött RNS-molekulák helyreállítására szolgálnak. A kutatók leggyakrabban a bakteriofág T4 RNS-ligázt használják, amely egyszálú polinukleotidokat „varrhat” RNS-molekulákra, hogy megjelölje azokat. Ezt a technikát az RNS szerkezetének elemzésére, RNS-fehérje kötőhelyek keresésére, oligonukleotid szintézisre stb. alkalmazzák. A közelmúltban az rm378 és TS2126 bakteriofágokból izolált hőstabil RNS-ligázok a rutinszerűen használt enzimek között jelentek meg (Nordberg Karlsson et al., 2010). Hjorleifsdottir, 2014).

A bakteriofágokból egy másik rendkívül fontos enzimcsoport, a polimerázok egy részét is előállították. Például a nagyon „precíz” bakteriofág T7 DNS-polimeráz, amely alkalmazásra talált különböző területeken molekuláris biológia, mint például a helyspecifikus mutagenezis, de elsősorban a DNS elsődleges szerkezetének meghatározására használják.

Egy kémiailag módosított T7 fág DNS polimerázt javasoltak pl tökéletes eszköz DNS-szekvenáláshoz már 1987-ben (Tabor és Richardson, 1987). Ennek a polimeráznak a módosítása többszörösére növelte hatékonyságát: a DNS-polimerizáció sebessége ebben az esetben másodpercenként több mint 300 nukleotidot ér el, így nagy DNS-fragmensek amplifikálására is használható. Ez az enzim a szekvenáz prekurzora lett, egy genetikailag módosított enzim, amelyet a Sanger-reakció DNS-szekvenálására optimalizáltak. A szekvenázt nagy hatékonyság jellemzi, és képes nukleotid-analógokat beépíteni a DNS-szekvenciába, amelyeket a szekvenálási eredmények javítására használnak.

A bakteriofágok eredete a molekuláris biológiában használt fő RNS-polimerázok (DNS-függő RNS-polimerázok) is – a transzkripciós folyamatot katalizáló enzimek (RNS-másolatok olvasása a DNS-templátról). Ezek közé tartoznak az SP6, T7 és T3 RNS polimerázok, amelyeket a megfelelő SP6, T7 és T3 bakteriofágokról neveztek el. Mindezeket az enzimeket antiszensz RNS-transzkriptumok, jelölt RNS-próbák stb. in vitro szintézisére használják.

Az első teljesen szekvenált DNS-genom a φ174 fág genom volt, több mint 5000 nukleotid hosszúságú (Sanger et al., 1977). Ezt a dekódolást F. Sanger angol biokémikus egy csoportja végezte, a híres, azonos nevű DNS-szekvenálási módszer megalkotója.

A polinukleotid-kinázok katalizálják egy foszfátcsoport átvitelét egy ATP-molekuláról a nukleinsavmolekula 5'-végére, az 5'-foszfát-csoportok cseréjét vagy a mononukleotidok 3'-végeinek foszforilációját. A laboratóriumi gyakorlatban a bakteriofág T4 polinukleotid kinázt használják legszélesebb körben. Általában kísérletekben használják a DNS radioaktív foszforizotópjával való jelölésére. A polinukleotid-kinázt restrikciós helyek keresésére, DNS- és RNS-ujjlenyomatvételre, DNS- vagy RNS-ligáz-szubsztrátok szintézisére is használják.

Molekuláris biológiai kísérletekben olyan bakteriofág enzimek, mint a T4 fág polinukleotid kináz, amelyet általában DNS radioaktív foszforizotóppal történő jelölésére használnak, DNS és RNS ujjlenyomat stb. A szálas DNS templátokat széles körben használják molekuláris biológiai kísérletekben is, szekvenálásra és a nukleotid polimorfizmus elemzésére.

A szintetikus biológia módszereivel lehetőség nyílt olyan bakteriofágok kifejlesztésére is, amelyek a legkifinomultabb fegyverekkel vannak felvértezve, amelyeket a baktériumok magukkal a fágokkal szemben alkalmaznak. Ez körülbelül a bakteriális CRISPR-Cas rendszerekről, amelyek a DNS-t hasító nukleáz enzim és az RNS-szekvencia komplexe, amely ennek az enzimnek a hatását a vírusgenom egy meghatározott fragmentumára irányítja. A fág DNS egy darabja „mutatóként” szolgál, amelyet a baktérium „emlékezetre” tárol egy speciális génben. Ha egy hasonló fragmentumot találnak egy baktérium belsejében, ez a fehérje-nukleotid komplex elpusztítja azt.

Miután rájöttek a CRISPR-Cas rendszerek működési mechanizmusára, a kutatók magukat a fágokat próbálták egy hasonló „fegyverrel” felszerelni, amihez egy nukleázt kódoló, a baktériumgenom meghatározott régióival komplementer RNS-szekvenciákat megcímző gének komplexét alkalmazták. bekerült a genomjukba. A „célpont” a többszörös gyógyszerrezisztenciáért felelős gének lehetnek. A kísérleteket teljes siker koronázta – az ilyen fágok nagy hatékonysággal hatnak a baktériumokra, amelyekre „ráhangolták”.

Fág antibiotikumok

Terápiás célokra a fágokat nem kell közvetlenül használni. Több millió éves evolúció során a bakteriofágok specifikus fehérjék arzenálját fejlesztették ki - eszközöket a célmikroorganizmusok felismerésére és az áldozat biopolimerjeinek manipulálására, amelyek alapján antibakteriális gyógyszereket lehet létrehozni. A legígéretesebb ilyen típusú fehérjék az endolizin enzimek, amelyeket a fágok a baktériumból való kilépéskor a sejtfal elpusztítására használnak. Önmagukban ezek az anyagok erős antibakteriális szerek, nem mérgezőek az emberre. Hatásuk hatékonysága és iránya növelhető a bennük lévő címzési struktúrák – bizonyos baktériumokhoz specifikusan kötődő fehérjék – megváltoztatásával.

A legtöbb baktérium a sejtfal szerkezete szerint Gram-pozitívra, melynek membránját nagyon vastag peptidoglikánréteg borítja, és Gram-negatívra, amelyben a peptidoglikán réteg két membrán között helyezkedik el. A természetes endolizinek alkalmazása különösen hatékony a gram-pozitív baktériumok (staphylococcusok, streptococcusok stb.) esetében, mivel ezek peptidoglikán rétege kívül helyezkedik el. Gram-negatív baktériumok (Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, coli stb.) kevésbé hozzáférhető célpont, mivel az enzimnek át kell hatolnia a külső bakteriális membránon, hogy elérje a belső peptidoglikán réteget.

Ennek a problémának a leküzdésére létrehozták az úgynevezett artilizineket - a természetes endolizinek módosított változatait, amelyek polikationos vagy amfipatikus peptideket tartalmaznak, amelyek destabilizálják a külső membránt és biztosítják az endolizin közvetlenül a peptidoglikán rétegbe való eljuttatását. Az artilizinek magas baktericid hatással rendelkeznek, és már kimutatták, hogy hatékonyak a kutyák középfülgyulladásának kezelésében (Briers et al., 2014).

Példa a módosított endolizinre, amely szelektíven hat bizonyos baktériumokra, a kanadai cég P128 gyógyszere. Ganga Gen Inc.. Ez az endolizin biológiailag aktív fragmense, amely lizosztafinhoz kapcsolódik, egy célzó fehérjemolekulához, amely a staphylococcus sejtek felszínéhez kötődik. A kapott kiméra fehérje nagy aktivitással rendelkezik a staphylococcusok különféle törzsei ellen, beleértve azokat is, amelyek multidrog rezisztenciával rendelkeznek.

A baktériumok "számlálói".

A bakteriofágok nemcsak sokoldalú terápiás és "fertőtlenítő" szerként szolgálnak, hanem kényelmes és pontos analitikai eszközként is szolgálnak egy mikrobiológus számára. Például nagy specifitásuk miatt természetes analitikai reagensek egy bizonyos típusú és törzsű baktériumok kimutatására.

Egy ilyen vizsgálat legegyszerűbb változatában különféle diagnosztikai bakteriofágokat csepegtetnek egy Petri-csészébe, baktériumtenyészettel beoltott tápközeggel. Ha kiderül, hogy a baktérium érzékeny a fágra, akkor a bakteriális "gyep" ezen a helyén "plakk" képződik - egy átlátszó terület elölt és lizált baktériumsejtekkel.

A fágok szaporodásának elemzésével célbaktériumok jelenlétében számszerűsíthető ez utóbbiak bősége. Mivel az oldatban lévő fágrészecskék száma a benne lévő baktériumsejtek számával arányosan növekszik, elegendő a bakteriofág titerének meghatározása a baktériumok számának becsléséhez.

Az ilyen analitikai reakciók specifitása és érzékenysége meglehetősen magas, maguk az eljárások pedig egyszerűen végrehajthatók, és nem igényelnek kifinomult felszerelést. Fontos, hogy a bakteriofágokon alapuló diagnosztikai rendszerek élő kórokozó jelenlétét jelezzék, míg más módszerek, például a PCR és az immunanalitikai módszerek csak az ehhez a baktériumhoz tartozó biopolimerek jelenlétét jelzik. Az ilyen típusú diagnosztikai módszerek különösen alkalmasak a környezettanulmányok, valamint az élelmiszeripar és mezőgazdaság.

Jelenleg speciális módszereket alkalmaznak a mikroorganizmusok különböző törzseinek azonosítására és mennyiségi meghatározására. referencia faj fágok. A genetikailag módosított bakteriofágok alapján nagyon gyors, szinte valós idejű analitikai rendszerek hozhatók létre, amelyek a baktériumsejtbe kerülve beindítják a riporter fluoreszcens (vagy lumineszcenciára képes) fehérjék szintézisét, mint pl. luciferáz. Amikor a szükséges szubsztrátokat hozzáadjuk egy ilyen közeghez, lumineszcens jel jelenik meg benne, amelynek értéke megfelel a mintában lévő baktériumok mennyiségének. Az ilyen „fénnyel jelölt” fágokat veszélyes kórokozók – a pestis kórokozói – kimutatására fejlesztették ki, lépfene, tuberkulózis és növényi fertőzések.

Valószínűleg a módosított fágok segítségével megoldható lesz egy régóta fennálló, globális jelentőségű probléma is - olcsó és gyors módszerek kidolgozása a tuberkulózis kórokozóinak kimutatására a betegség korai szakaszában. Ez a feladat nagyon nehéz, mivel a tuberkulózist okozó mikobaktériumokat rendkívül lassú szaporodás jellemzi, amikor termesztik. laboratóriumi körülmények. Ezért a betegség hagyományos módszerekkel történő diagnosztizálása akár több hétig is elhúzódhat.

A fág technológia megkönnyíti ezt a feladatot. Lényege, hogy a vizsgált vérmintákhoz D29 bakteriofág kerül, amely képes fertőzni. széleskörű mikobaktériumok. Ezután a bakteriofágokat elválasztják, és a mintát összekeverik egy gyorsan növekvő, nem patogén mikobaktérium-kultúrával, amely szintén érzékeny erre a bakteriofágra. Ha a vér eredetileg fágokkal fertőzött mikobaktériumokat tartalmazott, akkor az új tenyészet bakteriofág termelést is mutat majd. Ily módon a mikobaktériumok egyetlen sejtje kimutatható, és maga a diagnosztikai folyamat 2–3 hétről 2–5 napra csökken (Swift & Rees, 2016).

Fág kijelző

Ma a bakteriofágokat széles körben használják egyszerű rendszerek kívánt tulajdonságokkal rendelkező fehérjék előállítására. Ezt az 1980-as években fejlesztették ki. rendkívül hatékony molekuláris szelekciós technika - fág kijelző. Ezt a kifejezést az amerikai J. Smith javasolta, aki bebizonyította, hogy az Escherichia coli bakteriofágok alapján lehetséges életképes módosított vírust létrehozni, amely idegen fehérjét hordoz a felszínén. Ennek érdekében a megfelelő gént bejuttatják a fág genomjába, amely egyesül az egyik felszíni vírusfehérjét kódoló génnel. Az ilyen módosított bakteriofágok vad típusú fágokkal alkotott keverékből izolálhatók, mivel egy „idegen” fehérje képes specifikus antitestekhez kötődni (Smith, 1985).

Smith kísérleteiből két fontos következtetés következett: egyrészt a rekombináns DNS-technológia segítségével rendkívül változatos, 10 6 -10 14 fágrészecskéből álló populációkat lehet létrehozni, amelyek mindegyike különböző fehérjeváltozatokat hordoz a felületén. Az ilyen populációkat ún kombinatorikus fágkönyvtárak. Másodszor, ha egy adott fágot izolálunk egy populációból (például képes egy bizonyos fehérjéhez vagy szerves molekulához kötődni), ez a fág baktériumsejtekben szaporítható, és korlátlan számú, kívánt tulajdonságokkal rendelkező leszármazottat nyerhet.

A fágmegjelenítés ma olyan fehérjéket termel, amelyek szelektíven kötődhetnek terápiás célpontokhoz, például azokhoz, amelyek az M13 fág felszínén vannak kitéve, és képesek felismerni a tumorsejteket és kölcsönhatásba lépni velük. Ezeknek a fehérjéknek a szerepe a fágrészecskében a nukleinsav „becsomagolása”, így kiválóan alkalmasak génterápiás gyógyszerek létrehozására, csak ebben az esetben már terápiás nukleinsavval alkotnak részecskét.

Ma a fágmegjelenítésnek két fő alkalmazási területe van. Peptid alapú technológiát használnak a receptorok feltárására és az antitestkötő helyek feltérképezésére, immunogének és nanovakcinák tervezésére, valamint az enzimfehérjék szubsztrátkötő helyek feltérképezésére. Fehérjéken és fehérjedoméneken alapuló technológia - kívánt tulajdonságokkal rendelkező antitestek kiválasztására, fehérje-ligandum kölcsönhatások vizsgálatára, expresszált komplementer DNS-fragmensek szűrésére és fehérjék célzott módosítására.

A fágmegjelenítés segítségével lehetőség nyílik felismerő csoportok bejuttatására minden típusú felszíni vírusfehérjébe, valamint a bakteriofág testet alkotó fő fehérjébe. A kívánt tulajdonságú peptidek felületi fehérjékbe történő bejuttatásával értékes biotechnológiai termékek egész sora nyerhető. Például, ha ez a peptid egy, az immunrendszer által felismert veszélyes vírus vagy baktérium fehérjét utánozza, akkor az ilyen módosított bakteriofág egy könnyen, gyorsan és biztonságosan előállítható vakcina.

Ha a bakteriofág terminális felszíni fehérje „címezve” van rákos sejtek, és riportercsoportokat (például fluoreszcens vagy mágneses) csatolunk egy másik felszíni fehérjéhez, akkor kapunk egy eszközt a daganatok kimutatására. És ha a részecskéhez citotoxikus gyógyszer is kapcsolódik (és a modern bioorganikus kémia ezt könnyen megteszi), akkor olyan gyógyszert kapunk, amely a rákos sejteket célozza meg.

A protein fág display egyik fontos alkalmazása a rekombináns antitestek fágkönyvtárainak létrehozása, ahol az immunglobulinok antigénkötő fragmentumai az fd vagy M13 fág részecskék felszínén helyezkednek el. A humán antitest-könyvtárak különösen érdekesek, mivel az ilyen antitestek korlátozás nélkül használhatók a terápiában. NÁL NÉL utóbbi évek az Egyesült Államok gyógyszerpiaca önmagában mintegy tucat, ezzel a módszerrel előállított terápiás antitestet értékesít.

"Ipari" fágok

A fágmegjelenítési módszertan meglehetősen váratlan alkalmazásokra is talált. Hiszen a bakteriofágok elsősorban egy bizonyos szerkezetű nanoméretű részecskék, amelyek felületén fehérjék helyezkednek el, amelyek egy fág display segítségével „elláthatók” azzal a tulajdonsággal, hogy specifikusan kötődjenek a kívánt molekulákhoz. Az ilyen nanorészecskék kinyílnak a legszélesebb lehetőségeket adott architektúrájú anyagokat és "okos" molekuláris nanoeszközöket készíteni, miközben ezek előállítási technológiája környezetbarát lesz.

Mivel a vírus meglehetősen merev szerkezet, bizonyos méretarányokkal, ez a körülmény lehetővé teszi, hogy ismert felületű és kívánt póruseloszlású porózus nanostruktúrákat kapjunk a szerkezetben. Mint ismeretes, a katalizátor felülete a hatékonyságát meghatározó kritikus paraméter. A bakteriofágok felületén a fémek és oxidjaik legvékonyabb rétegének kialakítására szolgáló meglévő technológiák pedig lehetővé teszik egy adott méretű, rendkívül fejlett szabályos felületű katalizátorok előállítását. (Lee et al., 2012).

A. Belcher, az MIT kutatója az M13 bakteriofágot használta sablonként a ródium és nikkel nanorészecskék és nanoszálak növekedéséhez a cérium-oxid felületén. Az így létrejövő katalizátor nanorészecskék elősegítik az etanol hidrogénné történő átalakítását, így ez a katalizátor nagyon hasznos lehet a meglévő hidrogén üzemanyagcellák fejlesztésében és új létrehozásában. A vírussablonon növesztett katalizátor nagyobb stabilitásban különbözik a „hagyományos” hasonló összetételű katalizátortól, kevésbé hajlamos az öregedésre és a felület dezaktiválására (Nam et al. . , 2012).

A fonalas fágok arannyal és indium-dioxiddal való bevonásával elektrokróm anyagokat kaptak - porózus nanofilmeket, amelyek színt változtatnak az elektromos tér megváltozásakor, és másfélszer gyorsabban képesek reagálni az elektromos tér változására, mint az ismert analógok. Az ilyen anyagok ígéretesek az energiatakarékos ultravékony képernyős eszközök létrehozásában (Nam et al., 2012).

Massachusettsben technológiai Intézet A bakteriofágok nagyon erős és rendkívül kompakt elektromos akkumulátorok gyártásának alapjává váltak. Ehhez élő, genetikailag módosított M13-as fágokat használtak, amelyek emberre ártalmatlanok, és képesek különféle fémionokat a felülethez kötni. Ezen vírusok önszerveződésének eredményeként adott konfigurációjú szerkezetek keletkeztek, amelyek fémmel bevonva meglehetősen hosszú nanoszálakat képeztek, amelyek az anód és a katód alapjává váltak. Az anód anyagának önképződéséhez egy arany és kobalt-oxid megkötésére képes vírust használtak, a katódhoz - amely képes vas-foszfátot és ezüstöt megkötni. Az utolsó fág arra is képes volt, hogy a molekuláris felismerés révén "felvegye" a szén nanocső végeit, ami a hatékony elektronátvitel biztosításához szükséges.

Az M13 bakteriofág, a titán-dioxid és az egyfalú szén nanocsövek komplexei alapján napelemekhez is készítettek anyagokat (Dang et al., 2011).

Az elmúlt éveket a bakteriofágok kiterjedt kutatása jellemezte, amelyek nemcsak a terápiában, hanem a bio- és nanotechnológiákban is új alkalmazásokat találnak. Kézenfekvő gyakorlati eredményük a személyre szabott orvoslás új, erőteljes irányának megjelenése, valamint az élelmiszeriparban, az állatgyógyászatban, a mezőgazdaságban és a modern anyagok gyártásában egy sor technológia megalkotása. Arra számítunk, hogy a bakteriofágkutatás második évszázada elhozza kevesebb felfedezés mint az első.

Irodalom
1. Bakteriofágok: biológia és alkalmazások / Szerk.: E. Cutter, A. Sulakvelidze. M.: Tudományos világ. 2012.
2. Stent G., Kalindar R. Molekuláris genetika. M.: Mir. 1974. 614 p.
3. Tikunova N. V., Morozova V. V. Fágmegjelenítés fonalas bakteriofágokon: alkalmazás rekombináns antitestek kiválasztására // Acta Naturae. 2009. 3. szám C. 6–15.
4. Mc Grath S., van Sinderen D. Bakteriofág: Genetika és molekuláris biológia. Horizon Scientific Press, 2007.

№ 10-2013

-val készült fénykép elektron mikroszkóp,
bemutatja a bakteriofágok (T1 kolifágok) rögzítésének folyamatát az E. coli baktérium felszínén.

A 20. század végén világossá vált, hogy a baktériumok kétségtelenül uralják a Föld bioszféráját, és biomasszájának több mint 90%-át teszik ki. Mindegyik fajnak számos speciális vírustípusa van. Az előzetes becslések szerint a bakteriofág fajok száma körülbelül 10 15. Ennek az ábrának a léptékének megértéséhez azt mondhatjuk, hogy ha minden ember a Földön naponta felfedez egy új bakteriofágot, akkor mindegyik leírása 30 évbe fog telni.

Így a bakteriofágok a legkevésbé tanulmányozott lények bioszféránkban. A ma ismert bakteriofágok többsége a Caudovirales - farkú vírusok rendjébe tartozik. Részecskék mérete 50-200 nm. A különböző hosszúságú és alakú farok biztosítja a vírus kötődését a gazdabaktérium felszínéhez, a fej (kapszid) a genom tárházaként szolgál. A genomiális DNS a bakteriofág "testét" alkotó szerkezeti fehérjéket és azokat a fehérjéket kódolja, amelyek biztosítják a fág szaporodását a sejten belül a fertőzés során.

Azt mondhatjuk, hogy a bakteriofág egy természetes high-tech nanoobjektum. Például a fágfarok egy "molekuláris fecskendő", amely átszúrja a baktérium falát, és annak DNS-ét a sejtbe fecskendezi, amikor az összehúzódik. Ettől kezdve kezdődik a fertőzéses ciklus. További lépései a bakteriális életmechanizmusok átállítása a bakteriofág kiszolgálására, a genom felszaporítása, a vírusburok többszörös másolatának felépítése, a vírus DNS-ének becsomagolása, végül a gazdasejt elpusztítása (lízise).

A bakteriofág nem élőlény, hanem a természet által létrehozott molekuláris nanomechanizmus.
A bakteriofág farka egy fecskendő, amely átszúrja a baktérium falát, és vírus DNS-t fecskendez be,
amely a fejben (kapszidban), a sejt belsejében raktározódik.

A jelenlegi egyensúly okának a baktériumok védekező mechanizmusainak és a vírusok támadásának folyamatos evolúciós versengése mellett az is tekinthető, hogy a bakteriofágok fertőző hatásukra specializálódtak. Ha van nagy kolónia baktériumok, ahol a következő fággenerációk találják meg áldozataikat, akkor a baktériumok lítikus (elpusztítása, szó szerint - feloldó) fágok pusztítása gyorsan és folyamatosan megy végbe.

Ha nincs elég potenciális áldozat, vagy a külső körülmények nem túl alkalmasak a fágok hatékony szaporodására, akkor a lizogén fejlődési ciklussal rendelkező fágok előnyhöz jutnak. Ilyenkor a fág DNS baktériumba juttatása után a fertőzési mechanizmus nem indul be azonnal, hanem egyelőre passzív állapotban létezik a sejten belül, gyakran behatol a baktérium genomjába.

Ebben a profág állapotában a vírus hosszú ideig létezhet, és a baktérium kromoszómájával együtt sejtosztódási ciklusokon megy keresztül. És csak akkor aktiválódik a fertőzés litikus ciklusa, amikor a baktérium a szaporodás szempontjából kedvező környezetbe kerül. Ugyanakkor, amikor a fág DNS felszabadul a bakteriális kromoszómából, a baktériumgenom szomszédos régiói gyakran befogásra kerülnek, és ezek tartalma később átkerülhet a következő baktériumba, amelyet a bakteriofág megfertőz. Ezt a folyamatot (géntranszdukciót) tekintjük a legfontosabb eszköz információátadás prokarióták - sejtmag nélküli szervezetek között.

Hogyan működik a bakteriofág

Mindezeket a molekuláris finomságokat nem ismerték a huszadik század második évtizedében, amikor „a baktériumokat elpusztító láthatatlan fertőző ágenseket” fedezték fel. De még az elektronmikroszkóp nélkül is, amelyet az 1940-es évek végén használtak először bakteriofágok képeinek készítésére, egyértelmű volt, hogy képesek elpusztítani a baktériumokat, beleértve a kórokozókat is. Ezt az ingatlant azonnal követelte az orvostudomány.

A vérhas, a sebfertőzések, a kolera, a tífusz, sőt a pestis fágokkal történő kezelésének első próbálkozásai meglehetősen óvatosan történtek, és a siker meglehetősen meggyőzőnek tűnt. De a tömeggyártás és a fágkészítmények használata után az eufória csalódásba fordult. Nagyon keveset tudtak arról, hogy mik azok a bakteriofágok, hogyan kell előállítani, tisztítani és felhasználni dózisformáikat. Elég, ha azt mondjuk, hogy az Egyesült Államokban az 1920-as évek végén végzett vizsgálat eredményei szerint számos ipari fágkészítményben nem találtak megfelelő bakteriofágokat.

Az antibiotikumokkal kapcsolatos probléma

A huszadik század második felét az orvostudományban az „antibiotikumok korszakának” nevezhetjük. Alexander Fleming, a penicillin felfedezője azonban Nobel-előadásában arra figyelmeztetett, hogy a mikrobiális rezisztencia a penicillinnel szemben meglehetősen gyorsan kialakul. Az antibiotikum-rezisztenciát egyelőre az új típusú antimikrobiális gyógyszerek kifejlesztése ellensúlyozta. Ám az 1990-es évek óta világossá vált, hogy az emberiség elveszíti a mikrobákkal szembeni „fegyverkezési versenyt”.

Először is az antibiotikumok ellenőrizetlen alkalmazása a hibás, nemcsak az orvostudományban, hanem az orvostudományban is megelőző célokra, és nem csak az orvostudományban, hanem a mezőgazdaságban, az élelmiszeriparban és a mindennapi életben is. Ennek eredményeként nemcsak a kórokozó baktériumokban, hanem a talajban és vízben élő leggyakoribb mikroorganizmusokban is elkezdett rezisztencia kialakulni ezekkel a gyógyszerekkel szemben, így „feltételes kórokozók” lettek.

Ezek a baktériumok szaporodnak benne egészségügyi intézmények, benépesítik a vízvezetékeket, bútorokat, orvosi berendezéseket, esetenként fertőtlenítő megoldásokat is. A legyengült immunrendszerű embereknél, akik többsége a kórházakban van, súlyos szövődményeket okoz.

Nem csoda, hogy az orvostársadalom riadót fúj. 2012-ben a WHO főigazgatója, Margaret Chan közleményt adott ki, amelyben az antibiotikumok korszakának végét jósolta, és az emberiség védtelenné válik a fertőző betegségekkel szemben. Azonban, gyakorlati lehetőségeket A kombinatorikus kémia – a gyógyszertudomány alapjai – még korántsem merült ki. A másik dolog az, hogy a fejlődés antimikrobiális szerek- egy nagyon drága folyamat, amely nem hoz olyan nyereséget, mint sok más gyógyszer. A „szuperbaktériumokról” szóló rémtörténetek tehát inkább figyelmeztetések, amelyek alternatív megoldások keresésére ösztönzik az embereket.

Bakteriofágok és immunitás

Mivel a természetben számtalan bakteriofág található, és vízzel, levegővel és táplálékkal folyamatosan bejutnak az emberi szervezetbe, az immunrendszer egyszerűen figyelmen kívül hagyja őket. Van még egy hipotézis a bélben lévő bakteriofágok szimbiózisáról, amely szabályozza a bél mikroflóráját. Valamilyen immunreakciót csak hosszan tartó beadással lehet elérni. nagy adagok fágok.

De így szinte bármilyen anyagra allergiát érhet el. Végül nagyon fontos, hogy a bakteriofágok olcsóak legyenek. A precízen kiválasztott, teljesen dekódolt genommal rendelkező bakteriofágokból álló gyógyszer kifejlesztése és előállítása, amelyet a modern biotechnológiai szabványok szerint egyes baktériumtörzseken vegytiszta tápközegben tenyésztenek és nagy tisztaságúak, nagyságrendekkel olcsóbbak, mint a modern komplex antibiotikumok.

Ez lehetővé teszi a fágterápiás készítmények gyors adaptálását a patogén baktériumok változó csoportjaihoz, valamint a bakteriofágok alkalmazását az állatgyógyászatban, ahol drága gyógyszerek gazdaságilag nem indokolt.

Az orvosi ügyeletben

Logikusnak tűnik, hogy újjáéledt az érdeklődés a bakteriofágok, a baktériumok természetes ellenségeinek alkalmazása iránt a fertőzések kezelésére. Valójában az „antibiotikumok korszakának” évtizedei alatt a bakteriofágok aktívan szolgálták a tudományt, nem az orvostudományt, hanem az alapvető molekuláris biológiát. Elég, ha megemlítjük a genetikai kód "hármasainak" dekódolását és a DNS-rekombináció folyamatát. Ma már eleget tudunk a bakteriofágokról ahhoz, hogy ésszerűen válasszuk ki a terápiás célokra alkalmas fágokat.

A bakteriofágok potenciális gyógyszerként számos előnnyel rendelkeznek. Először is számtalan van belőlük. Bár a bakteriofág genetikai apparátusának megváltoztatása is sokkal könnyebb, mint egy baktériumé, és még inkább magasabb rendű szervezetek, Ez felesleges. A természetben mindig találsz valami megfelelőt. Sokkal inkább a kiválasztásról, a kívánt tulajdonságok rögzítéséről és a szükséges bakteriofágok reprodukciójáról van szó.

Ez összehasonlítható a kutyafajták tenyésztésével - szánkózás, őrző, vadászat, vadászkutyák, harci, dekoratív ... Mindegyik kutya marad, de egy bizonyos típusú cselekvésre optimalizálták, szükséges egy személy számára. Másodszor, a bakteriofágok szigorúan specifikusak, azaz csak bizonyos típusú mikrobákat pusztítanak el anélkül, hogy gátolnák. normál mikroflóra személy.

Harmadszor, amikor egy bakteriofág talál egy baktériumot, amelyet el kell pusztítania, az életciklusa során szaporodni kezd. Így az adagolás kérdése nem lesz annyira akut. Negyedszer, a bakteriofágok nem okoznak mellékhatásokat. A terápiás bakteriofágok alkalmazása során fellépő allergiás reakciók minden esetét olyan szennyeződések okozták, amelyektől a gyógyszer nem volt megfelelően megtisztítva, vagy a baktériumok tömeges halála során felszabaduló toxinok. Az utolsó jelenség, a "Herxheimer-hatás" gyakran megfigyelhető az antibiotikumok alkalmazásakor.

Az érem két oldala

Sajnos az orvosi bakteriofágoknak is sok hiányossága van. A legfontosabb probléma a fágok nagy specificitásának előnyéből fakad. Mindegyik bakteriofág egy szigorúan meghatározott típusú baktériumot fertőz meg, még csak nem is taxonómiai fajt, hanem számos szűkebb fajtát, törzset. Viszonylagosan, mintha őrzőkutya csak a kétméteres, fekete esőkabátba öltözött gengszterekre kezdett ugatni, és egyáltalán nem reagált arra, hogy egy rövidnadrágos tinédzser bemászott a házba.

Ezért a jelenlegi fágkészítmények esetében nem ritka a hatástalan használat. Egy bizonyos törzsek ellen készült gyógyszer, amely tökéletesen kezeli a szmolenszki streptococcus mandulagyulladást, tehetetlen lehet ugyanannak a kemerovói mandulagyulladásnak minden jelével szemben. A betegség ugyanaz, ugyanaz a mikroba okozza, és a streptococcus törzsek különböző régiókban eltérőek.

A bakteriofág leghatékonyabb használatához pontos diagnosztika szükséges. patogén mikroba, feszültségig. A manapság legelterjedtebb diagnosztikai módszer - a tenyésztőoltás - sok időt vesz igénybe, és nem biztosítja a szükséges pontosságot. A gyors módszerek - polimeráz láncreakciós vagy tömegspektrometriás tipizálás - a magas felszerelési költségek és a laboránsok magasabb képesítési követelményei miatt lassan bevezetésre kerülnek. Ideális esetben a fágkomponensek kiválasztása gyógyszerkészítmény minden egyes beteg fertőzése ellen tenni lehet, de ez drága és a gyakorlatban elfogadhatatlan.

A fágok másik fontos hátránya biológiai természetük. Amellett, hogy a bakteriofágok megkövetelik különleges körülmények tárolás és szállítás, egy ilyen kezelési módszer sok spekulációt nyit meg a "személyben lévő idegen DNS" témában. És bár köztudott, hogy egy bakteriofág elvileg nem képes megfertőzni egy emberi sejtet és bejuttatni a DNS-ét, nem könnyű megváltoztatni a közvéleményt.

Biológiai természetéből adódóan és meglehetősen nagy, összehasonlítva az alacsony molekulájú gyógyszerekkel (ugyanazokkal az antibiotikumokkal), a méret a harmadik korlátot követi - a bakteriofág szervezetbe való bejuttatásának problémáját. Ha olyan mikrobiális fertőzés alakul ki, ahol a bakteriofágot közvetlenül csepp, spray vagy beöntés formájában lehet felvinni - bőrre, nyílt sebekre, égési sérülésekre, az orrgarat nyálkahártyájára, fülekre, szemekre, vastagbélre -, akkor nincs probléma.

De ha a fertőzés a belső szervekben történik, a helyzet bonyolultabb. Ismeretesek a vese- vagy lépfertőzések sikeres kezelésének esetei a bakteriofág készítmény szokásos orális adagolásával. A viszonylag nagy (100 nm) fágrészecskék gyomorból a véráramba és a belső szervekbe való behatolási mechanizmusa azonban kevéssé ismert, és betegenként nagyon eltérő. A bakteriofágok tehetetlenek a sejtek belsejében fejlődő mikrobákkal szemben is, mint például a tuberkulózis és a lepra. A falon keresztül emberi sejt bakteriofág nem tud átjutni.

Meg kell jegyezni, hogy tiltani kell a bakteriofágok és az antibiotikumok használatát orvosi célokra nem következik. Közös fellépésükkel az antibakteriális hatás kölcsönös erősödése figyelhető meg. Ez lehetővé teszi például az antibiotikumok adagjának csökkentését olyan értékekre, amelyek nem okoznak kifejezett mellékhatásokat. Ennek megfelelően a baktériumokban a kombinált gyógyszer mindkét összetevőjével szembeni rezisztencia kialakulásának mechanizmusa szinte lehetetlen.

Az antimikrobiális gyógyszerek arzenáljának bővülése több szabadságot ad a kezelési módszerek megválasztásában. Így a bakteriofágok antimikrobiális terápiában való alkalmazásának koncepciójának tudományosan alátámasztott fejlesztése ígéretes irány. A bakteriofágok nem annyira alternatívaként, hanem kiegészítőként és fokozóként szolgálnak a fertőzések elleni küzdelemben.

CM. ZAKHARENKO, az orvostudományok kandidátusa, egyetemi docens, Katonai orvosi akadémiaőket. CM. Kirov, Szentpétervár

A bakteriofágok egyedülálló mikroorganizmusok, amelyek alapján a terápiás és profilaktikus készítmények speciális csoportját hozták létre tulajdonságaikat és jellemzőit tekintve. A fágok és baktériumok közötti kölcsönhatás természetes fiziológiai mechanizmusai, amelyek működésük hátterében állnak, lehetővé teszik mindkét bakteriofág végtelen sokféleségének előrejelzését, valamint felhasználásuk lehetséges módjait. A bakteriofág kollekciók bővülésével kétségtelenül új célkórokozók jelennek meg, és bővül azoknak a betegségeknek a köre, amelyekben a fágok monoterápiaként és komplex kezelési rendek részeként egyaránt alkalmazhatók.

Így a Sextaphage polivalens piobakteriofág alkalmazása a fertőzött hasnyálmirigy-nekrózis kezelésében (E. A. Wagner akadémikusról elnevezett Perm Állami Orvosi Akadémia) lehetővé tette a homeosztázis fő paramétereinek, valamint a betegek szerveinek és rendszereinek funkcióinak gyors helyreállítását. A számban is jelentős csökkenés következett be posztoperatív szövődményekés halálozások: a standard terápiával kezelt betegek csoportjában a mortalitás 100%, míg a BF-el kezelt csoportban - 16,6%.

A BF-készítmények ártalmatlansága és reaktogenitása miatt a gyermekgyógyászati ​​gyakorlatban, így újszülötteknél is alkalmazhatók. Érdekesek a Nyizsnyij Novgorodi Regionális Gyermekklinikai Kórház tapasztalatai, ahol a járványügyi helyzet szövődményeinek időszakában a szokásos járványellenes intézkedések mellett a BP - Intesti-bakteriofágot és a BP Pseucfomonas aeruginosa-t alkalmazták. A Pseudomonas aeruginosa nosocomiális fertőzések előfordulási gyakoriságának 11-szeres csökkenése a BP használatának magas hatékonyságát mutatta. A BP-készítmények felírhatók mind a diszbakteriózis és az emésztőrendszeri rendellenességek kezelésére, mind a gyomor-bél traktus nyálkahártyájának opportunista baktériumok általi kolonizációjának megelőzésére. A BF többkomponensű készítményei ideálisak a gyomor-bélrendszeri zavarok első jeleinek azonnali enyhítésére.

A cég a mai napig számos kiemelt területet vázolt fel a terápiás és profilaktikus bakteriofágok fejlesztésére és gyártására, amelyek összhangban állnak az újonnan megjelenő globális trendekkel. Új készítményeket készítenek és vezetnek be: kifejlesztették a fogazat és enterobaktériumok elleni BF-et, folyamatban van a Helicobacter pylori elleni fágkészítmény létrehozása.

Csak egy gyártó ezeknek a gyógyszereknek - az NPO Microgen, Alla Lobastova tudományos és innovációs fejlesztési osztály helyettes vezetője szerint - évente több mint 2 millió csomagot gyárt. Sajnos sok orvos elképzelése a bakteriofágokról messze nem objektív. Kevesen tudják, hogy egyazon kórokozó ellen aktív bakteriofágok különböző családokba tartozhatnak, eltérő életciklusúak stb. A P. aeruginosa bakteriofágok például a Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae családokba tartoznak, életciklusúak vagy közepesek. Ugyanazon kórokozó különböző törzsei eltérően érzékenyek a bakteriofágokra. A legtöbb szakértő tud (hallott, valaki használt) a folyadék és a tabletta létezéséről dózisforma bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményei. Ezek spektruma azonban sokkal szélesebb, ami feltétlen előnyöknek tudható be, különösen sokféle beadási móddal kombinálva (lenyelés, beöntés, alkalmazás, sebek és nyálkahártyák öblítése, sebüregekbe való bejuttatás stb.) . A bakteriofágok nyilvánvaló előnyei hagyományosan magukban foglalják a meglehetősen korlátozott baktériumpopulációra kifejtett specifikus hatást, a korlátozott ideig fennálló (amíg a mikroorganizmusok célpopulációja eltűnik), az olyan mellékhatások hiányát, mint a toxikus és allergiás reakciók, dysbiotikus reakciók stb. Ezek a gyógyszerek különféle esetekben alkalmazhatók korcsoportokés terhesség alatt. Maguk a bakteriofágok nem jelentős allergének. A bakteriofág készítményekkel szembeni intolerancia esetei többnyire a tápközeg összetevőire adott reakcióhoz kapcsolódnak. Ennek a gyógyszercsoportnak minden nagyobb gyártója a felhasznált komponensek maximális minőségére törekszik, ami csökkenti az ilyen reakciók valószínűségét. A növekvő antibiotikum-rezisztencia összefüggésében egyes szerzők azt javasolják, hogy a bakteriofágokat tekintsék az antibiotikumok legjobb alternatívájának. A bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményei speciálisan kiválasztott kombinációk (poliklonális, erősen virulens bakteriális vírusok komplexe, amelyeket speciálisan a bakteriális fertőzések leggyakoribb kórokozócsoportjai ellen szelektálnak) koktélja a gyártó fágkollekciói alapján. A Szövetségi Állami Egységes Vállalat NPO Microgen fióktelepei Ufában, Permben és Nyizsnyij Novgorodban modern központok az ilyen gyógyszerek előállítására. Személyre szabott létrehozás képessége patogén mikroorganizmusok A bakteriofágok terápiás és profilaktikus készítményei a másik nagy előnye ennek a készítménycsoportnak. Az antimikrobiális gyógyszerekkel szembeni bakteriális rezisztencia növekedése és a modern fertőző betegségek gyakran előforduló polietiológiája kombinált antibiotikum terápiát igényel (két, három és néha több) antimikrobiális szerek). A hatékony antibiotikus terápia kiválasztásához a baktériumok gyógyszerrel szembeni tényleges érzékenysége mellett meglehetősen sok tényezőt is figyelembe kell venni. A fágterápiának ebből a szempontból is vannak bizonyos előnyei. Egyrészt a bakteriofágok kombinációjának alkalmazása nem jár együtt egymással való kölcsönhatásukkal, és nem vezet változáshoz az alkalmazási sémákban. A terápiás bakteriofágok meglévő készletén belül számos jól bevált kombináció létezik - coliproteus bakteriofág, polivalens piobakteriofág, intesti-bakteriofág. Másrészt a baktériumok nem rendelkeznek közös rezisztencia mechanizmussal az antibiotikumokkal és fágokkal szemben, ezért mind akkor használhatók, ha a kórokozó rezisztens az egyik gyógyszerrel szemben, mind az "antibiotikum + bakteriofág" kombinációban. Ez a kombináció különösen hatékony a mikrobiális biofilmek elpusztítására. A kísérlet meggyőzően kimutatta, hogy a vas-antagonisták és a bakteriofág együttes alkalmazása megzavarhatja a Klebsiella pneumoniae biofilmek képződését. Ugyanakkor mind a mikrobiális populációk számának jelentős csökkenése, mind a "fiatal" sejtek számának csökkenése figyelhető meg. Még egy fontos jellemzője A bakteriofágok hatása olyan jelenség, mint az apoptózis indukciója. Egyes E. coli törzsek olyan génekkel rendelkeznek, amelyek a T4 bakteriofág bejuttatása után sejthalált okoznak. Így a T4 fág késői génjeinek expressziójára válaszul a lit gén (olyan proteázt kódol, amely elpusztítja a fehérjeszintézishez szükséges EF-Tu elongációs faktort) blokkolja az összes sejtfehérje szintézisét. A prrC gén egy nukleázt kódol, amely a lizin tRNS-t hasítja. A nukleázt a T4 fág stp gén terméke aktiválja. A T4 fággal fertőzött sejtekben a rex gének (amelyek a fág genomjához tartoznak és lizogén sejtekben expresszálódnak) ioncsatornák képződését okozzák, ami a sejtek létfontosságú ionjainak elvesztéséhez, majd halálához vezet. Maga a T4 fág képes megakadályozni a sejtpusztulást azáltal, hogy fehérjéivel, az rII gének termékeivel lezárja a csatornákat. Az antibiotikumokkal szembeni bakteriális rezisztencia kialakulása esetén új lehetőségeket kell keresni az aktív molekula vagy alapvetően új anyagok módosítására. Sajnos az elmúlt években az új antibiotikumok bevezetésének üteme jelentősen lelassult. A bakteriofágok helyzete alapvetően más. A nagy gyártók kollekciói több tucat kész bakteriofág törzset tartalmaznak, és folyamatosan új aktív fágokkal bővülnek. Az izolált kórokozók bakteriofágokkal szembeni érzékenységének folyamatos ellenőrzésének köszönhetően a gyártók módosítják a régiókba szállított fágösszetételeket. Az adaptált bakteriofágoknak köszönhetően kiküszöbölhető az antibiotikum-rezisztens törzsek által okozott nozokomiális fertőzések kitörése.

Szájon át bevéve a bakteriofágok gyorsan elérik a fertőzés lokalizációjának gócát: gennyes-gyulladásos betegek szájon át történő bevétele esetén a fágok egy óra múlva bejutnak a vérbe, 1-1,5 óra múlva a bronchopulmonalis váladékból és az égési sérülés felszínéről kimutathatók. sebek, 2 óra elteltével - a vizeletből, valamint a craniocerebralis sérült betegek agy-gerincvelői folyadékából.

A bakteriofágok tehát egyedülálló mikroorganizmusok, amelyek alapján a terápiás és profilaktikus készítmények speciális csoportját hozták létre tulajdonságaik és jellemzőik tekintetében. A fágok és baktériumok közötti kölcsönhatás természetes fiziológiai mechanizmusai, amelyek működésük hátterében állnak, lehetővé teszik mindkét bakteriofág végtelen sokféleségének előrejelzését, valamint felhasználásuk lehetséges módjait. A bakteriofág kollekciók bővülésével kétségtelenül új célkórokozók jelennek meg, és bővül azoknak a betegségeknek a köre, amelyekben a fágok monoterápiaként és komplex kezelési rendek részeként egyaránt alkalmazhatók. A fágterápia jövőbeli sorsának modern felfogásának mind a hatásuk magas specifikusságán, mind a fágterápia összes szabályának szigorú betartásán kell alapulnia. A bakteriofágok szembeállítása az etiotróp terápia bármely eszközével téves.

Első alkalommal merült fel az a feltételezés, hogy a bakteriofágok vírusok. D. Errel. A jövőben felfedezték a gombák vírusait stb., amelyeket fágoknak neveztek.

Fág morfológia.

Méretek - 20-200nm. A legtöbb fág ebihal alakú. A legösszetettebb fágok egy nukleinsavat tartalmazó poliéder fejből, egy nyakból és folyamatokból állnak. A folyamat végén a bazális lemez, amelyből szálak és fogak nyúlnak ki. Ezek a szálak és fogak arra szolgálnak, hogy a fágot a baktériumhéjhoz rögzítsék. A folyamat távoli részében a legbonyolultabban szervezett fágok egy enzimet tartalmaznak - lizozim. Ez az enzim hozzájárul a bakteriális membrán feloldásához, amikor az NK fág behatol a citoplazmába. Sok fágban a folyamatot burok veszi körül, amely egyes fágokban összehúzódhat.

5 morfológiai csoport van

1. Bakteriofágok hosszú folyamattal és összehúzódó burokkal
2. Fágok hosszú folyamattal, de nem összehúzódó burokkal
3. Fágok rövid farokkal
4. Fágok folyamatanalóggal
5. Fonaszerű fágok

Kémiai összetétel.

A fágok nukleinsavból és fehérjékből állnak. Legtöbbjük gyűrűbe zárt, kétszálú DNS-t tartalmaz. Egyes fágok egyetlen DNS- vagy RNS-szálat tartalmaznak.

fághéj - kapszid, rendezett fehérje alegységekből - kapszomerekből áll.

A folyamat távoli részében a legbonyolultabban szervezett fágok egy enzimet tartalmaznak - lizozim. Ez az enzim hozzájárul a bakteriális membrán feloldásához, amikor az NK fág behatol a citoplazmába.

A fágok jól tűrik a fagyasztást, a 70 °C-ra melegítést és a szárítást. Érzékeny savakra, UV-sugárzásra és forrásra. A fágok specifikus sejtreceptorokkal kölcsönhatásba lépve fertőzik meg a szigorúan meghatározott baktériumokat.

Az interakció sajátossága szerint -

Polifágok – több rokon baktériumfajjal kölcsönhatásba lépnek

A monofágok - fajfágok - kölcsönhatásba lépnek egyfajta baktériummal

Típusfágok – kölcsönhatásba lépnek egy fajon belül a baktériumok egyedi változataival.

A tipikus fágok működése szerint a fajok feloszthatók fágsor. A fágok és a baktériumok kölcsönhatása továbbhaladhat produktív, produktív és integratív típus.

produktív típus- fág utódok képződnek, és a sejt lizálódik

Egy produktív- a sejt tovább él, az interakciós folyamat a kezdeti szakaszban megszakad

Integratív típus- a fág genom beépül a bakteriális kromoszómába és együtt él vele.

Az interakció típusától függően vannak virulens és mérsékelt égövi fágok.

Fertőző produktív módon lépnek kapcsolatba a baktériumokkal. Kezdetben a fág a bakteriális membránon szívódik fel specifikus receptorok kölcsönhatása miatt. A vírusos nukleinsav behatol vagy behatol a baktériumok citoplazmájába. A lizozim hatására egy kis lyuk képződik a baktérium héjában, a fág héja lecsökken, és NK-t injektálnak. A fág héja a baktériumon kívül. A következő lépés a korai fehérjék szintézise. Biztosítják a fág szerkezeti fehérjék szintézisét, a fág nukleinsav replikációját és a bakteriális kromoszómák aktivitásának visszaszorítását.

Ezt követi a fágok szerkezeti komponenseinek szintézise és a nukleinsav replikációja. Ezekből az elemekből a fágrészecskék új generációja áll össze. Az összeállítást morfogenezisnek nevezik, új részecskék, amelyekből egy baktériumban 10-100 képződhet. A baktérium további lízise és a fágok új generációjának kibocsátása a külső környezetbe.

mérsékelt égövi bakteriofágok akár produktív, akár integratív kölcsönhatásba léphetnek. A termelési ciklus ugyanúgy megy. Integratív interakcióval a mérsékelt égövi fág DNS-e a citoplazmába való belépés után egy bizonyos területen beépül a kromoszómába, és a sejtosztódás során szinkronban replikálódik a bakteriális DNS-sel, és ezek a struktúrák továbbadódnak. leánysejtek. Ilyen beépített fág DNS - prófág, a prófágot tartalmazó baktériumot pedig lizogénnek nevezzük, a jelenséget pedig az ún lizogén.

Spontán módon, vagy egy sorozat hatására külső tényezők a kromoszómából kivágható egy profág, azaz. szabad állapotba kerül, egy virulens fág tulajdonságait mutatják, amelyek a baktériumtestek új generációjának kialakulásához vezetnek - profág indukció.

A bakteriális lizogenezis a fág (lizogén) átalakulás hátterében áll. Ez a lizogén baktériumok jellemzőinek vagy tulajdonságainak megváltozása az azonos fajhoz tartozó nem lizogén baktériumokhoz képest. Különböző tulajdonságok változhatnak - morfológiai, antigén stb.

A mérsékelt égövi fágok hibásak lehetnek – nem képesek fágutódokat képezni a természetes körülményeken kívül és indukcióban.

Virion - teljes vírusrészecske, amely NK-ból és fehérjehéjból áll

A fágok gyakorlati alkalmazása -

1. Alkalmazás a diagnosztikában. Számos baktériumfajtával kapcsolatban a monofágokat alkalmazzák a fág lizabilitási reakcióban, a baktériumtenyészet azonosításának egyik kritériumaként, a tipikus fágokat fágtipizálásra, a baktériumok intraspecifikus differenciálására használják. Járványügyi céllal, a fertőzés forrásának és megszüntetésének módjainak megállapítása érdekében
2. Számos bakteriális fertőzés kezelésére és megelőzésére - hasi típusú, staphylococcus és streptococcus fertőzések (saválló tabletták)
3. A mérsékelt égövi bakteriofágokat a génsebészetben olyan vektorként használják, amely képes genetikai anyagot bevinni egy élő sejtbe.

A baktériumok genetikája

A bakteriális genom olyan genetikai elemekből áll, amelyek képesek önreplikációra - replikonok. A replikonok bakteriális kromoszómák és plazmidok. A bakteriális kromoszóma egy nukleoidot alkot, amely nem kapcsolódik zárt gyűrűben lévő fehérjékhez, és haploid génkészletet hordoz.

A plazmidok szintén a DNS-molekula zárt gyűrűi, de sokkal kisebbek, mint a kromoszóma. A plazmidok jelenléte a baktériumok citoplazmájában nem szükséges, de előnyt jelentenek környezet. A nagy plazmidok a kromoszómával redukálódnak, és számuk a sejtben kicsi. A kis plazmidok száma pedig több tízet is elérhet. Egyes plazmidok egy bizonyos régióban reverzibilisen képesek beépülni a bakteriális kromoszómába, és egyetlen replikonként működnek. Az ilyen plazmidokat integratívnak nevezzük. Egyes plazmidok közvetlen érintkezéssel átvihetők egyik baktériumból a másikba – konjugatív plazmidok. F-pillák képződéséért felelős géneket tartalmaznak, amelyek konjugatív hidat képeznek a genetikai anyag átviteléhez.

A plazmidok fő típusai a

F - integratív kongatív plazmid. A nemi faktor határozza meg a baktériumok azon képességét, hogy donorok legyenek a konjugáció során

R - plazmidok. Ellenálló. Olyan géneket tartalmaz, amelyek meghatározzák az antibakteriális gyógyszereket elpusztító tényezők szintézisét. Az ilyen plazmidokkal rendelkező baktériumok sok gyógyszerre nem érzékenyek. Ezért kialakul egy gyógyszerrezisztens faktor.

Plazmid tox – a patogenitást meghatározó tényezők –

Az Ent - plazmid - tartalmazza az enterotoxinok termelődésének génjét.

Hly - elpusztítja a vörösvértestet.

mobil genetikai elemek. Ide tartoznak a betétek - beillesztési elemek. Az általánosan elfogadott megnevezés az Is. Ezek olyan DNS-szakaszok, amelyek a replikonon belül és közöttük is mozoghatnak. Csak a saját mozgásukhoz szükséges géneket tartalmazzák.

transzpozonok- nagyobb struktúrák, amelyek tulajdonságai megegyeznek az Is-szel, de emellett olyan szerkezeti géneket tartalmaznak, amelyek meghatározzák a biológiai anyagok, például a toxinok szintézisét. A transzponálható genetikai elemek géninaktivációt, a genetikai anyag károsodását, replikonfúziót és génproliferációt okozhatnak egy baktériumpopulációban.

változatosság a baktériumokban.

A variabilitás minden típusa 2 csoportra osztható - nem örökletes (fenotipikus, módosítás) és örökletes (genotipikus).

Módosítások- a tulajdonságok vagy tulajdonságok fenotípusos, nem örökölhető változásai. A módosítások nem befolyásolják a genotípust, ezért nem öröklődnek. Ezek adaptív válaszok bizonyos környezeti feltételek változásaira. Általában az első generációban, a faktor megszűnése után elvesznek.

Genotípusos variabilitás befolyásolja a szervezet genotípusát, ezért átterjedhet leszármazottaira. A genotípus variabilitás mutációkra és rekombinációkra oszlik.

Mutációk- tartós, öröklött változások a szervezet jellemzőiben vagy tulajdonságaiban. A mutációk alapja a minőségi ill mennyiségi változás nukleotidszekvenciája egy DNS-molekulában. A mutációk szinte bármilyen tulajdonságot megváltoztathatnak.

Eredetüknél fogva a mutációk spontának és indukáltak.

Spontán mutációk a szervezet létezésének természetes körülményei között fordul elő, ill indexelt a mutagén faktor irányított hatásának eredményeként keletkeznek. A baktériumokban a DNS elsődleges szerkezetében bekövetkező változások természete szerint megkülönböztetik a gén- vagy pontmutációkat és a kromoszóma-rendellenességeket.

Génmutációk egyetlen génen belül fordulnak elő, és minimálisan befognak egy nukleotidot. Ez a fajta mutáció az egyik nukleotid másikkal való helyettesítéséből, egy nukleotid elvesztéséből vagy egy további beiktatásából származhat.

Kromoszómális- több kromoszómát is érinthet.

Előfordulhat deléció – egy kromoszómaszegmens elvesztése, duplikáció – egy kromoszómaszegmens megkettőződése. Egy kromoszómaszegmens 180 fokos elforgatása inverzió.

Bármely mutáció egy bizonyos mutagén faktor hatására következik be. A mutagének természetüknél fogva fizikai, kémiai és biológiai eredetűek. ionizáló sugárzás, röntgensugarak, UV sugarak. Kémiai mutagénekhez - analógokhoz nitrogéntartalmú bázisok, maga a salétromsav, sőt egyes gyógyszerek, citosztatikumok is. Biológiai - néhány vírus és transzfazon

Rekombináció- a kromoszómák részeinek cseréje

Transzdukció – genetikai anyag átvitele bakteriofág által

Genetikai anyag javítása - a mutációkból eredő károsodások helyreállítása.

Többféle jóvátétel létezik

1. Fotoreaktiváció - ezt a folyamatot egy speciális enzim biztosítja, amely a jelenlétében aktiválódik látható fény. Ez az enzim a DNS-lánc mentén mozog, és helyreállítja a sérüléseket. Egyesíti a kakukkfűt, amely az UV hatására keletkezik. A sötét jóvátétel eredményei jelentősebbek. Nem függ a fénytől, és több enzim biztosítja - először a nukleázok kivágják a DNS-lánc sérült szakaszát, majd a DNS-polimeráz foltot szintetizál a maradék komplementer lánc mátrixán, és a ligázok varrják be a foltot a sérült területre. .

A génmutációk javuláson mennek keresztül, de a kromoszómális mutációk általában nem.

1. Genetikai rekombináció baktériumokban. Jellemzője, hogy egy donor baktérium genetikai anyagának behatolása a recipiens baktériumba egy leánygenom kialakításával, amely mindkét eredeti egyed génjeit tartalmazza.

A donor DNS-fragmensének beépülése a recipiensbe keresztezéssel történik

Háromféle átvitel -

1. átalakítás- az a folyamat, amelynek során az izolált donor DNS-fragmentuma átkerül. A recipiens kompetenciájától és a donor DNS állapotától függ. Kompetencia- a DNS felszívó képessége. Ez attól függ, hogy a recipiens sejtmembránjában vannak-e specifikus fehérjék, és ben képződik bizonyos időszakokban bakteriális növekedés. A donor DNS-nek kétszálúnak és nem túl nagy méretűnek kell lennie. A donor DNS áthatol a baktérium membránján, az egyik lánc elpusztul, a másik beépül a recipiens DNS-ébe.
2. transzdukció- bakteriofágok segítségével hajtják végre. Általános transzdukció és specifikus transzdukció.

Tábornok - virulens tényezők részvételével történik. A részecskefágok összeállítása során a fágfej tévedésből nem fág DNS-t tartalmazhat, hanem a bakteriális kromoszóma egy darabját. Az ilyen fágok hibás fágok.

Különleges- mérsékelt fágok végzik. Kivágáskor szigorúan a szegély mentén történik a kivágás, bizonyos gének közé beillesztve azokat továbbítják.

1. konjugáció- genetikai anyag átvitele a donor baktériumából a recipiensbe, közvetlen érintkezés esetén. Szükséges állapot- kongatív plazmid jelenléte a donor sejtben. A pili miatti konjugáció során konjugációs híd képződik, amelyen keresztül a genetikai anyag a donortól a pácienshez kerül.

Géndiagnosztika

A vizsgált anyagban lévő mikroorganizmus vagy annak fragmentuma genomjának azonosítására szolgáló módszerek összessége. Elsőként az NC hibridizációs módszert javasolták. A komplementaritás elve alapján. Ez a módszer lehetővé teszi a kórokozó marker DNS-fragmenseinek jelenlétét a genetikai anyagban molekuláris próbák segítségével. A molekuláris próbák rövid DNS-szálak, amelyek komplementerek egy markerhellyel. A szondába címkét vezetnek be - fluorokróm, radioaktív izotóp, enzim. A vizsgálati anyagot olyan speciális kezelésnek vetik alá, amely lehetővé teszi a mikroorganizmusok elpusztítását, a DNS felszabadítását és egyszálú fragmensekre való felosztását. Ezt követően az anyagot rögzítik. Ezután a címkeaktivitás észlelhető. Ez a módszer nem túl érzékeny. A kórokozó azonosítása csak kellően nagy számmal lehetséges. 10-4 mikroorganizmus. Technikailag meglehetősen bonyolult, és nagyszámú szondát igényel. A gyakorlatban nem alkalmazták széles körben. Lett tervezve új módszer - polimeráz láncreakció- PCR.

Ez a módszer a DNS és a vírus RNS replikációs képességén alapul, azaz. az önreprodukcióhoz. A páciens lényege az ismételt másolás - egy DNS-fragmens in vitro amplifikációja, amely egy adott mikroorganizmus markere. Mivel az eljárás kellően magas, 70-90 °C hőmérsékleten megy végbe, a módszer a hőstabil DNS polimeráz termofil baktériumokból történő izolálása után vált lehetővé. Az amplifikáció mechanizmusa olyan, hogy a DNS-láncok másolása nem minden ponton, hanem csak bizonyos kiindulási blokkoknál kezdődik meg, amelyek létrehozásához úgynevezett primereket használnak. A primerek olyan polinukleotid szekvenciák, amelyek komplementerek a kívánt DNS lemásolt fragmensének végszekvenciájával, és a primerek nemcsak amplifikációt indítanak el, hanem korlátozzák is. Most több lehetőség van a PCR-re, 3 szakasz jellemző -

1. DNS denaturáció (1 szálú fragmentumokra való szétválasztás)
2. Alapozó rögzítés.
3. A DNS-szálak ingyenes kiterjesztése 2 szálra

Ez a ciklus 1,5-2 percig tart. Ennek eredményeként a DNS-molekulák száma 20-40-szeresére nő. Az eredmény a másolatok 10-8. Az amplifikáció után elektroforézist hajtunk végre, és csíkok formájában izoláljuk. Benne van tartva speciális eszköz, amit erősítőnek neveznek.

A PCR előnyei

1. Közvetlenül jelzi a kórokozó jelenlétét a vizsgált anyagban, tiszta tenyészet izolálása nélkül.
2. Nagyon magas érzékenység. Elméletileg megtalálhatja az 1. sz.
3. A kutatásra szánt anyag a mintavétel után azonnal fertőtleníthető.
4. 100%-os specifitás
5. Gyors eredmények. Teljes elemzés- 4-5 óra. Expressz módszer.

Széles körben alkalmazzák olyan fertőző betegségek diagnosztizálására, amelyek kórokozói nem tenyésztett vagy nehezen tenyészthető szervezetek. Chlamydia, mycoplasma, sok vírus - hepatitis, herpesz. Tesztrendszereket fejlesztettek ki lépfene, tuberkulózis meghatározására.

Restrikciós elemzés- enzimek segítségével a DNS-molekulát bizonyos nukleoidszekvenciák szerint felosztják és a fragmentumokat összetételük szerint elemzik. Így egyedi oldalakat találhat.

Biotechnológia és géntechnológia

A biotechnológia olyan tudomány, amely az élő szervezetek létfontosságú folyamatainak tanulmányozása alapján ezeket a biofolyamatokat, valamint magukat a biológiai objektumokat felhasználja az ember számára szükséges termékek ipari előállítására, olyan biohatások reprodukálására, amelyek nem jelentkeznek. természetellenes körülmények között. Biológiai objektumként leggyakrabban egysejtű mikroorganizmusokat, valamint sejteket, állatokat és növényeket használnak. A sejtek nagyon gyorsan szaporodnak, ami lehetővé teszi a termelő biomassza rövid időn belüli növelését. Jelenleg bioszintézis összetett anyagok, mint például a fehérjék, antibiotikumok, gazdaságosabbak és technológiailag könnyebben hozzáférhetőek, mint más típusú nyersanyagok.

A biotechnológia magát a sejteket használja a céltermék forrásaként, valamint a sejt által szintetizált nagy molekulákat, enzimeket, toxinokat, antitesteket, valamint elsődleges és másodlagos metabolitokat - aminosavakat, vitaminokat, hormonokat. A mikrobiális és sejtszintézis termékek előállításának technológiája több tipikus szakaszra redukálódik - a termelő központ kiválasztására vagy létrehozására. Az optimális táptalaj kiválasztása, termesztése. A céltermék izolálása, tisztítása, standardizálása, adagolási formája. A géntechnológia egy személy számára szükséges céltermék létrehozására redukálódik. A kapott célgént fuzionáltatják egy vektorral, és a vektor lehet plazmid, és beépíthető a befogadó sejtbe. Recipiens - baktérium - Escherichia coli, élesztő. A rekombinánsok által szintetizált céltermékeket izolálják, tisztítják és a gyakorlatban felhasználják.

Elsőként az inzulint és a humán interferont hozták létre. Eritropoetin, növekedési hormon, monoklonális antitestek. Hepatitis B vakcina.

A bakteriofág gi vagy a fágok (más görög φᾰγω szóból: „Én zabálok”) olyan vírusok, amelyek szelektíven fertőzik meg a baktériumsejteket. Leggyakrabban a bakteriofágok a baktériumok belsejében szaporodnak, és lízisüket okozzák. A bakteriofág általában egy fehérjehéjból és egy egyszálú vagy kétszálú nukleinsav (DNS vagy ritkábban RNS) genetikai anyagából áll. A bakteriofágok teljes száma a természetben megközelítőleg megegyezik a baktériumok teljes számával (1030-1032 részecske). A bakteriofágok aktívan részt vesznek a ciklusban vegyi anyagokés energia, markáns hatással vannak a mikrobák és baktériumok evolúciójára A tipikus bakteriofág miovírus szerkezete.

A bakteriofágok szerkezete 1 - fej, 2 - farok, 3 - nukleinsav, 4 - kapszid, 5 - "gallér", 6 - farokfehérje borítás, 7 - farokszál, 8 - tüskék, 9 - alaplemez

A bakteriofágok kémiai szerkezetükben, a nukleinsav típusában, morfológiájában és a baktériumokkal való kölcsönhatásban különböznek egymástól. A bakteriális vírusok százszor és ezerszer kisebbek, mint a mikrobiális sejtek. Egy tipikus fágrészecske (virion) egy fejből és egy farokból áll. A farok hossza általában a fej átmérőjének 2-4-szerese. A fej genetikai anyagot - egyszálú vagy kétszálú RNS-t vagy DNS-t tartalmaz a transzkriptáz enzimmel inaktív állapotban, fehérje vagy lipoprotein héjjal körülvéve - egy kapszid, amely megőrzi a genomot a sejten kívül. A nukleinsav és a kapszid együtt alkotják a nukleokapszidot. A bakteriofágok ikozaéderes kapsziddal rendelkezhetnek, amely egy vagy két specifikus fehérje több másolatából áll össze. Általában a sarkok a fehérje pentamereiből állnak, és mindkét oldal támasztéka ugyanazon vagy hasonló fehérje hexamereiből áll. Ezenkívül a fágok lehetnek gömb alakúak, citrom alakúak vagy pleomorf alakúak. A farok vagy folyamat egy fehérjecső - a fej fehérjehéjának folytatása, a farok tövében egy ATPáz található, amely regenerálja az energiát a genetikai anyag befecskendezéséhez. Vannak rövid folyamatú, folyamat nélküli, fonalas bakteriofágok is.

A bakteriofágok rendszertana Az izolált és vizsgált bakteriofágok nagy száma határozza meg rendszerezésük szükségességét. Ezt a Vírusok Taxonómiájának Nemzetközi Bizottsága (ICTV) végzi. Jelenleg szerint Nemzetközi osztályozásés a vírusok nómenklatúrája, a bakteriofágokat a nukleinsav típusától és morfológiájától függően osztják fel. Jelenleg tizenkilenc családot különböztetnek meg. Ezek közül csak kettő RNS-tartalmú, és csak öt család burkolt. A DNS-tartalmú vírusok családjai közül csak két család rendelkezik egyszálú genommal. Kilenc DNS-tartalmú családban a genomot körkörös DNS képviseli, míg a másik kilencben lineáris. Kilenc család csak baktériumokra specifikus, a fennmaradó kilenc archaeára jellemző, és (Tectiviridae) baktériumokat és archaeákat is megfertőz.

Bakteriofág kölcsönhatása bakteriális sejtekkel A bakteriofág és a baktériumsejt kölcsönhatásának jellege szerint virulens és mérsékelt égövi fágokat különböztetünk meg. A virulens fágok száma csak a lítikus ciklus során növekedhet. A virulens bakteriofág és a sejt kölcsönhatásának folyamata több szakaszból áll: a bakteriofág adszorpciója a sejten, behatolás a sejtbe, a fágkomponensek bioszintézise és összeállítása, valamint a bakteriofágok kilépése a sejtből. Kezdetben a bakteriofágok a baktériumsejt felszínén lévő fágspecifikus receptorokhoz kapcsolódnak. A fág farka a végén található enzimek (főleg lizozim) segítségével lokálisan feloldja a sejtmembránt, összehúzódik, és a fejben lévő DNS bejut a sejtbe, míg a bakteriofág fehérjehéja kívül marad. . Az injektált DNS a sejtanyagcsere teljes átstrukturálását idézi elő: a bakteriális DNS, RNS és fehérjék szintézise leáll. A bakteriofág DNS átírása megkezdődik a saját transzkriptáz enzim segítségével, amely a baktériumsejtbe való belépés után aktiválódik. Szintetizált először korai, majd későn és. A gazdasejt riboszómáiba bekerülő RNS, ahol korai (DNS polimerázok, nukleázok) és késői (kapszid- és farokfehérjék, lizozim, ATPáz és transzkriptáz enzimek) bakteriofág fehérjék szintetizálódnak. A bakteriofág DNS-replikáció félig konzervatív mechanizmus szerint történik, és saját DNS-polimerázai részvételével történik. A késői fehérjék szintézise és a DNS-replikáció befejezése után következik be a végső folyamat - a fágrészecskék érése vagy a fág-DNS kombinációja egy burokfehérjével és érett fertőző fágrészecskék képződése.

Életciklus A mérsékelt és virulens bakteriofágok a baktériumsejttel való kölcsönhatás kezdeti szakaszában azonos ciklussal rendelkeznek. Bakteriofágok adszorpciója fágspecifikus sejtreceptorokon. Fág nukleinsav injektálása gazdasejtbe. Fág és bakteriális nukleinsavak együttes replikációja. Sejtosztódás. Továbbá a bakteriofág két modell szerint fejlődhet: lizogén vagy litikus úton. Az osztódás után mérsékelt bakteriofágok profázis állapotban vannak (lizogén út) A virulens bakteriofágok litikus modell szerint fejlődnek: A fág nukleinsavja irányítja a fág enzimek szintézisét, ehhez a baktérium fehérjeszintetizáló apparátusát használja. A fág így vagy úgy inaktiválja a gazdaszervezet DNS-ét és RNS-ét, és a fág enzimei teljesen felhasítják; A fág RNS „leigázza” a fehérjeszintézis sejtrendszerét. A fág nukleinsav replikálja és irányítja az új burokfehérjék szintézisét. Új fágrészecskék keletkeznek a fehérjehéj (kapszid) spontán önszerveződésének eredményeként a fág nukleinsav körül; fág RNS szabályozása alatt lizozim szintetizálódik. Sejtlízis: a sejt lizozim hatására felrobban; körülbelül 200-1000 új fág szabadul fel; a fágok más baktériumokat is megfertőznek.

Alkalmazása Az orvostudományban A bakteriofágok egyik felhasználási területe az antibiotikum terápia alternatívája az antibiotikumok szedésének. Például bakteriofágokat használnak: streptococcus, staphylococcus, klebsiella, vérhas és irrigációs alent, pyobacteriophage, coli, proteus és coliproteus és mások. 13 regisztrált és kérelmezett Oroszországban gyógyászati ​​készítmények fágokon alapul. Jelenleg olyan bakteriális fertőzések kezelésére használják, amelyek nem érzékenyek a hagyományos antibiotikum-kezelésre, különösen a Georgiai Köztársaságban. Általában a bakteriofágok alkalmazása sikeresebb, mint az antibiotikumok, ahol poliszacharidokkal bevont biológiai membránok vannak, amelyeken az antibiotikumok általában nem hatolnak át. Jelenleg terápiás felhasználás a bakteriofágokat nyugaton nem hagyták jóvá, bár a fágokat élelmiszermérgezést okozó baktériumok, például a listeria elpusztítására használják. Sok éves tapasztalattal egy nagyvárosi volumenben és vidéki táj a dysentericus bakteriofág szokatlanul magas terápiás és profilaktikus hatékonysága bizonyított (P. M. Lerner, 2010). Oroszországban már régóta készítenek terápiás fágkészítményeket, a fágokat már az antibiotikumok előtt kezelték. Az elmúlt években a fágokat széles körben alkalmazták a krimszki és habarovszki árvizek után a vérhas megelőzésére.

A biológiában a bakteriofágokat a génsebészetben DNS-szakaszok átvitelére szolgáló vektorként használják, de lehetséges a gének természetes átvitele a baktériumok között bizonyos fágok segítségével (transzdukció). A fágvektorokat általában egy kétszálú lineáris DNS-molekulát tartalmazó mérsékelt égövi λ bakteriofág alapján hozzák létre. A fág bal és jobb karja rendelkezik a lítikus ciklushoz (replikáció, szaporodás) szükséges összes génnel. középső része A λ bakteriofág genom (a lizogént, azaz a baktériumsejt DNS-ébe való beépülését szabályozó géneket tartalmaz) nem nélkülözhetetlen a szaporodásához, és megközelítőleg 25 ezer bázispár. Ez a rész helyettesíthető idegen DNS-fragmenssel. Az ilyen módosított fágok átmennek a lítikus cikluson, de lizogén nem megy végbe. Bakteriofág λ-alapú vektorokat használnak legfeljebb 23 kb méretű eukarióta DNS-fragmensek (azaz nagyobb gének) klónozására. Ezenkívül az inszertek nélküli fágok 38 kbp-nál kisebbek. vagy éppen ellenkezőleg, túl nagy betétekkel - több mint 52 kb. ne fejlődjenek ki és ne fertőzzék meg a baktériumokat. Mivel a bakteriofágok szaporodása csak élő sejtekben lehetséges, a bakteriofágok segítségével meghatározható a baktériumok életképessége. Ennek az iránynak nagy kilátásai vannak, hiszen a különböző biotechnológiai folyamatok egyik fő kérdése a felhasznált kultúrák életképességének meghatározása. A sejtszuszpenziók elektro-optikai analízisének módszerével kimutatták, hogy lehetséges a fág-mikrobiális sejt közötti kölcsönhatás szakaszainak tanulmányozása.

És az állatgyógyászatban is: megelőzés és kezelés bakteriális betegségek madarak és állatok; a szem nyálkahártyájának, szájüregének gennyes-gyulladásos betegségeinek kezelése; égési sérülések, sebek, sebészeti beavatkozások gennyes-gyulladásos szövődményeinek megelőzése; a géntechnológiában: transzdukcióhoz - a gének természetes átviteléhez a baktériumok között; mint vektorok, amelyek átviszik a DNS szakaszait; fágok használatával lehetőség van a gazda DNS genomjában irányított változások létrehozására; élelmiszeriparban: nagy mennyiségben fágtartalmú szerek már fogyasztásra kész hús- és baromfitermékeket dolgoznak fel; a bakteriofágokat élelmiszeripari termékek előállításához használják húsból, baromfihúsból, sajtokból, növényi termékekből stb.;

a mezőgazdaságban: fágkészítmények permetezése a növények és a haszonnövények pusztulásától és bakteriális betegségektől való védelmére; az állatállomány és a baromfi fertőzések és bakteriális betegségek elleni védelme; a környezetbiztonság érdekében: magvak és növények antibakteriális kezelése; élelmiszer-feldolgozó vállalkozások helyiségeinek takarítása; a munkaterület és a berendezések fertőtlenítése; a kórházi helyiségek megelőzése; környezetvédelmi tevékenységek végzése

Így ma a bakteriofágok nagyon népszerűek az emberi és állati életben. A terápiás és profilaktikus bakteriofágok fejlesztésének és előállításának számos kiemelt területe körvonalazódott a vállalkozásoknál, amelyek összhangban állnak az újonnan megjelenő globális trendekkel. Számos betegség kezelésére új gyógyszereket hoznak létre és vezetnek be. Bakteriológusok, virológusok, biokémikusok, genetikusok, biofizikusok, molekuláris biológusok, kísérleti onkológusok, géntechnológiai és biotechnológiai szakemberek foglalkoznak a bakteriofágok tanulmányozásával és felhasználásával.