Faktori koagulacije plazme. GPM.1.8.2.0003.15 Određivanje aktivnosti faktora koagulacije krvi

Faktor koagulacije VIII ( Faktor koagulacije VIII)

Klinička i farmakološka grupa

Faktor droga VIII koagulacija krv

farmakološki efekat

hemostatski lijek. Pospješuje prijelaz protrombina u trombin i stvaranje fibrinskog ugruška.

Farmakokinetika

Kod pacijenata sa hemofilijom A T 1/2 je 12 sati.Aktivnost faktora zgrušavanja krvi VIII se smanjuje za 15% u roku od 12 sati Faktor koagulacije krvi VIII je termolabilan i brzo se uništava kada se temperatura povisi, što dovodi do smanjenja T 1/2.

Doziranje

Oktanat se primjenjuje intravenozno nakon razrjeđivanja vodom za injekcije, koja je uključena u paket. Doza i trajanje oktanata zamjenska terapija zavisi od stepena nedostatka faktora zgrušavanja krvi VIII, lokacije i trajanja krvarenja, kliničko stanje pacijent.

Doza lijeka izražena je u međunarodnim jedinicama (IU) u skladu sa prihvaćenim standardima SZO za faktor koagulacije krvi VIII. Aktivnost faktora zgrušavanja krvi VIII u plazmi izražava se ili u procentima (u odnosu na normalan sadržaj faktora u ljudskoj plazmi), ili u IU (u odnosu na Međunarodni standard za faktor koagulacije VIII).

1 IU faktora koagulacije VIII je ekvivalentno 1 ml normalne ljudske plazme. Proračun potrebne doze zasniva se na empirijski dobijenim rezultatima, prema kojima 1 IU/kg faktora zgrušavanja krvi VIII povećava nivo faktora u plazmi za 1,5-2% normalnog sadržaja. Za izračunavanje doze potrebne za pacijenta, određuje se početni nivo aktivnosti faktora zgrušavanja krvi VIII i procjenjuje se za koliko je potrebno povećati ovu aktivnost.

Potrebna doza = tjelesna težina (kg) × željeno povećanje faktora zgrušavanja VIII (%) (IU/dl) × 0,5.

Količina i učestalost upotrebe lijeka uvijek treba odgovarati kliničkoj djelotvornosti u svakom pojedinačnom slučaju.

U slučaju naknadnog krvarenja, nivo aktivnosti faktora koagulacije krvi VIII ne bi trebalo da se smanji ispod početnog nivoa u plazmi (% normalnog sadržaja) u odgovarajućem vremenskom periodu. Sljedeća tabela se može koristiti kao smjernica za odabir doze faktora koagulacije VIII za razna krvarenja i hirurške intervencije.

Pacijenti reaguju na davanje lijeka pojedinačno, dok postoji različit nivo oporavak in vivo, T 1/2 faktor koagulacije VIII karakteriše varijabilnost. Stoga, tokom liječenja, kako bi se regulirala doza i učestalost primjene, potrebno je pratiti njen nivo. Aktivnost faktora koagulacije krvi VIII treba pratiti tokom supstitucione terapije, posebno tokom velikih hirurških intervencija.

Doze navedene u tabeli su indikativne. Liječnik određuje potrebnu dozu i učestalost primjene lijeka pojedinačno.

Sa ciljem da dugoročna prevencija krvarenje kod teške hemofilije A lijek se propisuje u dozi od 20-40 IU / kg tjelesne težine svaka 2-3 dana. U nekim slučajevima, posebno kod mladih pacijenata, može biti potrebno smanjiti interval između injekcija ili povećati dozu.

Neki pacijenti se mogu razviti nakon liječenja inhibitorna antitela faktoru koagulacije VIII, što može uticati na efikasnost dalji tretman. Ako se, u pozadini terapije koja je u toku, ne primijeti očekivano povećanje aktivnosti faktora VIII ili izostane potreban hemostatski učinak, preporučuje se konzultacija sa specijalistom. centar za lečenje koristeći Bethesda test. Terapija indukcije imunološke tolerancije može se koristiti za eliminaciju inhibitora faktora koagulacije VIII. Njegova osnova je dnevna primena faktora zgrušavanja krvi VIII u koncentraciji koja je veća od blokirajuće sposobnosti inhibitora (100-200 IU/kg/dan, u zavisnosti od titra inhibitora). Faktor koagulacije krvi VIII, djelujući kao antigen, izaziva povećanje titra inhibitora sve dok se ne razvije tolerancija, tj. do smanjenja i naknadnog nestanka inhibitora. Terapija je kontinuirana i traje u prosjeku od 10 do 18 mjeseci. Takav tretman treba da sprovode samo stručnjaci iz oblasti antihemofilne terapije.

Otapanje liofilizata

1. Preporučuje se da se rastvarač (voda za injekcije) i liofilizat u zatvorenim bočicama sobnoj temperaturi. Ako se prije zagrijavanja koristi rastvarač vodeno kupatilo, treba voditi računa da voda ne dođe u kontakt sa gumenim čepovima ili poklopcima bočica. Temperatura vodenog kupatila ne bi trebalo da prelazi 37°C.

2. Skinite zaštitne poklopce sa boca sa liofilizatom i vodom, dezinfikujte gumene čepove obe boce jednom od dezinfekcionih maramica.

3. Oslobodite kratak kraj igle sa dva kraja iz plastične ambalaže, probušite njime čep boce za vodu i gurnite je dole dok se ne zaustavi.

4. Okrenite bocu s vodom iglom, otpustite dugi kraj igle sa dva kraja, probušite njime čep bočice sa liofilizatom i pritisnite dole dok se ne zaustavi. Vakuum u bočici liofilizata će uvući vodu.

5. Odvojite bocu sa vodom zajedno sa iglom od boce sa liofilizatom. Lijek će se brzo otopiti; da biste to učinili, boca se mora lagano protresti. Dozvoljena je upotreba samo bezbojna, prozirna ili blago opalescentna otopina bez sedimenta.

Pravila za pripremu i primjenu otopine

Kao mjeru predostrožnosti, potrebno je pratiti broj otkucaja srca prije i tokom primjene lijeka Octanate. U slučaju izraženog ubrzanja pulsa, usporiti ili prekinuti primjenu lijeka.

Nakon što otopite koncentrat prema uputstvu, skinite zaštitni omotač sa igle filtera i ubacite ga u bočicu sa koncentratom. Skinite poklopac sa igle filtera i pričvrstite špric. Okrenite bočicu sa štrcaljkom naopako i uvucite rastvor u špric. Injekcije treba provoditi u skladu s pravilima asepse i antisepse. Odvojite iglu filtera od šprica i umesto nje pričvrstite leptir iglu.

Otopinu treba davati intravenozno polako brzinom od 2-3 ml/min.

Ako se koristi više od jedne bočice oktanata, špric i leptir igla se mogu ponovo koristiti.

Igla filtera je samo za jednokratnu upotrebu. Za uvlačenje pripremljenog rastvora u špric uvek koristite iglu sa filterom.

Svaki neiskorišćeni rastvor leka treba odložiti u skladu sa postojećim propisima.

Predoziranje

Uprkos činjenici da simptomi predoziranja faktorom VIII nisu uočeni, preporučuje se da se ne prekorači propisana doza.

interakcija lijekova

Podaci o interakciji Oktanata sa drugima lijekovi nedostaje.

Trudnoća i dojenje

Primjena lijeka tijekom trudnoće i dojenja moguća je u slučajevima kada je očekivana korist terapije za majku veća potencijalni rizik za fetus ili novorođenče.

Nuspojave

Alergijske reakcije: rijetko - angioedem, peckanje u području injekcije, zimica, valovi vrućine, urtikarija (uključujući generaliziranu), glavobolja, pad krvnog pritiska, letargija, mučnina, povraćanje, anksioznost, tahikardija, osećaj pritiska prsa, kratak dah, groznica, osećaj drhtavice. Vrlo rijetko (<1/10 000) эти симптомы могут прогрессировать до развития тяжелой анафилактической реакции, включая шок.

Pacijenti s hemofilijom A mogu razviti antitijela (inhibitore) na faktor zgrušavanja krvi VIII (<1/1000). Наличие ингибиторов приводит к неудовлетворительному клиническому ответу на введение препарата. В таких случаях рекомендуется обращаться в специализированные гематологические/гемофильные центры. Неоходимо обследовать пациента на наличие антител с помощью соответствующих методов (тест Бетезда).

Uslovi skladištenja

Lijek treba čuvati na mjestu zaštićenom od svjetlosti i van domašaja djece na temperaturi od 2° do 25°C; ne smrzavati. Rok trajanja - 3 godine.

specialne instrukcije

Prilikom upotrebe lijeka moguć je razvoj reakcija preosjetljivosti, kao i kod upotrebe drugih injekcijskih lijekova proteinskog porijekla.

Osim faktora koagulacije krvi VIII, lijek sadrži i količine drugih proteina krvi u tragovima. Rani znakovi reakcija preosjetljivosti su koprivnjača, stezanje u grudima, kratak dah, nizak krvni tlak i anafilaksija (teška alergijska reakcija). Ako se jave ovi simptomi, primjenu lijeka treba odmah prekinuti. U slučaju razvoja šoka treba koristiti savremene metode anti-šok terapije.

U slučaju lijekova dobivenih iz ljudske krvi ili plazme, ne može se potpuno isključiti mogućnost prijenosa infektivnih agenasa. To se odnosi i na patogene nepoznatih bolesti. Međutim, rizik od prenošenja infektivnih agenasa smanjuje se sljedećim mjerama:

- odabir donora putem medicinskih intervjua i pregleda, kao i skrining plazma pulova na prisustvo antigena virusa hepatitisa B (HBV), antitela na HIV i virus hepatitisa C (HCV);

— analiza plazma pulova na prisustvo HCV genetskog materijala;

— procedure inaktivacije/uklanjanja uključene u proces proizvodnje koje su validirane u virusnom modelu. Ove procedure su efikasne za HIV, virus hepatitisa A (HAV), HBV i HCV. Postupci inaktivacije/uklanjanja mogu imati ograničenu efikasnost protiv virusa bez ovojnice, od kojih je jedan parvovirus B19. Parvovirus B19 može izazvati ozbiljne reakcije kod seronegativnih trudnica (intrauterina infekcija) i kod osoba koje su imunokompromitovane ili imaju povećanu proizvodnju crvenih krvnih zrnaca (na primjer, s hemolitičkom anemijom).

Prilikom primjene koncentrata faktora koagulacije VIII iz plazme, preporučuje se vakcinacija protiv hepatitisa A i hepatitisa B.

U slučaju alergijskih reakcija, pacijenta treba pregledati na prisustvo inhibitora. Pacijenti sa inhibitorima faktora zgrušavanja krvi VIII mogu povećati rizik od anafilaktičkih reakcija tokom naknadnog liječenja Octanatom. Stoga, prvu primjenu navedenog lijeka prema receptu ljekara treba provesti pod medicinskim nadzorom u uvjetima koji osiguravaju pružanje kvalificirane medicinske njege u slučaju alergijskih reakcija.

Nemojte koristiti druge lijekove tokom primjene Octanatea.

Za uvođenje Octanate-a treba koristiti samo uređaje za ubrizgavanje uključene u paket. Na unutrašnjoj površini nekih injekcijskih uređaja moguća je adsorpcija faktora zgrušavanja krvi VIII, što dovodi do smanjenja efikasnosti liječenja.

Primjena u djetinjstvu

Primjena je moguća prema režimu doziranja.

Informacije o studiji

Specialne instrukcije: Ne provodite istraživanje tokom akutnog perioda bolesti i tokom uzimanja antikoagulansa (mora proći najmanje 30 dana nakon otkazivanja). Biomaterijal za istraživanje se mora uzeti na prazan želudac. Između posljednjeg obroka i uzorkovanja krvi treba proći najmanje 8 sati.

OPŠTA PRAVILA PRIPREME ZA ISTRAŽIVANJE:

1. Za većinu studija preporučuje se davanje krvi ujutro, između 8 i 11 sati, na prazan želudac (najmanje 8 sati treba proći između posljednjeg obroka i uzimanja krvi, vodu možete piti kao i obično), uoči studije, lagana večera uz ograničenje masne hrane. Za testove na infekciju i hitne pretrage, prihvatljivo je davanje krvi 4-6 sati nakon posljednjeg obroka.

2. PAŽNJA! Posebna pravila pripreme za brojne pretrage: strogo na prazan želudac, nakon 12-14 sati gladovanja, treba dati krv na gastrin-17, lipidni profil (ukupni holesterol, HDL holesterol, LDL holesterol, VLDL holesterol, trigliceridi, lipoprotein (a), apolipo-proten A1, apolipoprotein B); test tolerancije na glukozu radi se ujutro na prazan želudac nakon 12-16 sati gladovanja.

3. Uoči istraživanja (u roku od 24 sata) isključiti alkohol, intenzivnu fizičku aktivnost, uzimanje lijekova (po dogovoru sa ljekarom).

4. 1-2 sata prije davanja krvi uzdržite se od pušenja, nemojte piti sokove, čaj, kafu, možete piti negaziranu vodu. Uklonite fizički stres (trčanje, brzo penjanje stepenicama), emocionalno uzbuđenje. Preporučuje se da se odmorite i smirite 15 minuta prije davanja krvi.

5. Krv za laboratorijska ispitivanja ne treba davati odmah nakon fizioterapijskih procedura, instrumentalnih pregleda, rendgenskih i ultrazvučnih pregleda, masaže i drugih medicinskih zahvata.

6. Prilikom praćenja laboratorijskih parametara u dinamici, preporučuje se ponavljanje istraživanja pod istim uslovima - u istoj laboratoriji, davanje krvi u isto doba dana itd.

7. Krv za istraživanje treba dati prije početka uzimanja lijekova ili ne prije 10-14 dana nakon prestanka uzimanja lijekova. Za procjenu kontrole učinkovitosti liječenja bilo kojim lijekovima, potrebno je provesti studiju 7-14 dana nakon posljednje doze lijeka.

Ako uzimate lijekove, obavezno o tome obavijestite svog ljekara.

OPĆE FARMAKOPSKO OVLAŠĆENJE

Uveden po prvi put

Ova farmakopejska monografija se odnosi na metode za određivanje aktivnosti faktora I, II, VII, VIII, IX, X, XI, von Willebrand faktora, antitrombina III u plazmi i krvnim proizvodima.

OPĆE ODREDBE

Određivanje aktivnosti faktora koagulacije zasniva se na 2 pristupa:

1. Metoda u jednom koraku. Obnavljanje procesa koagulacije krvi u plazmi sa nedostatkom faktora nakon dodavanja preparata ovog faktora (metoda zgrušavanja).
2. dvostepena metoda. U prvom koraku, korištenjem specifičnog kofaktora, proteolitička aktivnost faktora II ili faktora X se aktivira kako bi se formirao, respektivno, aktivirani faktor IIa ili Xa. U drugoj fazi, količina formiranog aktiviranog faktora određuje se reakcijom njegovog cijepanja specifičnog kromogenog peptida (hromogena metoda).

Hromogenu metodu moguće je provesti na 2 načina: kinetikom stvaranja hromogena pod djelovanjem aktiviranog faktora ili krajnjom točkom akumulacije hromogena za određeno vrijeme inkubacije.

Za provođenje obje metode moguće je koristiti plastične epruvete, ploče, optičko-mehaničke, mehaničke poluautomatske i potpuno automatizirane koagulometre.

U svim metodama, aktivnost se izračunava upoređivanjem aktivnosti test uzorka sa aktivnošću međunarodnog standarda NIBSC ili standarda sekundarnog faktora zgrušavanja kalibriranog prema međunarodnom standardu u međunarodnim jedinicama aktivnosti (IU). SZO je utvrdila ekvivalentnost međunarodnog standarda u IU. Za 1 IU (100%) uzeti aktivnost faktora koagulacije u 1,0 ml svježe normalne skupljene krvne plazme od 300 davalaca. Aktivnost se može izraziti u IU/ml, IU/bočici, IU/mg proteina i kao procenat količine koju je naveo proizvođač.

FAKTORI

FaktorI (fibrinogen)

Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti fibrinogena vrši se Claussovom metodom.

Princip metode

Kada se trombin doda uzorku koji sadrži fibrinogen, uočava se stvaranje fibrinskog ugruška. Kada se koristi trombin visoke aktivnosti (~10 IU/ml) i uzorci sa niskom koncentracijom fibrinogena (ispod 100 mg/dcl), može se dobiti linearna veza.

Za određivanje fibrinogena koriste se komercijalni test sistemi koji uključuju trombinski reagens koji sadrži inhibitor heparina i pufer za razrjeđivanje uzorka ili komercijalni reagens za trombin.

Koncentracija fibrinogena se izražava u mg/dcl. Za izradu kalibracionog grafikona koristi se standardni uzorak fibrinogena ili plazma kalibrator certificiran prema međunarodnom standardu. Standardni uzorak ili uzorak plazma-kalibratora se rastvori u destilovanoj vodi prema uputstvu. Pripremite 5 serijskih razrjeđenja standardnog uzorka, počevši od koncentracije od ~100 mg/dcl, koristeći pufer za razrjeđivanje uzorka pH = 7,3 ± 0,1. Analiza se provodi na temperaturi od 37°C prema uputama za komplet. Za svako razrjeđivanje, vrijeme formiranja ugruška se određuje tri puta. Na osnovu rezultata dobijenih u logaritamskim koordinatama, gradi se kalibracioni grafikon zavisnosti vremena formiranja ugruška od koncentracije fibrinogena.

Pripremite 2 razblaženja testnog uzorka ispod 100 mg/dl. Za svako razrjeđivanje, vrijeme formiranja ugruška je određeno tri puta. Količina fibrinogena u svakom razrjeđivanju određena je kalibracijskim grafikonom.

FaktorII(trombin)

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora II vrši se korišćenjem humane plazme sa nedostatkom faktora II kao supstrata. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u mješavinu kalcijuma.

Za razblaživanje standarda i preparata koristite NaCl-imidazol pufer pH 7,3 ± 0,1 sa dodatkom 0,1% goveđeg ili humanog albumina. Da bi se konstruisao kalibracioni grafikon, priprema se serija serijskih razblaženja standarda faktora II u opsegu aktivnosti od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrijedi do koncentracije manje od 1 IU / ml. Analizirajte 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak mjerenje vremena zgrušavanja se vrši najmanje 2 puta. Mjerenje se vrši u roku od 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se vrši na temperaturi od (37±0,5)°C. Dodajte 50 µl plazme sa nedostatkom faktora II i 50 µl standarda ili razrjeđenja preparata u plastičnu epruvetu. Smjesa je inkubirana na (37 ± 0,5)°C 120-240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja u smjesu 200 μl kalcijum tromboplastina prethodno zagrijanog na temperaturu (37±0,5)°C. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa mogu varirati u odgovarajućoj proporciji.

Grafikon kalibracije je izgrađen u polulogaritamskim koordinatama. Na osi logaritamske apscise ucrtane su vrijednosti aktivnosti faktora II, a na ordinatnoj osi je prikazano vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora II za svako razblaživanje testnog uzorka nalazi se iz kalibracione krive. FII aktivnost ( ALI

k

1. Hromogena metoda

Metoda se zasniva na poređenju enzimske aktivnosti faktora IIa, nastalog nakon specifične aktivacije faktora II, u odnosu na specifični hromogeni peptidni supstrat sa istom aktivnošću standardnog uzorka (međunarodnog ili sličnog).

Faktor II aktivira ekarin aktivator izolovan iz otrova zmije. Aktivirani faktor II (trombin) selektivno cijepa hromogeni supstrat (H-D-fenilalanin-L-pipekolil-L-arginin-4-nitroanilid dihidrohlorid, 4-toluensulfonilglicil-prolil-L-arginin-4-nitroanilid-ciklo-buksil-a- - L-arginin-4-nitroanilid, D-cikloheksilglicil-L-alanil-L-arginin-4-nitroanilid diacetat) P-nitroanilin. Kinetika reakcije je fotometrijski ispitana na 405 nm. Vrijednost optičke gustine je proporcionalna aktivnosti faktora II.

Određivanje faktora II hromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test kitova. Analiza se vrši u skladu s uputama za komplet. Standardni uzorak i preparat su prethodno razrijeđeni plazmom sa nedostatkom faktora II do koncentracije od ~ 1 IU / ml (osnovno razrjeđenje). Iz glavnog razblaženja pripremaju se 3 razblaženja standardnog uzorka i 3 razblaženja preparata puferskim rastvorom tris-fiziološkog rastvora pH 8,4. Svako razrjeđivanje standardnog uzorka se određuje dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izgradnju kalibracionog grafikona. Ispitni uzorci se određuju tri puta.

Ispitivanja se izvode u ručnom režimu pomoću mikroploče i spektrofotometra koji održava temperaturu u rasponu od (37 ± 0,5)°C ili u automatskom režimu pomoću koagulometra.

Za ručno testiranje, 25 µl svakog razblaženja test preparata ili standardnog uzorka se dodaje u jažice mikroploče. 125 µl pufera za razrjeđivanje, 25 µl ekarina se dodaju u svaku jažicu i inkubiraju na (37±0,5)°C 2 minute. Na kraju vremena inkubacije, u svaku jažicu se dodaje 25 µl hromogenog supstrata faktora IIa.

ALI/min).

Ako kontinuirano mjerenje apsorpcije nije moguće, odredite apsorbanciju na 405 nm u uzastopnim vremenskim intervalima (npr. 40 s) i nacrtajte zavisnost apsorbancije od vremena i izračunajte ∆ ALIALI

1. Test na odsustvo trombina

Za ispitivanje se priprema rastvor preparata restauriran u skladu sa uputstvima. Ako u preparatu ima heparina, neutrališe se dodavanjem protamin sulfata u količini od 10 μg protamin sulfata na 1 IU heparina.

Priprema rastvora fibrinogena

0,3 g fibrinogena se rastvori u 100 ml, pomeša i inkubira 15-20 minuta na sobnoj temperaturi.

Rok trajanja rastvora je 1 mesec na temperaturi od 2 do 8°C.

Priprema rastvora trombina

Liofilizat se rastvori u skladu sa uputstvima proizvođača, drži 15-20 minuta na sobnoj temperaturi i razblaži sa 0,9% rastvorom natrijum hlorida do sadržaja trombina od 1 IU/ml.

Rok trajanja rastvora je 6 meseci na temperaturi od minus 20°C. Otopina nakon odmrzavanja ne podliježe ponovnom zamrzavanju.

Napredak definicije

U 2 epruvete dodaju se jednake količine rekonstituisanog lijeka i otopine fibrinogena. U treću epruvetu (kontrolni uzorak) dodaju se jednake količine rastvora trombina i rastvora fibrinogena, sadržaj epruveta se meša rotacionim pokretima. Jedna epruveta sa rekonstituisanim lekom se inkubira u vodenom kupatilu na 37°C 6 sati, druga epruveta sa rekonstituisanim lekom je na sobnoj temperaturi 24 sata. Uočava se prisustvo ili odsustvo koagulacije (ugruška).

Kontrolni uzorak se inkubira u vodenom kupatilu na 37°C i zabilježi vrijeme stvaranja ugruška.

Kriterijum za prihvatljivost rezultata je koagulacija u kontrolnom uzorku nakon 30 s.

FaktorVII

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora VII vrši se korišćenjem humane plazme sa nedostatkom faktora VII. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u mješavinu kalcijuma.

Za razblaživanje standarda i preparata koristi se NaCl-imidazol pufer pH 7,3 uz dodatak 0,1% rastvora humanog ili goveđeg albumina. Da bi se konstruisala kalibraciona kriva, priprema se serija serijskih razblaženja standarda uzorka faktora VII u opsegu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrijedi do koncentracije manje od 1 IU / ml. Analizirajte 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak mjerenje vremena zgrušavanja se vrši najmanje 2 puta. Mjerenje se vrši odmah nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se vrši na temperaturi od (37±0,5)°C. 50 µl plazme sa nedostatkom faktora VII i 50 µl razblaženja standarda ili lijeka se dodaje u plastičnu epruvetu. Smeša je inkubirana na (37±0,5)°C 120-240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja u smjesu 200 μl kalcijum tromboplastina prethodno zagrijanog na temperaturu (37±0,5)°C. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa mogu varirati u odgovarajućoj proporciji.

Grafikon kalibracije je izgrađen u polulogaritamskim koordinatama. Na osi logaritamske apscise, vrijednosti aktivnosti faktora VII su ucrtane, duž ordinatne ose, vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora VII za svako razblaživanje testnog uzorka nalazi se iz kalibracione krive. FVII aktivnost ( ALI) u ispitnom uzorku izračunava se po formuli:

- aktivnost odgovarajućeg razblaženja ispitnog uzorka, utvrđena iz kalibracionog grafikona;

k- razblaživanje ispitnog uzorka.

1. Hromogena metoda

U prisustvu tkivnog faktora (TF) i jona Ca 2+ aktivira se faktor VII (formiranje FVIIa). Kompleks FVIIa, TF, Ca 2+ i fosfolipida aktivira faktor X. Aktivirani faktor X (FXa) selektivno cijepa hromogeni supstrat FXa-1 metoksikarbonil-D-cikloheksilalanil-glicil-L-arginin- n-nitroanilid acetat se formira P-nitroanilin. Ispitivanje uzorka je izvedeno fotometrijskom metodom na 405 nm. Vrijednost apsorpcije (ili povećanje apsorpcije) je proporcionalna količini faktora VII.

Određivanje faktora VII hromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test kitova. Analiza se vrši u skladu s uputama za komplet. Standardni uzorak i preparat su prethodno razrijeđeni plazmom sa nedostatkom faktora VII do koncentracije od ~ 1 IU / ml (osnovno razrjeđenje). Od glavnog razblaženja pripremaju se 3 razblaženja standardnog uzorka i 3 razblaženja preparata tris-fiziološkim puferom pH 7,3 - 8,0 korišćenjem puferskog rastvora sa dodatkom 0,1% humanog ili goveđeg albumina. Svako razrjeđivanje standardnog uzorka se određuje dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izgradnju kalibracionog grafikona. Ispitni uzorci se određuju tri puta.

U jažice mikroploče se dodaju razblaženja preparata za ispitivanje ili standardnog uzorka, dodaju se mešavina kalcijum-tromboplastina, rastvor faktora X i inkubiraju na temperaturi od (37 ± 0,5) °C 2 do 5 minuta, nakon čega se faktor Doda se otopina Xa kromogenog supstrata.

Izmjerite promjenu optičke gustoće na talasnoj dužini od 405 nm, bilo u kinetičkom režimu, ili prekinete reakciju hidrolize nakon 3-15 minuta dodavanjem 20% (v/v) rastvora glacijalne sirćetne kiseline i izmjerite optičku gustoću.

FaktorVIII

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora VIII vrši se korišćenjem ljudske plazme sa nedostatkom faktora VIII. Izvor fosfolipida neophodnih za koagulaciju je APTT reagens.

Za razblaživanje standarda i preparata koristi se NaCl-imidazol pufer rastvor pH (7,3 ± 0,1) uz dodatak 0,1% rastvora humanog ili goveđeg albumina. Da bi se napravio kalibracioni grafikon, priprema se serija serijskih razblaženja standarda, počevši od koncentracije od 2 IU/ml. Lijek se razrijedi do koncentracije od ~ 0,5 - 2 IU / ml. Analizirajte 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak mjerenje vremena zgrušavanja se vrši najmanje 2 puta. Mjerenje se vrši u roku od 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se vrši na temperaturi od (37±0,5)°C. 100 µl plazme sa nedostatkom faktora VIII, 100 µl razblaženja standarda ili lijeka i 100 µl APTT reagensa se dodaju u plastičnu epruvetu i inkubiraju na temperaturi od (37±0,5)°C 2 minute. Vrijeme zgrušavanja je fiksirano od trenutka dodavanja u smjesu 100 µl 0,025 M rastvora kalcijum hlorida zagrejanog na temperaturu od (37 ± 0,5)°C. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa mogu varirati u odgovarajućoj proporciji.

Grafikon kalibracije je izgrađen u polulogaritamskim koordinatama. Vrijednosti aktivnosti faktora VIII su iscrtane duž logaritamske apscisne ose, a vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda je naneseno duž ose ordinata. Aktivnost faktora VIII za svako razblaživanje testnog uzorka nalazi se iz kalibracione krive. FVIII aktivnost ( ALI) u ispitnom uzorku izračunava se po formuli:

- aktivnost odgovarajućeg razblaženja ispitivanog leka, pronađena iz kalibracionog grafikona;

k- razblaživanje ispitnog uzorka.

1. Hromogena metoda

Kvantitativno određivanje faktora VIII se provodi korištenjem seta reagenasa, u kojima je faktor VIII kofaktor za faktor IXa kada se faktor X aktivira da formira Xa, koji cijepa hromogeni supstrat.

Princip metode

U prisustvu Ca 2+ jona i fosfolipida, faktor X se aktivira u Xa faktorom IXa. Sa viškom faktora X i optimalnim količinama Ca 2+, fosfolipida i faktora IXa, stopa aktivacije faktora X linearno zavisi od količine faktora VIII. Faktor Xa hidrolizira hromogeni supstrat S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) kako bi se oslobodila hromogena grupa pNA, čija se boja spektrofotometrijski snima na 405 nm. Količina formiranog faktora Xa, a samim tim i intenzitet bojenja, proporcionalni su aktivnosti faktora VIII u uzorku.

Komplet reagensa za aktivnost faktora VIII je stabilan u periodu koji je odredio proizvođač na temperaturi skladištenja od 2 do 8 °C.

Komplet reagensa sadrži:

1. 7,7 mg hromogena S-2765 dopunjenog sintetičkim inhibitorom trombina I-2581. Reagens se rekonstituiše u 6,0 ml sterilne vode za injekcije. Rekonstituisani rastvor je stabilan 1 mesec na temperaturi od 2 do 8°C. Prije upotrebe zagrijati na temperaturu od 37°C.
2. Reagens goveđih faktora: 0,3 U faktor IX, 2,7 IU faktor X i 1 NIH U trombin liofiliziran u prisustvu 40 mmol CaCl 2 i 0,2 mmol fosfolipida. Reagens se rekonstituiše u 2,0 ml sterilne vode za injekcije. Rekonstituisani rastvor je stabilan 12 sati na temperaturi od 2 do 8°C, 2 nedelje na minus 30°C i 1 mesec na minus 80°C. Ne čuvati na minus 20°C. Pre upotrebe zagrejati na 37°C.
3. Koncentrirajte ×10 Tris pufer. Stabilan 1 mjesec na 2 do 8°C. Prije upotrebe razrijediti sterilnom vodom za injekcije u omjeru 1:10.

Dodatni reagensi:

1. Međunarodni standard - rastvor koncentrata humanog faktora zgrušavanja VIII (NIBSC, Eur.Pharm.Ref.Std. BRP H 0920000) ili plazma kalibrisana prema međunarodnom standardu faktora VIII.
2. Kontrolna normalna ili patološka plazma kalibrirana prema međunarodnom standardu faktora VIII.
3. 0,9% rastvor natrijum hlorida.
4. 20% sirćetne kiseline ili 2% limunske kiseline (koristi se u Chromogen Storage Endpoint metodi).
5. Laboratorijska voda deionizirana

Oprema:

1. Plastične epruvete;
2. mikroploče;
3. Termostat 37 o C;
4. Spektrofotometar 405 nm ili čitač mikroploče 405 nm;
5. Kalibrirane pipete;
6. Vortex;
7. Štoperica.

Test uzorak se razblaži do očekivane aktivnosti od 1 IU/ml pre određivanja.

Određivanje se može izvršiti u kinetičkom režimu i na krajnjoj tački, u epruvetama (makrometoda) i mikropločama (mikrometoda).

Kalibracija

Tokom svakog određivanja, konstruiše se kalibraciona kriva. Razblaživanje standardnog uzorka priprema se u 2 faze: preliminarno razblaživanje do aktivnosti od 1–2 IU/ml i finalno razblaživanje radi izgradnje kalibracione zavisnosti u opsegu od 0–2 IU/ml. Nakon razblaživanja, određivanje treba izvršiti u roku od 30 minuta.

Napredak definicije

Određivanje u epruvetama

200 µl razrijeđenog standardnog, kontrolnog ili ispitnog uzorka se dodaje u epruvete, inkubira 3-4 minute na temperaturi od 37 °C, dodaje se 50 µl prethodno zagrijanog faktora reagensa, inkubira 2-4 minute na temperatura od 37°C i 50 µl se dodaje rastvor hromogena.

Određivanje u mikropločama

50 µl razrijeđenog standardnog, kontrolnog ili testnog uzorka se doda u jažice mikroploče, inkubira 3-4 minute na 37°C, doda se 50 µl prethodno zagrijanog faktorskog reagensa, inkubira 2-4 minute na temperatura od 37 °C i 50 µl otopine hromogena.

Kinetička metoda određivanja

Nakon dodavanja rastvora hromogena tokom 2-10 minuta, promena optičke gustine rastvora se meri na 405 nm.

Definicija po krajnjoj tački

Nakon dodavanja otopine hromogena, smjesa se nastavlja inkubirati na temperaturi od 37 °C 2-10 minuta, nakon čega se dodaje 50 μl 20% sirćetne ili 2% limunske kiseline da se reakcija zaustavi. Izmjerite optičku gustinu otopine u odnosu na pufer na 405 nm.

Kalkulacije

Nacrtajte promenu optičke gustine po minuti (za kinetičku metodu) ili optičke gustine (za određivanje krajnje tačke) razblaženja standardnog rastvora na koncentraciju faktora VIII u njima. Aktivnost u uzorku za ispitivanje određuje se iz kalibracione krive, uzimajući u obzir prethodno razblaživanje uzorka.

FaktorIX

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora IX vrši se korišćenjem ljudske plazme sa manjkom faktora IX. Izvor fosfolipida neophodnih za koagulaciju je APTT reagens.

Za razblaživanje standarda i preparata koristi se NaCl-imidazol pufer pH 7,3 uz dodatak 0,1% rastvora goveđeg ili humanog albumina. Da bi se konstruisao kalibracioni grafikon, priprema se serija serijskih razblaženja standarda u opsegu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrijedi do koncentracije manje od 1 IU / ml. Analizirajte 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak mjerenje vremena zgrušavanja se vrši najmanje 2 puta. Mjerenje se vrši u roku od 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se vrši na temperaturi od (37±0,5)°C. 100 µl plazme sa nedostatkom faktora IX, 100 µl standarda ili razblaženja lijeka i 100 µl APTT reagensa se dodaju u plastičnu epruvetu i inkubiraju na (37 ± 0,5)°C 2 minute. Vrijeme zgrušavanja je fiksirano od trenutka dodavanja 100 µl 0,025 M rastvora kalcijum hlorida prethodno zagrejanog na temperaturu od (37 ± 0,5) °C u smešu. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa mogu varirati u odgovarajućoj proporciji.

Grafikon kalibracije je izgrađen u polulogaritamskim koordinatama. Na osi logaritamske apscise ucrtane su vrijednosti aktivnosti faktora IX, a na ordinatnoj osi vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora IX za svako razblaživanje testnog uzorka nalazi se iz kalibracione krive. FIX aktivnost ( ALI) u ispitnom uzorku izračunava se po formuli:

- aktivnost odgovarajućeg razblaženja ispitnog uzorka, utvrđena iz kalibracionog grafikona;

k- razblaživanje ispitnog uzorka.

FaktorX

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora X vrši se korišćenjem humane plazme sa deficitom faktora X. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u mešavinu kalcijuma.

Za razblaživanje standarda i preparata koristiti NaCl-imidazol pufer rastvor pH 7,3 uz dodatak 0,1% rastvora humanog ili goveđeg albumina. Da biste napravili kalibracioni grafikon, pripremite seriju serijskih razblaženja standarda faktora X u opsegu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrijedi do koncentracije manje od 1 IU / ml. Analizirajte 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak mjerenje vremena zgrušavanja se vrši najmanje 2 puta. Mjerenje se vrši odmah nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se vrši na temperaturi od (37±0,5)°C. Dodajte 50 µl plazme sa nedostatkom faktora X i 50 µl standarda ili razrjeđenja preparata u plastičnu epruvetu. Smjesa je inkubirana na (37±0,5)°C 120-240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja u smjesu 200 μl kalcijum tromboplastina prethodno zagrijanog na temperaturu (37±0,5)°C. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa mogu varirati u odgovarajućoj proporciji.

Grafikon kalibracije je izgrađen u polulogaritamskim koordinatama. Na logaritamskoj apscisnoj osi su prikazane vrijednosti aktivnosti faktora X , duž y-ose, vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora X za svako razrjeđenje testnog uzorka nalazi se iz kalibracijske krive. Aktivnost faktora X ( ALI) u ispitnom uzorku izračunava se po formuli:

- aktivnost odgovarajućeg razblaženja ispitnog uzorka, utvrđena iz kalibracionog grafikona;

k- razblaživanje ispitnog uzorka.

1. Hromogena metoda

Faktor X se aktivira FX aktivatorom koji potiče od zmijskog otrova. Aktivirani faktor X (FXa) selektivno cijepa hromogeni supstrat FXa-1 N-α-benziloksikarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginin-4-nitroanilid dihidroklorid, N-benzoil-L-izoleucil-L-glutamil-glutamil - L-arginin-4-nitroanilid hidrohlorid, metansulfonil-D-leucil-glicil-L-arginin-4-nitroanilid, metoksikarbonil-D-cikloheksilalanil-glicil-L-arginin-4-nitroanilid acetat koji se formira P-nitroanilin. Uzorci se fotometrijski ispituju na 405 nm. Količina faktora X je proporcionalna povećanju optičke gustine rastvora.

Određivanje faktora X hromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test kitova. Analiza se vrši u skladu s uputama za komplet. Standardni uzorak i preparat su prethodno razrijeđeni plazmom s nedostatkom faktora X do koncentracije od ~ 1 IU/ml (osnovno razrjeđenje). Od glavnog razrjeđenja pripremaju se 3 razrjeđenja standardnog uzorka (prema uputama) i 3 razrjeđenja lijeka pomoću puferske otopine. Svako razrjeđivanje standardnog uzorka se određuje dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izgradnju kalibracionog grafikona. Ispitni uzorci se određuju tri puta.

Testovi se izvode ručno pomoću plastičnih epruveta ili mikropločica na temperaturi od (37±0,5)°C ili automatski pomoću koagulometra.

Za ručno testiranje, 12,5 µl svakog razblaženja preparata za ispitivanje ili standardnog uzorka se dodaje u jažice mikroploče, 25 µl specifičnog faktora X aktivatora iz otrova Russellovog poskoka se dodaje u svaku jažicu i inkubira na temperaturi od ( 37 ± 0,5) °C tokom 90 s, nakon čega se u svaku jažicu dodaje 150 µl radnog razblaženja faktora X hromogenog supstrata.

Odredite brzinu promjene apsorbancije na talasnoj dužini od 405 nm neprekidno 3 min i izračunajte prosječnu brzinu promjene apsorbancije (∆ ALI/min) ili izmjerite apsorpciju na talasnoj dužini od 405 nm u uzastopnim vremenskim intervalima (na primjer, nakon 30 s) i nacrtajte apsorbanciju u odnosu na vrijeme i izračunajte ∆ ALI/min kao ugao nagiba prave linije. Od vrijednosti ∆ ALI/min svakog pojedinačnog razblaženja standardnog uzorka i ispitivanog leka, izračunava se aktivnost ispitivanog leka.

Willebrand faktor

Određivanje aktivnosti von Willebrandovog faktora provodi se metodom aglutinacije ili enzimskim imunotestom.

Aktivnost von Willebrandovog faktora utvrđuje se poređenjem njegove aktivnosti sa aktivnošću standardnog uzorka.

Metoda aglutinacije

Metoda se zasniva na određivanju koenzimske aktivnosti von Willebrandovog faktora tokom aglutinacije suspenzije trombocita u prisustvu ristocetina A.

Test se može izvesti kvantitativno korišćenjem automatizovane opreme ili polukvantitativno vizuelnom procenom aglutinacije u nizu razblaženja.

Semi-kvantitativna metoda

Od standardnog uzorka i rekonstituisanog rastvora leka pripremaju se serijska razblaženja u 0,9% rastvoru natrijum hlorida sa 1-5% rastvorom humanog albumina do očekivanog sadržaja von Willebrandovog faktora 0,5, 1,0 i 2,0 IU/ml. 0,05 ml svakog razblaženja standardnog uzorka i test preparata se nanese na staklo, doda se 0,1 ml suspenzije trombocita sa ristocetinom i meša 1 min. Otopina za razrjeđivanje se koristi kao negativna kontrola. Nakon 1 minute inkubacije na sobnoj temperaturi vizualno se procjenjuje aglutinacija trombocita. Maksimalno razrjeđenje pri kojem dolazi do aglutinacije trombocita je titar aktivnosti koenzima ristocetina u uzorku.

kvantitativna metoda

Pripremite najmanje 2 serije serijskih razblaženja referentnih i ispitnih uzoraka sa puferom za razblaživanje do očekivanih nivoa von Willebrand faktora od 0,5, 1,0 i 2,0 IU/mL.

Određivanje se vrši u skladu s uputama proizvođača automatizirane opreme. Dobijte vrijednosti ovisnosti promjene optičke apsorpcije (stepena zamućenosti otopine) od aktivnosti von Willebrandovog faktora.

Određivanje sadržaja von Willebrandovog faktora u preparatu za ispitivanje vrši se korišćenjem koeficijenata linearne jednačine zavisnosti optičke gustine rastvora od sadržaja von Willebrandovog faktora u standardnom uzorku.

ELISA metoda

Metoda se zasniva na određivanju aktivnosti vezivanja kolagena von Willebrandovog faktora. Nakon specifičnog vezivanja von Willebrand faktora za kolagene fibrile i naknadnog vezivanja poliklonskih antitijela konjugiranih enzima za von Willebrand faktor, nakon dodavanja hromogenog supstrata formira se hromofor, koji se može kvantificirati spektrofotometrijskom metodom. Postoji linearna veza između vezivanja kolagena za von Willebrand faktor i optičke gustoće.

Određivanje se vrši pomoću test sistema odobrenih za upotrebu u zdravstvenoj praksi u Rusiji u skladu sa uputstvima za upotrebu.

Za testiranje, pripremite najmanje 3 uzastopne serije razblaženja standardnih i ispitnih uzoraka koristeći pufer za razblaživanje do očekivanog sadržaja von Willebrandovog faktora od 1,0 IU/ml. Zatim se provode ispitivanja u skladu s uputama proizvođača za korišteni sistem ispitivanja.

Aktivirani faktori zgrušavanja krv

Određivanje se vrši koagulometrijskom metodom.

Za ispitivanje se priprema rekonstituisani rastvor leka. Ako u preparatu ima heparina, neutrališe se dodavanjem protamin sulfata u količini od 10 μg protamin sulfata na 1 IU heparina. Pripremite razrjeđenja lijeka 1:10 i 1:100 koristeći Tris pufer otopinu pH 7,5.

0,1 ml standardne ljudske plazme i 0,1 ml rastvora fosfolipida doda se u 3 epruvete, stavljene u vodeno kupatilo na temperaturi (37 ± 0,5) °C tokom 60 s, nakon čega se u prvu epruvetu doda 0,1 ml. Tris puferski rastvor (kontrolni uzorak), u drugom - 0,1 ml ispitivanog leka razblaženog 1:10, u trećoj epruveti - 0,1 ml ispitivanog leka razblaženog 1:100. Nadalje, sadržaju svake epruvete odmah se dodaje 0,1 ml otopine kalcijum hlorida od 3,7 g/l zagrijane na temperaturu od 37 °C. Zabeleženo je vreme nastanka ugruška od trenutka dodavanja rastvora kalcijum hlorida.

Kriterijum za prihvatljivost rezultata je vrijeme koagulacije u kontrolnom uzorku u rasponu od 200 do 350 s.

Specifična specifična aktivnost

Specifična aktivnost faktora koagulacije izračunava se po formuli:

Određivanje antitrombinske aktivnostiIII

Hromogena metoda

Metoda za određivanje aktivnosti ATIII zasniva se na njegovoj sposobnosti da neutrališe trombin u prisustvu heparina. Višak heparina i trombina se dodaje uzorku koji sadrži ATIII. Nastali kompleks ATIII-heparin neutralizira količinu trombina proporcionalnu količini ATIII. Preostali trombin selektivno cijepa kromogeni supstrat da bi se formirao P-nitroanilin, čija je apsorpcija određena na 405 nm. Dakle, količina ATIII je obrnuto proporcionalna apsorpciji slobodnog P-nitroanilin u uzorku.

Određivanje aktivnosti ATIII se vrši korišćenjem komercijalnih test sistema. Da biste napravili kalibracioni grafikon, koristite standardni ATIII uzorak ili kalibrator plazme certificiran prema međunarodnom standardu. Standardni uzorak ili plazma kalibrator se otopi u destilovanoj vodi prema uputama u uputama. Zavisnost optičke gustine od aktivnosti ATIII je linearna u opsegu aktivnosti ATIII od 0,1 do 1,0 IU/ml. Koristeći heparinski pufer, pripremite 4 razblaženja standardne ili kalibracione plazme sa aktivnošću ATIII od 0,1 do 1,0 IU/mL. Analiza se provodi na temperaturi od 37°C prema shemi datoj u uputama za komplet. Za svako razblaživanje, optička gustina na 405 nm se određuje tri puta i kalibracioni dijagram apsorpcije naspram ATIII aktivnosti je ucrtan u linearnim koordinatama.

Pripremite 2 razblaženja testnog uzorka sa procijenjenom aktivnošću ATIII manjom od 1,0 IU/ml. Određivanje aktivnosti ATIII u ispitivanim uzorcima vrši se na temperaturi od 37°C prema uputama u uputama za komplet. Aktivnost ATIII u testiranim razblaženjima nalazi se iz kalibracione krive. Aktivnost ATIII u test uzorku je definisana kao:

Sjekira– ATIII aktivnost u odgovarajućem razblaženju;

k- razblaživanje uzorka.

Kvantifikacija heparina

1. Metoda zgrušavanja

Metoda se zasniva na sposobnosti heparina da produži vrijeme zgrušavanja normalne plazme zbog inhibicije brojnih faktora.

Za analizu se koristi normalna ljudska plazma, standardni uzorak heparina, APTT reagens i rastvor kalcijum hlorida 0,025 M. 0,9% rastvor natrijum hlorida se koristi kao razblaživač za standardne i ispitne uzorke. Standardni uzorak heparina se rastvori u destilovanoj vodi prema uputstvu u uputstvu. Pripremite 3 razblaženja standardnog uzorka sa aktivnošću heparina od 0,3, 0,4 i 0,5 IU/ml. Standardni uzorci sa ovim aktivnostima trebali bi produžiti vrijeme zgrušavanja normalne plazme za najmanje 1,5 puta, u suprotnom treba koristiti razrjeđenja s većom aktivnošću heparina. Paralelno, pripremaju se 3 razblaženja testnog uzorka tako da približno aktivnost heparina u ovim razblaženjima spada u opseg aktivnosti heparina u razblaženjima standardnog uzorka.

Analiza se vrši pomoću automatskog ili poluautomatskog koagulometra u plastičnim epruvetama na temperaturi od 37°C. U epruvetu se doda 100 µl normalne ljudske plazme, 100 µl razblaženja standardnog ili test uzorka ili 100 µl 0,9% rastvora natrijum hlorida (prazni eksperiment), doda se 100 µl APTT reagensa i smeša se inkubirano 120–240 s na temperaturi (37±0,1)°S. Zatim se u epruvetu dodaje 100 μl 0,025 M rastvora kalcijum hlorida zagrejanog na temperaturu od 37°C i beleži vreme zgrušavanja uzorka. U zavisnosti od tehnike postavljanja analize, zapremine reagensa se mogu proporcionalno menjati. Vrijeme zgrušavanja normalne plazme (prazne) treba biti 25-40 s. Za svako razrjeđivanje standardnih i ispitnih uzoraka vrijeme zgrušavanja se određuje tri puta.

1. Hromogena metoda

Metoda se zasniva na cijepanju hromogenog supstrata specifičnog za aktivirani faktor X (FXa). Kada se prevelike količine ATIII i FXa unesu u uzorak koji sadrži heparin, količina FXa proporcionalna količini heparina se inhibira. Preostali FXa se cijepa od specifičnog kromogenog supstrata P-nitroanilin, čija je apsorpcija određena na 405 nm. Dakle, količina apsorpcije je obrnuto proporcionalna količini heparina. Ovom metodom se utvrđuje sadržaj nefrakcionisanog heparina i heparina male molekulske mase u anti-Xa jedinicama.

Količina heparina se određuje hromogenom metodom korišćenjem komercijalnih test sistema. Za izradu kalibracionog grafikona koristi se standardni uzorak heparina ili kalibrator plazme certificiran prema međunarodnom standardu. Standardni uzorak ili plazma kalibrator se razrijedi u destilovanoj vodi prema uputama. Pripremite 4 razrjeđenja standarda s koncentracijom heparina manjom od 1 anti-Xa U/mL koristeći pufer za razrjeđivanje pH 8,4. Analiza se vrši na temperaturi od 37°C u skladu sa uputstvima za komplet. Za svako razrjeđivanje, apsorbancija na 405 nm se određuje tri puta, nakon čega se u linearnim koordinatama ucrtava kalibracijski grafikon ovisnosti apsorbancije o koncentraciji heparina. Ovisnost je linearna u rasponu koncentracija heparina 0 – 1,0 anti-Xa jedinica/ml.

Pripremite 2 razblaženja za test uzorak sa koncentracijom heparina manjom od 1 anti-Xa U/mL. Analiza se vrši prema uputama za set na temperaturi od 37°C. Za svako razrjeđivanje, vrijednost apsorbancije se određuje tri puta.

Određivanje se vrši ručno pomoću plastičnih epruveta, mikropločica ili automatski pomoću koagulometra.

Za testiranje u ručnom režimu, 20 µl standardne ljudske plazme i 20 µl rastvora antitrombina III se dodaje u jažice mikroploče. Zatim se u ove jažice doda 20, 60, 100 i 140 μl testa, odnosno standardnog preparata, a zapremina rastvora u svakoj jažici se puferom podešava na 200 μl (aktivnost heparina u konačnoj reakcionoj smeši je 0,02 - 0,08 IU / ml).

40 µl iz svake jažice ploče se prenosi u drugu seriju jažica, u koje se dodaje 20 µl otopine goveđeg faktora Xa i inkubira na temperaturi od (37 ± 0,5) °C 30 s, nakon čega se 40 µl rastvora se dodaju u hromogeni supstrat faktora Xa i ponovo inkubiraju na (37 ± 0,5)°C 3-15 minuta, mereći brzinu degradacije supstrata kontinuiranim merenjem optičke gustine na talasnoj dužini od 405 nm (kinetički režim) ili nakon zaustavljanja reakcije dodavanjem 20% (v/v) rastvora glacijalne sirćetne kiseline (konačna tačka određivanja).

Prilikom provođenja studija u automatskom načinu rada pomoću koagulometra, dobivaju se vrijednosti ovisnosti promjene optičke gustoće o koncentraciji heparina.

Nivo faktora koagulacije VIII od 0 do 1% izaziva izuzetno težak oblik bolesti, od 1 do 2% - teški, od 2 do 5% - umeren, iznad 5% - blagu formu, ali sa rizikom od teškog. pa čak i smrtonosno krvarenje tokom povreda i hirurških intervencija.

Od svih mogućih manifestacija hemofilije, krvarenja u velikim zglobovima ekstremiteta (kuk, koljeno, skočni zglob, rame i lakat), duboka potkožna, intermuskularna i intramuskularna krvarenja, obilna i produžena krvarenja kod povreda, pojava krvi u mokraći . Ostala krvarenja su nešto rjeđa, uključujući tako teška i opasna kao što su retroperitonealna krvarenja, krvarenja u trbušnim organima, gastrointestinalna krvarenja, intrakranijalna krvarenja (moždani udar).

Kod hemofilije se sasvim jasno može pratiti napredovanje svih manifestacija bolesti kako dijete raste, a kasnije i kao odrasla osoba. Pri rođenju se mogu uočiti manje ili više opsežna krvarenja ispod periosta kostiju lubanje, potkožna i intradermalna krvarenja, kasno krvarenje iz pupčane vrpce. Ponekad se bolest otkrije već pri prvoj intramuskularnoj injekciji, što može uzrokovati veliki, po život opasan intramuskularni hematom. Izbijanje zuba je često praćeno ne baš jakim krvarenjem. U prvim godinama života često se javljaju krvarenja iz oralne sluznice povezana s traumom na razne oštre predmete. Kada dijete nauči hodati, padove i modrice često prate obilno krvarenje iz nosa i hematomi na glavi. Krvarenje u orbiti, kao i postorbitalni hematomi, mogu dovesti do gubitka vida. Kod djeteta koje je počelo da puzi, tipična su krvarenja u zadnjici. Tada do izražaja dolaze krvarenja u velikim zglobovima udova. Pojavljuju se što ranije, što je hemofilija teža. Prva krvarenja predisponiraju ponovljeno izlivanje krvi u iste zglobove. Kod svake osobe koja boluje od hemofilije, 1-3 zgloba su zahvaćena posebnom upornošću i učestalošću krvarenja. Najčešće su zahvaćeni zglobovi koljena, a zatim zglobovi skočnog zgloba, lakta i kuka. Hemoragije u malim zglobovima šaka i stopala (manje od 1% svih lezija) i zglobovima između pršljenova su relativno rijetke. Kod svake osobe, u zavisnosti od starosti i težine bolesti, zahvaćeno je od 1-2 do 8-12 zglobova.

Potrebno je razlikovati akutnu hemartrozu (primarnu i rekurentnu), kronični hemoragično-destruktivni osteoartritis (artropatiju), sekundarni imunološki reumatoidni sindrom kao komplikaciju osnovnog procesa.

Akutna hemartroza se manifestira kao iznenadni početak (često nakon manje ozljede) ili nagli porast bolova u zglobovima. Zglob je često uvećan, koža preko njega je crvena, vruća na dodir. Nakon prve transfuzije krvnih komponenti, bol se brzo (u roku od nekoliko sati) smanjuje, a uz istovremeno vađenje krvi iz zgloba, gotovo odmah nestaje.

Razlikuju se IV stadijumi oštećenja zgloba. U I, ili ranoj fazi, volumen zgloba može biti povećan kao rezultat krvarenja. U "hladnom" periodu funkcija zgloba nije narušena, ali se rendgenskim pregledom utvrđuju karakteristični znakovi lezije. U fazi II se bilježi napredovanje procesa, što se otkriva prema rendgenskim podacima. U III stadiju, zglob se naglo povećava u veličini, deformira, često neravnomjeran i kvrgav na dodir, utvrđuje se izražena hipotrofija mišića zahvaćene noge. Pokretljivost zahvaćenih zglobova je manje-više ograničena, što je povezano kako s oštećenjem samog zgloba, tako i s promjenama mišića i tetiva. U ovoj fazi nastaje izražena osteoporoza, lako nastaju prijelomi unutar zglobova. U femuru dolazi do razaranja koštane supstance poput kratera ili tunela tipično za hemofiliju. Patela je djelimično uništena. Intraartikularne hrskavice su uništene, pokretni fragmenti ovih hrskavica nalaze se u zglobnoj šupljini. Moguće su različite vrste subluksacija i pomaka kostiju. U fazi IV, funkcija zgloba je gotovo potpuno izgubljena. Mogući su prijelomi zglobova. S godinama, težina i prevalencija oštećenja zglobnog aparata napreduje i postaje teža kada se oko patološki izmijenjenih zglobova pojave hematomi.

Sekundarni reumatoidni sindrom (Barkagan-Egorova sindrom) je čest oblik oštećenja zglobova kod pacijenata sa hemofilijom. Prvi put je ovaj sindrom opisan 1969. godine. U mnogim slučajevima ga promatraju liječnici, jer se javlja na pozadini već postojeće hemartroze i destruktivnih procesa karakterističnih za hemofiliju u zglobovima. Sekundarni reumatoidni sindrom je praćen kroničnim upalnim procesom (često simetričnim) u malim zglobovima šaka i stopala, koji prethodno nisu bili zahvaćeni krvarenjima. Nakon toga, kako proces napreduje, ovi zglobovi prolaze kroz tipičnu deformaciju. Povremeno se javlja jak bol u velikim zglobovima, može se primijetiti izražena jutarnja ukočenost u zglobovima. Bez obzira na pojavu novih krvarenja, zglobni proces stalno napreduje. U ovom trenutku krvni test otkriva pojavu ili naglo povećanje postojećih laboratorijskih znakova upalnog procesa, uključujući imunološke.

Kod većine ljudi s hemofilijom, sindrom se javlja u dobi od 10-14 godina. Do 20 godina njegova učestalost dostiže 5,9%, a do 30 godina - do 13% svih slučajeva bolesti. S godinama, učestalost i težina svih zglobnih lezija stalno napreduju, što dovodi do invaliditeta, prisiljava na korištenje štaka, invalidskih kolica i drugih uređaja. Progresija oštećenja zglobova zavisi od učestalosti akutnih krvarenja, pravovremenosti i korisnosti njihovog lečenja (veoma je važna rana transfuzija krvi i njenih komponenti), kvaliteta ortopedske njege, pravilne primene fizioterapijskih vežbi, fizioterapije i balneologije. efekte, izbor profesije i niz drugih okolnosti. Sva ova pitanja su trenutno izuzetno aktuelna, jer se očekivani životni vek kod hemofilije dramatično produžio zbog uspeha korektivnog lečenja.

Ekstenzivni i intenzivni potkožni, intermuskularni, subfascijalni i retroperitonealni hematomi su veoma teški i opasni. Postupno se povećavaju, mogu doseći ogromnu veličinu, sadržavati od 0,5 do 3 litre krvi ili više, dovesti do razvoja anemije, uzrokovati kompresiju i uništavanje okolnih tkiva i žila koje ih hrane, nekrozu. Tako, na primjer, retroperitonealni hematomi često potpuno uništavaju velike površine karličnih kostiju (promjer zone destrukcije može doseći 15 cm ili više), hematomi na nogama i rukama uništavaju cjevaste kosti i kalkaneus. Odumiranje koštanog tkiva dovodi do stvaranja krvarenja ispod periosta. Proces takve destrukcije kosti na rendgenskim snimcima često se pogrešno smatra tumorskim procesom. Često se u hematomima talože kalcijeve soli, što ponekad dovodi do stvaranja novih kostiju koje mogu zatvoriti zglobove i potpuno ih imobilizirati.

Mnogi hematomi, koji vrše pritisak na nervna stabla ili mišiće, uzrokuju paralizu, senzorne poremećaje i brzo progresivnu atrofiju mišića. Posebno su opasna opsežna krvarenja u mekim tkivima submandibularne regije, vrata, ždrijela i ždrijela. Ova krvarenja uzrokuju suženje gornjih disajnih puteva i gušenje.

Ozbiljan problem kod hemofilije je obilno i perzistentno bubrežno krvarenje, uočeno kod 14-30% osoba sa ovom bolešću krvi. Ova krvarenja mogu nastati kako spontano, tako i u vezi s ozljedama lumbalne regije koje su povezane s pijelonefritisom. Osim toga, može doći do bubrežnog krvarenja zbog povećanog izlučivanja kalcija u urinu zbog razaranja koštanog tkiva kod hemofilije. Pojava ili intenziviranje ovakvog krvarenja može se olakšati upotrebom analgetika (acetilsalicilna kiselina i dr.), masivnim transfuzijama krvi i plazme, što dovodi do dodatnog oštećenja bubrega. Bubrežnom krvarenju često prethodi produženo izlučivanje čestica krvi urinom koje se može otkriti samo laboratorijskim pretragama.

Pojava krvi u mokraći često je praćena teškim poremećajima mokrenja, kao i promjenom količine izlučenog urina (može doći do povećanja dnevnog volumena i smanjenja), napadaja bubrežne kolike zbog stvaranja krvnih ugrušaka u urinarnom traktu. Ove pojave su posebno intenzivne i izražene tokom lečenja, kada se privremeno vrati normalno stanje krvi. Prestanku izlučivanja krvi u urinu često prethodi bubrežna kolika, a često i privremeni izostanak izlučivanja mokraće sa pojavom znakova intoksikacije organizma toksičnim produktima metabolizma.

Bubrežna krvarenja se periodično ponavljaju, što godinama može dovesti do teških distrofično-destruktivnih promjena u ovom organu, sekundarne infekcije i smrti od razvoja zatajenja bubrega.

Gastrointestinalna krvarenja kod hemofilije mogu biti spontana, ali su češće uzrokovana uzimanjem acetilsalicilne kiseline (aspirina), butadiona i drugih lijekova. Drugi izvor krvarenja su očigledni ili skriveni čirevi na želucu ili dvanaestopalačnom crevu, kao i erozivni gastritis različitog porekla. Međutim, ponekad dolazi do difuznog kapilarnog krvarenja bez ikakvih destruktivnih promjena na sluznici. Ova krvarenja se nazivaju dijapedetska. Kada se pojave, crijevni zid je dugo zasićen krvlju, što brzo dovodi do kome kao posljedica teške anemije, nesvjestice zbog oštrog pada krvnog tlaka i smrti. Mehanizam razvoja takvog krvarenja do danas ostaje nejasan.

Krvarenja u trbušnim organima oponašaju različite akutne hirurške bolesti - akutni apendicitis, crijevnu opstrukciju itd.

Hemoragije u mozgu i leđnoj moždini i njihovim membranama kod hemofilije su gotovo uvijek povezane ili s ozljedama ili s upotrebom lijekova koji remete funkciju trombocita, koji su direktno uključeni u zgrušavanje krvi. Između trenutka povrede i razvoja krvarenja može postojati lagani interval u trajanju od 1-2 sata do jednog dana.

Karakteristična karakteristika hemofilije je produženo krvarenje tokom povreda i operacija. Pukotine su mnogo opasnije od linearnih ruptura. Krvarenje se često ne javlja odmah nakon povrede, već nakon 1-5 sati.

Uklanjanje krajnika kod hemofilije je mnogo opasnije od operacije abdomena.

Vađenje zuba, posebno kutnjaka, često je praćeno višednevnim krvarenjem ne samo iz zubnih utičnica, već i iz hematoma nastalih na mjestu infiltracije tkiva novokainom, što dovodi do razvoja anemije. Ovi hematomi uzrokuju destrukciju vilice. Kod hemofilije, zubi se uklanjaju u pozadini djelovanja antihemofilnih lijekova pod općom anestezijom. Ekstrakciju nekoliko zuba je najbolje uraditi odjednom.

Dio komplikacija kod hemofilije je zbog gubitka krvi, kompresije i destrukcije tkiva hematomima, infekcije hematoma. Velika grupa komplikacija povezana je i sa imunološkim poremećajima. Najopasniji od njih je pojava u krvi velikog broja imunoloških inhibitora („blokatora“) faktora zgrušavanja krvi VIII (ili IX), pretvarajući hemofiliju u takozvani inhibitorni oblik, u kojem je glavna metoda liječenja. je transfuzijska terapija (transfuzija krvi ili njenih komponenti) - gotovo potpuno gubi svoju efikasnost. Štoviše, ponovljena primjena antihemofilnih lijekova često uzrokuje brzo povećanje količine inhibitora u krvi, zbog čega transfuzija krvi i njenih komponenti, koja je u početku imala neki učinak, ubrzo postaje beskorisna. Učestalost inhibitornog oblika hemofilije, prema različitim autorima, kreće se od 1 do 20%, češće od 5 do 15%. Kod inhibicijskih oblika značajno je narušena funkcija trombocita, češća su krvarenja u zglobovima i izlučivanje krvi mokraćom, oštećenja zglobova su znatno veća.

Glavna metoda liječenja i prevencije krvarenja i krvarenja bilo koje lokalizacije i porijekla kod hemofilije je intravenska primjena dovoljnih doza krvnih pripravaka koji sadrže faktor VIII. Faktor VIII je varijabilan i praktično se ne čuva u konzerviranoj krvi, prirodnoj i suvoj plazmi. Za zamjensko liječenje prikladne su samo direktne transfuzije krvi od davaoca i krvnih proizvoda sa očuvanim faktorom zgrušavanja VIII. Direktnoj transfuziji krvi od davaoca pribjegava se samo kada liječnik nema druge antihemofilne lijekove. Teška je greška transfuziju krvi od majke, jer je ona nosilac bolesti, a nivo faktora VIII u njenoj krvi je naglo smanjen. Zbog kratkog životnog veka faktora VIII u krvi primaoca (oko 6-8 sati), transfuzije krvi, kao i transfuzije antihemofilne plazme, treba ponavljati najmanje 3 puta dnevno. Takve transfuzije krvi i plazme nisu pogodne za zaustavljanje masivnog krvarenja i pouzdano pokrivanje za razne hirurške intervencije.

Jednak volumen antihemofilne plazme je otprilike 3-4 puta efikasniji od svježe krvi. Dnevna doza od 30-50 ml/kg tjelesne težine antihemofilne plazme omogućava neko vrijeme da se održi nivo faktora VIII od 10-15%. Glavna opasnost ovakvog liječenja je preopterećenje cirkulacije krvi volumenom, što može dovesti do razvoja plućnog edema. Upotreba antihemofilne plazme u koncentriranom obliku ne mijenja situaciju, jer visoka koncentracija ubrizganog proteina uzrokuje intenzivno kretanje tekućine iz tkiva u krv, uslijed čega se volumen cirkulirajuće krvi povećava u isto vrijeme. na način kao kada se plazma infundira u normalnom razblaženju. Koncentrovana suha antihemofilna plazma ima samo prednost što sadrži više koncentrisanog faktora VIII zgrušavanja krvi, te se u maloj količini brže unosi u krvotok. Suva antihemofilna plazma se prije upotrebe razrijedi destilovanom vodom. Tretman antihemofilnom plazmom dovoljan je za zaustavljanje većine akutnih krvarenja u zglobovima (osim najtežih), kao i za prevenciju i liječenje manjih krvarenja.

Najpouzdaniji i najefikasniji kod hemofilije koncentrati faktora VIII koagulacije krvi. Najpristupačniji od njih je krioprecipitat. To je proteinski koncentrat izolovan iz plazme hlađenjem (krioprecipitacijom), koji sadrži dovoljnu količinu faktora zgrušavanja krvi, ali malo proteina. Nizak sadržaj proteina omogućava ubrizgavanje lijeka u krvotok u vrlo velikim količinama i povećanje koncentracije faktora VIII do 100% ili više bez straha od preopterećenja cirkulacije i plućnog edema. Krioprecipitat se mora čuvati na -20°C, što otežava transport. Kada se odmrzne, lijek brzo gubi svoju aktivnost. Suvi krioprecipitat i savremeni koncentrati faktora VIII koagulacije krvi su lišeni ovih nedostataka. Mogu se čuvati u običnom frižideru. Prekomjerna primjena krioprecipitata je nepoželjna, jer stvara visoku koncentraciju faktora koagulacije u krvi, zbog čega je poremećena mikrocirkulacija u organima i postoji opasnost od krvnih ugrušaka i razvoja DIC-a.

Svi antihemofilni lijekovi daju se intravenozno samo u mlazu, u najkoncentriranijem obliku i što je prije moguće nakon ponovnog otvaranja bez miješanja s drugim otopinama za intravensku primjenu. Jedan od glavnih razloga neuspjeha zamjenske terapije je ukapavanje krvnih produkata, što ne dovodi do povećanja nivoa faktora VIII u plazmi. Do stabilnog zaustavljanja krvarenja ne možete koristiti nikakve zamjene za krv i krvne preparate koji ne sadrže antihemofilne faktore, jer to dovodi do razrjeđivanja faktora VIII i smanjenja njegove koncentracije u serumu.

U slučaju akutnih krvarenja u zglobovima neophodna je privremena (ne duže od 3-5 dana) imobilizacija (imobilizacija) zahvaćenog ekstremiteta u fiziološkom položaju, zagrijavanje zahvaćenog zgloba (kompresije), ali ne i hlađenje. Rano uklanjanje krvi koja je utekla u zglob ne samo da odmah uklanja bol, sprečava dalje zgrušavanje krvi u zglobu, već i smanjuje rizik od razvoja i brzog napredovanja osteoartritisa. Za prevenciju i liječenje sekundarnih upalnih promjena nakon vađenja krvi, u zglobnu šupljinu se ubrizgava 40-60 mg hidrokortizona. Potporna transfuzijska terapija, koja se provodi u prvih 3-6 dana, sprječava dalje krvarenje i omogućava rano započinjanje terapije vježbanjem, što doprinosi bržem i potpunijem oporavku funkcije zahvaćenog ekstremiteta, te sprječava atrofiju mišića. Bolje je razvijati pokrete u zahvaćenom zglobu u fazama. U prvih 5-7 dana nakon skidanja zavoja izvode se aktivni pokreti kako u zahvaćenom zglobu tako iu drugim zglobovima ekstremiteta, postupno povećavajući učestalost i trajanje vježbi. Od 6-9 dana prelaze na vježbe "opterećenja", korištenje bicikloergometara, pedala za ruke, elastične vuče. Od 11-13 dana, kako bi se otklonila zaostala ukočenost i ograničila maksimalna fleksija ili ekstenzija, s oprezom se izvode vježbe pasivnog opterećenja. Istovremeno sa 5-7. danom propisuje se fizioterapija - hidrokortizon elektroforeza, anodna galvanizacija.

Kod krvarenja u mekim tkivima provodi se intenzivnije liječenje antihemofilnim lijekovima nego kod krvarenja u zglobovima. Uz razvoj anemije, dodatno se propisuju intravenske infuzije eritrocitne mase. Ako postoje znakovi infekcije hematoma, odmah se propisuju antibiotici širokog spektra. Bilo koje intramuskularne injekcije za hemofiliju su kontraindicirane, jer mogu uzrokovati opsežne hematome i pseudotumore. Penicilin i njegovi polusintetski analozi su također nepoželjni, jer u velikim dozama povećavaju krvarenje.

Rano i intenzivno liječenje antihemofilnim lijekovima doprinosi brzoj regresiji hematoma. Inkapsulirani hematomi se uklanjaju, ako je moguće, hirurški zajedno sa kapsulom.

Vanjska krvarenja iz oštećene kože, krvarenja iz nosa i krvarenja iz rana u usnoj šupljini zaustavljaju se kako transfuzijskom terapijom tako i lokalnim utjecajima - tretiranjem mjesta krvarenja lijekovima koji pospješuju zgrušavanje krvi. Osim toga, ovi lijekovi se mogu uzimati oralno. Na rane se stavljaju zavoji ili šavovi pod pritiskom. Slično, zaustavite krvarenje nakon vađenja zuba. Prilikom uklanjanja žvakaćih zuba provodi se nešto intenzivnija transfuzijska terapija, a istovremeno uklanjanje više zuba (3-5 ili više) zahtijeva uvođenje antihemofilnih lijekova u prva 3 dana.

U slučaju krvarenja iz nosa treba izbjegavati čvrsto pakovanje, jer se nakon vađenja tampona krvarenje često nastavlja još većom snagom. Brzo zaustavljanje krvarenja iz nosa obično osiguravaju antihemofilna plazma i antihemofilni lijekovi i istovremeno ispiranje nosne sluznice otopinama koje pospješuju zgrušavanje krvi.

Ozbiljnu opasnost predstavlja bubrežno krvarenje, u kojem su intravenske infuzije antihemofilne plazme i krioprecipitata neučinkovite.

Gastrointestinalno krvarenje se kontrolira velikim dozama koncentrata faktora zgrušavanja. Treba imati na umu da je želučano krvarenje često izazvano uzimanjem aspirina, brufena, indometacina u vezi s bolovima u zglobovima, zuboboljom ili glavoboljom. Kod pacijenata sa hemofilijom, čak i jedna doza aspirina može izazvati krvarenje u želucu.

U prevenciji i liječenju hroničnog osteoartritisa i drugih lezija mišićno-koštanog sistema potrebno je osigurati različite načine zaštite zglobova i prevencije ozljeda udova. Da biste to učinili, pjenasti jastučići se ušivaju u odjeću oko zglobova koljena, skočnog zgloba i lakta, a izbjegavaju se oni sportovi koji su povezani sa skokovima, padovima i modricama (uključujući biciklizam i vožnju motocikla). Pridaje se značaj što ranijem i potpunom liječenju akutnih krvarenja u zglobovima i mišićima, intenzivnim cjelogodišnjim fizioterapijskim vježbama. Za to postoje posebni kompleksi atraumatskih vježbi u vodi, na mekim strunjačama i uređajima za opterećenje - bicikloergometri, ručne kapije. Nastavu treba započeti u predškolskom ili osnovnoškolskom uzrastu, odnosno prije nego što se razviju teški poremećaji mišićno-koštanog sistema. Kompleksna terapija je dopunjena fizioterapijom (visokofrekventne struje, elektroforeza glukokortikosteroida) i balneološkim metodama liječenja, prvenstveno blatoterapijom, slanim i radonskim kupkama. Kod čestih i tvrdoglavo ponavljajućih krvarenja u istim zglobovima, radi se rendgenska terapija i hirurško liječenje.

Minimiziranje rizika od ozljeda i posjekotina iz ranog djetinjstva važno je u prevenciji krvarenja. Igračke koje se lako lome (uključujući metalne i plastične), kao i nestabilni i teški predmeti, isključeni su iz svakodnevnog života. Namještaj treba biti sa zaobljenim rubovima, izbočeni rubovi su omotani vatom ili pjenastom gumom, pod je prekriven tepihom. Komunikacija i igre pacijenata sa djevojčicama su poželjnije, ali ne i sa dječacima. Za pacijenta je važan pravi izbor zanimanja i radnog mjesta.

Prevencija hemofilije još nije razvijena. Određivanje spola nerođenog djeteta genetskim testiranjem ćelija dobivenih iz amnionske tekućine omogućava vam da pravovremeno prekinete trudnoću, ali ne pokazuje da li je fetus nosilac gena za hemofiliju. Trudnoća je očuvana ako je fetus muškog pola, jer se svi sinovi oboljelih rađaju zdravi. Prekinite trudnoću ako je fetus ženskog pola, jer su sve kćerke oboljelih od hemofilije nositeljice bolesti.

Kod nositeljica hemofilije koje imaju 50% šanse da rode oboljelo dijete (ako je fetus muški), ili koje su prenositelji hemofilije (ako je fetus ženskog pola), rođenje samo djevojčice prenosi rizik od oboljelih od hemofilije u porodici od prve do druge generacije, istovremeno povećavajući ukupan broj nosilaca bolesti.

Kromatografski pročišćena liofilizirana frakcija ljudske plazme koja sadrži faktor koagulacije VIII. Antihemofilni globulin, nadoknađuje nedostatak faktora koagulacije VIII, privremeno nadoknađuje defekt koagulacije kod pacijenata sa hemofilijom A. Nalazi se u prirodnoj kombinaciji sa proteinom C faktora VIII, von Willebrand faktorom. Uključen je u procese zgrušavanja krvi, potiče prelazak protrombina u trombin i stvaranje fibrinskog ugruška. Odmah nakon primjene povećava koagulacijski potencijal krvi. Smanjenje aktivnosti antihemofilnog faktora ima dvofazni karakter: rana faza je brzo smanjenje aktivnosti, karakterizira vrijeme ekvilibracije sa ekstravaskularnim prostorom, druga faza je spora, odražava biološki poluživot primijenjen antihemofilni faktor i iznosi 9-14 sati Specifična aktivnost (nakon dodatka humanog albumina) - 9-22 IU proteina. 1 IU (kako je definisano standardom faktora zgrušavanja krvi VIII SZO) približno je jednako nivou antihemofilnog faktora prisutnog u 1 ml sveže plazme ljudskog donora.
Vrijeme postizanja maksimalne koncentracije u plazmi nakon intravenske primjene je od 10 minuta do 2 sata. Poluvrijeme je 8,4-19,3 sata. Aktivnost faktora koagulacije VIII opada postepeno - za 15% u roku od 12 sati. Kod hipertermije, period poluživot faktora koagulacije VIII može se smanjiti.

Indikacije za upotrebu lijeka Faktor koagulacije VIII

Hemofilija A, von Willebrandova bolest (liječenje i prevencija krvarenja, uključujući i tokom hirurških intervencija); stečeni nedostatak faktora VIII, bolesti praćene stvaranjem antitela na faktor VIII.

Kako koristiti faktor koagulacije VIII

U / u. Za prevenciju spontanog krvarenja ili sa blagim krvarenjem - 10 IU / kg (sadržaj faktora VIII, neophodnog za sprečavanje spontanog krvarenja - 5% normalnog nivoa); uz umjereno krvarenje i malu hiruršku intervenciju (na primjer, vađenje zuba) - 15-25 IU / kg (sadržaj faktora VIII - 30-80% norme) nakon čega slijedi doza održavanja od 10-15 IU / kg svakih 12- 24 sata tokom 3 dana ili dok se ne postigne dovoljan klinički efekat; kod akutnog krvarenja opasnog po život - 40-50 IU / kg (sadržaj faktora VIII - 60-100% norme) nakon čega slijedi doza održavanja od 20-25 IU / kg svakih 8-24 sata; uz opsežne hirurške intervencije - 40-50 IU / kg 1 sat prije zahvata i 20-25 IU / kg - 5 sati nakon prve doze (to jest, 80-100% norme prije i nakon operacije), zatim ponovite svaki 8-24 h dok se ne postigne dovoljan klinički efekat. Za dugotrajnu prevenciju krvarenja kod teške hemofilije A - 12-25 IU/kg svaka 2-3 dana.
Krioprecipitat se koristi uzimajući u obzir kompatibilnost za krvne grupe AB0. Posuda sa smrznutim krioprecipitatom stavlja se za odmrzavanje i potpuno otapanje u vodenoj kupelji na temperaturi koja ne prelazi 35-37 ° C i inkubira ne više od 7 minuta. Dobivena prozirna žućkasta otopina, koja ne smije sadržavati ljuspice, koristi se odmah nakon pripreme. Primjenjuje se intravenozno pomoću šprica ili transfuzijskog sistema sa jednokratnim filterom. Doza zavisi od početnog sadržaja faktora VIII u krvi pacijenta sa hemofilijom, prirode i lokalizacije krvarenja, stepena rizika od hirurške intervencije, prisustva u krvi pacijenta specifičnog inhibitora koji može neutralisati aktivnost faktor VIII (izražen u jedinicama aktivnosti faktora VIII). Da bi se osigurala efikasna hemostaza kod najčešćih komplikacija hemofilije (hemartroze, bubrežna, gingivalna i nazalna krvarenja), kao i vađenja zuba, sadržaj faktora VIII u plazmi treba da bude najmanje 20%; s intermuskularnim hematomima, gastrointestinalnim krvarenjem, prijelomima i drugim ozljedama - ne manje od 40%; u većini hirurških intervencija - najmanje 70%. Sa uvođenjem faktora VIII brzinom od 1 jedinice po 1 kg tjelesne težine, njegov sadržaj u krvi se povećava u prosjeku za 1%. Na osnovu toga, broj doza potrebnih za povećanje koncentracije faktora VIII u krvi na datu razinu izračunava se po formuli: tjelesna težina pacijenta (u kg) pomnožena sa potrebnim sadržajem faktora VIII u krvi pacijenta i podijeljeno sa 200 (minimalni sadržaj faktora VIII u jedinicama aktivnosti u 1 dozi krioprecipitata). Nakon potpunog zaustavljanja krvarenja, uvođenje faktora VIII pacijentima s hemofilijom provodi se u intervalima od 12-24 sata u dozi koja osigurava povećanje sadržaja faktora VIII za najmanje 20%. Liječenje se nastavlja nekoliko dana - do vidljivog smanjenja veličine hematoma. Kod hirurških intervencija hemostatska doza se daje 30 minuta prije operacije. U slučaju masivnog krvarenja, gubitak krvi se nadoknađuje, na kraju operacije ponovo se uvodi krioprecipitat (1/2 doze od originalne). 3-5 dana nakon operacije potrebno je održavati koncentraciju faktora VIII u krvi pacijenta u granicama kao i tokom operacije. U postoperativnom periodu u budućnosti, za održavanje hemostaze, dovoljno je povećati sadržaj faktora VIII na 20%. Trajanje hemostatske terapije je 7-14 dana i zavisi od prirode, lokacije krvarenja, reparativnih karakteristika tkiva. Preporučljivo je kombinirati liječenje bolesnika s hemofilijom krioprecipitatom uz istovremenu primjenu antifibrinolitičkih sredstava i kortikosteroida u profilaktičkim i srednjim terapijskim dozama.

Kontraindikacije za upotrebu lijeka Faktor zgrušavanja VIII

Povećana osjetljivost.

Nuspojave faktora zgrušavanja VIII

Alergijske i transfuzijske reakcije (urtikarija, osip, stridorno disanje, sniženi krvni tlak, zimica, hipertermija, anafilaksa), prolazne parestezije oralne sluznice, mučnina, povraćanje, glavobolja.

Posebne upute za primjenu lijeka Faktor zgrušavanja VIII

Koristite oprezno tokom trudnoće i dojenja.
Neophodno je kontrolisati broj otkucaja srca prije i za vrijeme terapije: kod značajnog povećanja srčane frekvencije, brzina infuzije se usporava ili se primjena prekida. Tokom i nakon završetka terapije potrebno je kontrolisati sadržaj faktora VIII u krvi. Za identifikaciju znakova progresivne hemolitičke anemije potrebno je pratiti hematokrit i direktnu Coombsovu reakciju. Promjene u imunološkom statusu pacijenata s asimptomatskom hemofilijom nastaju zbog ponovljenog izlaganja virusnim patogenima i/ili mogućeg prisustva nečistoća u preparatima faktora VIII (na primjer, IgG). Da bi se postigli zadovoljavajući klinički rezultati, može se primijeniti dodatna doza uz početno izračunatu dozu. U nedostatku kliničkog učinka, potrebno je provesti test za identifikaciju inhibitora i određivanje njegove količine u neutraliziranim antihemofilnim jedinicama po 1 ml ili ukupnom volumenu plazme. Da bi se smanjio rizik od nuspojava, preporučuje se upotreba najkasnije 1 sat nakon razrjeđivanja, primjena samo intravenozno, najmanje 3 sata (brzinom od 10 ml/min), ne zamrzavati otopinu i ne koristiti ponovo . Moguće je razviti antitela na faktor koagulacije VIII, u takvim slučajevima se obično smanjuje efikasnost terapije, što može zahtevati povećanje doze faktora koagulacije VIII. Moguće je povećati stopu pada broja CD4 ćelija kod HIV seropozitivnih pacijenata sa hemofilijom.