Plazma faktori koagulacije. GPM.1.8.2.0003.15 Određivanje aktivnosti faktora zgrušavanja krvi

Faktor zgrušavanja krvi VIII ( Faktor koagulacije VIII)

Klinička i farmakološka skupina

Lijek za faktor VIII koagulacija krv

farmakološki učinak

Hemostatski lijek. Pospješuje prijelaz protrombina u trombin i stvaranje fibrinskog ugruška.

Farmakokinetika

U bolesnika s hemofilijom A T1/2 je 12 sati.Aktivnost faktora zgrušavanja krvi VIII smanjuje se za 15% unutar 12 sati.Faktor zgrušavanja krvi VIII je termolabilan i brzo se uništava kada temperatura poraste, što dovodi do smanjenja T1. /2.

Doziranje

Octanate se primjenjuje intravenozno nakon razrjeđivanja s vodom za injekcije, koja je uključena u pakiranje. Doza oktanata i trajanje nadomjesna terapija ovise o stupnju nedostatka faktora koagulacije VIII, mjestu i trajanju krvarenja, kliničko stanje pacijent.

Doza lijeka izražava se u međunarodnim jedinicama (IU) u skladu s prihvaćenim standardima SZO za koagulacijski faktor VIII. Aktivnost faktora zgrušavanja krvi VIII u plazmi izražava se ili kao postotak (u odnosu na normalni sadržaj faktora u ljudskoj plazmi) ili u IU (u odnosu na Međunarodni standard za faktor zgrušavanja krvi VIII).

1 IU faktora koagulacije krvi VIII ekvivalentan je njegovom sadržaju u 1 ml normalne ljudske plazme. Izračun potrebne doze temelji se na empirijskim rezultatima, prema kojima 1 IU/kg faktora koagulacije krvi VIII povećava razinu faktora plazme za 1,5-2% normalnog sadržaja. Za izračun potrebne doze za bolesnika određuje se početna razina aktivnosti faktora zgrušavanja krvi VIII i procjenjuje se koliko tu aktivnost treba povećati.

Potrebna doza = tjelesna težina (kg) × željeno povećanje razine faktora VIII (%) (IU/dl) × 0,5.

Količina i učestalost primjene lijeka treba uvijek odgovarati kliničkoj učinkovitosti u svakom pojedinom slučaju.

U slučaju naknadnog krvarenja, razina aktivnosti faktora VIII ne smije pasti ispod početne razine u plazmi (% normalnih razina) tijekom odgovarajućeg vremenskog razdoblja. Sljedeća tablica može se koristiti kao vodič za odabir doze faktora zgrušavanja VIII za razna krvarenja i kirurške intervencije.

Pacijenti reagiraju na primjenu lijeka pojedinačno, sa drugačija razina oporavak in vivo, T1/2 faktora koagulacije krvi VIII karakterizira varijabilnost. Stoga tijekom liječenja treba pratiti njegovu razinu kako bi se regulirala doza i učestalost primjene. Aktivnost koagulacijskog faktora VIII potrebno je pratiti tijekom nadomjesne terapije, osobito tijekom većih kirurških intervencija.

Doze navedene u tablici su okvirne. Liječnik pojedinačno određuje potrebnu dozu i učestalost primjene lijeka.

S ciljem dugotrajna prevencija krvarenje kod teške hemofilije A lijek se propisuje u dozi od 20-40 IU/kg tjelesne težine svaka 2-3 dana. U nekim slučajevima, osobito u mladih bolesnika, može biti potrebno smanjiti interval između doza ili povećati dozu.

Neki pacijenti mogu doživjeti formiranje nakon tretmana. inhibitorna antitijela na faktor zgrušavanja krvi VIII, što može utjecati na učinkovitost daljnje liječenje. Ako se u pozadini terapije ne primijeti očekivano povećanje aktivnosti faktora VIII ili nema potrebnog hemostatskog učinka, preporučuje se savjetovanje sa specijaliziranim stručnjakom. centar za liječenje pomoću Bethesda testa. Terapija indukcije imunološke tolerancije može se koristiti za uklanjanje inhibitora faktora VIII. Temelj mu je svakodnevna primjena faktora zgrušavanja krvi VIII u koncentraciji većoj od blokirajuće sposobnosti inhibitora (100-200 IU/kg/dan ovisno o titru inhibitora). Faktor zgrušavanja krvi VIII, obavljajući funkciju antigena, izaziva povećanje titra inhibitora dok se ne razvije tolerancija, tj. dok se inhibitor ne smanji i nakon toga nestane. Terapija je kontinuirana i prosječno traje od 10 do 18 mjeseci. Takvo liječenje smiju provoditi samo stručnjaci u području antihemofilne terapije.

Otapanje liofilizata

1. Preporuča se otapalo (voda za injekcije) i liofilizat u zatvorenim bocama dovesti do sobna temperatura. Ako se otapalo koristi prije zagrijavanja vodena kupka, potrebno je paziti da voda ne dođe u dodir s gumenim čepovima ili čepovima boca. Temperatura vodene kupelji ne smije prelaziti 37°C.

2. Skinuti zaštitne čepove s bočica s liofilizatom i vodom, dezinficirati gumene čepove obje bočice jednom od dezinfekcijskih maramica.

3. Oslobodite kraći kraj dvostrane igle iz plastične ambalaže, probušite njime čep boce s vodom i pritisnite dok se ne zaustavi.

4. Okrenite bočicu s vodom zajedno s iglom, otpustite dugi kraj dvostrane igle, probušite njime čep bočice s liofilizatom i pritisnite dok se ne zaustavi. Vakuum u bočici za liofilizat će uvući vodu.

5. Bočicu s vodom zajedno s iglom odvojiti od bočice s liofilizatom. Lijek će se brzo otopiti; Da biste to učinili, bocu morate lagano protresti. Za upotrebu je prihvatljiva samo bezbojna, prozirna ili blago opalescentna otopina bez taloga.

Pravila za pripremu i davanje otopine

Kao mjeru opreza, potrebno je pratiti otkucaje srca prije i tijekom primjene Octanatea. U slučaju izraženog ubrzanja pulsa, davanje lijeka treba usporiti ili prekinuti.

Nakon otapanja koncentrata prema uputama, skinite zaštitni omotač s igle filtera i umetnite je u bočicu s koncentratom. Uklonite poklopac s igle filtera i spojite štrcaljku. Okrenite bocu sa štrcaljkom naopako i uvucite otopinu u štrcaljku. Injekcije treba provoditi u skladu s pravilima asepse i antisepse. Odspojite filtarsku iglu sa štrcaljke i umjesto nje pričvrstite leptir iglu.

Otopinu treba primijeniti IV polako brzinom od 2-3 ml/min.

Ako koristite više od jedne bočice Octanatea, možete ponovno upotrijebiti štrcaljku i leptir iglu.

Filtarska igla je samo za jednokratnu upotrebu. Uvijek koristite iglu s filtrom za izvlačenje pripremljene otopine u štrcaljku.

Neiskorištenu otopinu lijeka treba zbrinuti u skladu s važećim propisima.

Predozirati

Iako nisu primijećeni simptomi predoziranja faktorom zgrušavanja VIII, preporučuje se ne prekoračiti propisanu dozu.

Interakcije lijekova

Podaci o interakciji Octanate s drugima lijekovi nedostaju.

Trudnoća i dojenje

Primjena lijeka tijekom trudnoće i dojenja moguća je u slučajevima kada je očekivana korist od terapije za majku veća potencijalni rizik za fetus ili dojenče.

Nuspojave

Alergijske reakcije: rijetko - angioedem, osjećaj pečenja u području injekcije, zimica, valovi vrućine, urtikarija (uključujući generaliziranu), glavobolja, sniženi krvni tlak, apatija, mučnina, povraćanje, tjeskoba, tahikardija, osjećaj stezanja prsa, otežano disanje, groznica, osjećaj drhtanja. Jako rijetko (<1/10 000) эти симптомы могут прогрессировать до развития тяжелой анафилактической реакции, включая шок.

Bolesnici s hemofilijom A mogu razviti protutijela (inhibitore) na faktor zgrušavanja krvi VIII (<1/1000). Наличие ингибиторов приводит к неудовлетворительному клиническому ответу на введение препарата. В таких случаях рекомендуется обращаться в специализированные гематологические/гемофильные центры. Неоходимо обследовать пациента на наличие антител с помощью соответствующих методов (тест Бетезда).

Uvjeti i razdoblja skladištenja

Lijek treba čuvati na mjestu zaštićenom od svjetlosti i izvan dohvata djece na temperaturi od 2° do 25°C; nemojte zamrzavati. Rok trajanja - 3 godine.

posebne upute

Pri primjeni lijeka moguć je razvoj reakcija preosjetljivosti, kao i kod primjene drugih injektibilnih lijekova proteinskog podrijetla.

Osim faktora zgrušavanja krvi VIII, lijek sadrži i druge krvne bjelančevine u tragovima. Rani znakovi reakcija preosjetljivosti uključuju koprivnjaču, stezanje u prsima, otežano disanje, nizak krvni tlak i anafilaksiju (tešku alergijsku reakciju). Ako se pojave ovi simptomi, trebate odmah prestati uzimati lijek. U slučaju razvoja šoka, potrebno je koristiti suvremene metode anti-šok terapije.

Kod primjene lijekova dobivenih iz ljudske krvi ili plazme ne može se u potpunosti isključiti mogućnost prijenosa uzročnika infekcije. To se također odnosi na uzročnike nepoznatih bolesti. Međutim, rizik prijenosa uzročnika infekcije smanjuje se sljedećim mjerama:

— odabir darivatelja liječničkim razgovorom i pregledom, kao i probir pulova plazme na prisutnost antigena virusa hepatitisa B (HBV), antitijela na HIV i na virus hepatitisa C (HCV);

— analiza pulova plazme na prisutnost HCV genetskog materijala;

— postupci inaktivacije/uklanjanja uključeni u proces proizvodnje koji su validirani u virusnom modelu. Ovi tretmani su učinkoviti za HIV, virus hepatitisa A (HAV), HBV i HCV. Postupci inaktivacije/uklanjanja mogu imati ograničenu učinkovitost protiv virusa bez ovojnice, od kojih je jedan parvovirus B19. Parvovirus B19 može izazvati ozbiljne reakcije kod seronegativnih trudnica (fetalna infekcija) i kod onih s imunodeficijencijom ili povećanim stvaranjem crvenih krvnih stanica (npr. hemolitička anemija).

Kod primjene koncentrata faktora VIII dobivenog iz plazme preporučuje se cijepljenje protiv hepatitisa A i hepatitisa B.

Ako se pojave alergijske reakcije, pacijenta treba ispitati na prisutnost inhibitora. U bolesnika s inhibitorima koagulacijskog faktora VIII može postojati povećan rizik od razvoja anafilaktičkih reakcija tijekom naknadnog liječenja Octanatom. Stoga se prva uporaba ovog lijeka prema preporuci liječnika treba provesti pod medicinskim nadzorom u uvjetima koji osiguravaju pružanje kvalificirane medicinske skrbi u slučaju alergijskih reakcija.

Ne smijete koristiti druge lijekove tijekom primjene Octanate.

Za primjenu Octanatea treba koristiti samo injekcijske uređaje koji su uključeni u pakiranje. Moguća je adsorpcija faktora zgrušavanja krvi VIII na unutarnjoj površini nekih injekcijskih naprava, što dovodi do smanjenja učinkovitosti liječenja.

Koristiti u djetinjstvu

Primjena je moguća prema režimu doziranja.

Podaci o studiji

Posebne upute: Nemojte provoditi studiju tijekom akutnih razdoblja bolesti i tijekom uzimanja antikoagulansa (najmanje 30 dana mora proći nakon prekida). Biomaterijal se mora predati na istraživanje na prazan želudac. Između posljednjeg obroka i uzimanja krvi mora proći najmanje 8 sati.

OPĆA PRAVILA ZA PRIPREMU ZA ISTRAŽIVANJE:

1. Za većinu istraživanja preporuča se davanje krvi ujutro, od 8 do 11 sati, natašte (od zadnjeg obroka do vađenja krvi mora proći najmanje 8 sati, vodu možete piti kao i obično) , uoči studije, lagana večera s ograničenjem jedenja masne hrane. Za testove na infekcije i hitne studije, prihvatljivo je donirati krv 4-6 sati nakon posljednjeg obroka.

2. PAŽNJA! Posebna pravila pripreme za niz testova: strogo na prazan želudac, nakon 12-14 sati gladovanja, trebate donirati krv za gastrin-17, lipidni profil (ukupni kolesterol, HDL kolesterol, LDL kolesterol, VLDL kolesterol, trigliceridi, lipoproteini (a), apolipoprotein A1, apolipoprotein B); Test tolerancije glukoze provodi se ujutro natašte nakon 12-16 sati gladovanja.

3. Uoči studije (unutar 24 sata) izbjegavajte alkohol, intenzivnu tjelesnu aktivnost i uzimanje lijekova (u dogovoru s liječnikom).

4. 1-2 sata prije davanja krvi suzdržite se od pušenja, nemojte piti sok, čaj, kavu, možete piti negaziranu vodu. Izbjegavajte fizički stres (trčanje, brzo penjanje stepenicama), emocionalno uzbuđenje. Preporuča se odmor i smirenje 15 minuta prije davanja krvi.

5. Ne biste trebali donirati krv za laboratorijsko ispitivanje odmah nakon fizioterapeutskih postupaka, instrumentalnog pregleda, rendgenskih i ultrazvučnih pregleda, masaže i drugih medicinskih postupaka.

6. Pri praćenju laboratorijskih parametara tijekom vremena preporuča se ponavljanje pretraga pod istim uvjetima - u istom laboratoriju, davanje krvi u isto doba dana i sl.

7. Krv za istraživanje mora se donirati prije početka uzimanja lijekova ili ne prije 10-14 dana nakon njihovog prekida. Da bi se procijenila kontrola učinkovitosti liječenja bilo kojim lijekovima, istraživanje treba provesti 7-14 dana nakon zadnje doze lijeka.

Ako uzimate lijekove, svakako obavijestite svog liječnika.

OPĆI FARMAKOPEJSKI ČLANAK

Predstavljen po prvi put

Ova farmakopejska monografija odnosi se na metode određivanja aktivnosti faktora zgrušavanja ljudske krvi I, II, VII, VIII, IX, X, XI, von Willebrandovog faktora, antitrombina III u plazmi i krvnim pripravcima.

OPĆE ODREDBE

Određivanje aktivnosti faktora koagulacije temelji se na 2 pristupa:

1. Metoda u jednom koraku. Obnavljanje procesa zgrušavanja krvi u plazmi s nedostatkom faktora nakon dodavanja pripravka ovog faktora (metoda zgrušavanja).
2. Dvostupanjska metoda. U prvoj fazi, korištenjem specifičnog kofaktora, aktivira se proteolitička aktivnost faktora II ili faktora X kako bi se formirao pojedinačno aktivirani faktor IIa ili Xa. U drugoj fazi, količina rezultirajućeg aktiviranog faktora određena je reakcijom njegovog cijepanja specifičnog kromogenog peptida (kromogena metoda).

Kromogenu metodu moguće je provesti na 2 načina: prema kinetici stvaranja kromogena pod utjecajem aktiviranog faktora ili prema krajnjoj točki akumulacije kromogena tijekom određenog vremena inkubacije.

Za provođenje obje metode moguće je koristiti plastične epruvete, tablete, optičko-mehaničke, mehaničke poluautomatske i potpuno automatizirane koagulometre.

U svim se metodama izračun aktivnosti vrši usporedbom aktivnosti ispitnog uzorka s aktivnošću međunarodnog standarda NIBSC ili sekundarnog referentnog standarda faktora zgrušavanja kalibriranog prema međunarodnom standardu u međunarodnim jedinicama aktivnosti (IU). Ekvivalentnost međunarodnog standarda u IU utvrđuje WHO. Aktivnost koagulacijskog faktora u 1,0 ml svježe normalne krvne plazme 300 davatelja uzima se kao 1 IU (100%). Aktivnost se može izraziti u IU/ml, IU/bočici, IU/mg proteina i kao postotak količine koju je naveo proizvođač.

ČIMBENICI

Faktorja (fibrinogen)

Metoda zgrušavanja

Aktivnost fibrinogena određuje se Claussovom metodom.

Princip metode

Kada se trombin doda uzorku koji sadrži fibrinogen, opaža se stvaranje fibrinskog ugruška. Kada se koristi trombin s visokom aktivnošću (~10 IU/ml) i uzorci s niskom koncentracijom fibrinogena (ispod 100 mg/dl), može se dobiti linearni odnos.

Za određivanje fibrinogena koriste se komercijalni testni sustavi koji sadrže reagens trombina koji sadrži inhibitor heparina i pufer za razrjeđivanje uzorka ili komercijalni reagens trombina.

Koncentracija fibrinogena izražava se u mg/dl. Za izradu kalibracijskog grafikona koristite standardni uzorak fibrinogena ili plazma kalibrator certificiran prema međunarodnom standardu. Standardni uzorak ili uzorak plazme kalibratora otopi se u destiliranoj vodi prema uputama. Pripremite 5 serijskih razrjeđenja standardnog uzorka, počevši od koncentracije od ~ 100 mg/dL, koristeći pufer za razrjeđivanje uzorka pH = 7,3 ± 0,1. Analiza se provodi na temperaturi od 37°C prema uputama za kit. Za svako razrjeđenje, vrijeme stvaranja ugruška određuje se tri puta. Na temelju dobivenih rezultata konstruira se kalibracijski grafikon ovisnosti vremena stvaranja ugruška o koncentraciji fibrinogena u logaritamskim koordinatama.

Pripremite 2 razrjeđenja ispitnog uzorka s koncentracijom ispod 100 mg/dl. Za svako razrjeđenje, vrijeme stvaranja ugruška određuje se tri puta. Količina fibrinogena u svakom razrjeđenju određena je pomoću kalibracijskog grafikona.

FaktorII(trombin)

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora II provodi se korištenjem ljudske plazme s nedostatkom faktora II kao supstrata. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u smjesu kalcija.

Za razrjeđivanje standarda i lijekova koristite NaCl-imidazolni pufer pH 7,3 ± 0,1 uz dodatak 0,1% goveđeg ili ljudskog albumina. Za konstruiranje kalibracijske krivulje pripremite seriju serijskih razrjeđenja standarda faktora II u rasponu aktivnosti od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrjeđuje do koncentracije manje od 1 IU/ml. Analizirati 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak, mjerenja vremena zgrušavanja provode se najmanje 2 puta. Mjerenje se provodi unutar 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se provodi na temperaturi od (37±0,5)°C. U plastičnu epruvetu dodajte 50 μl plazme s nedostatkom faktora II i 50 μl razrjeđenja standarda ili lijeka. Smjesa se inkubira na (37 ± 0,5) °C 120 – 240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja 200 μl tromboplastin kalcija, prethodno zagrijanog na temperaturu od (37 ± 0,5) ° C, u smjesu. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu varirati u odgovarajućim omjerima.

Kalibracijski graf iscrtava se u polulogaritamskim koordinatama. Vrijednosti aktivnosti faktora II nanesene su duž logaritamske apscisne osi, a vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda naneseno je duž ordinatne osi. Aktivnost faktora II za svako razrjeđenje ispitnog uzorka nalazi se iz kalibracijskog grafikona. FII aktivnost ( A

k

1. Kromogena metoda

Metoda se temelji na usporedbi enzimske aktivnosti faktora IIa, nastalog nakon specifične aktivacije faktora II, u odnosu na specifični kromogeni peptidni supstrat s istom aktivnošću standardnog uzorka (međunarodnog ili sličnog).

Faktor II se aktivira aktivatorom ekarinom, izoliranim iz otrova poskoka. Aktivirani faktor II (trombin) selektivno cijepa kromogeni supstrat (H-D-fenilalanin-L-pipekolil-L-arginin-4-nitroanilid dihidroklorid, 4-toluensulfonilglicil-prolil-L-arginin-4-nitroanilid, H-D-cikloheksilglicil-α-aminobutiril - L-arginin-4-nitroanilid, D-cikloheksilglicil-L-alanil-L-arginin-4-nitroanilid diacetat) da nastane P-nitroanilin. Kinetika reakcije je proučavana fotometrijski na 405 nm. U ovom slučaju vrijednost optičke gustoće proporcionalna je aktivnosti faktora II.

Određivanje faktora II kromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test setova. Analiza se provodi u skladu s uputama za pribor. Standardni uzorak i pripravak prethodno su razrijeđeni plazmom s nedostatkom faktora II do koncentracije od ~ 1 IU/ml (osnovno razrjeđenje). Iz glavnog razrjeđenja pripremaju se 3 razrjeđenja standardnog uzorka i 3 razrjeđenja lijeka s tris-fiziološkom pufer otopinom pH 8,4. Svako razrjeđenje standardnog uzorka određuje se dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izradu kalibracijskog grafikona. Ispitni uzorci određuju se tri puta.

Ispitivanja se provode ručno mikropločom i spektrofotometrom koji održava temperaturu u rasponu od (37±0,5)°C ili u automatskom načinu rada pomoću koagulometra.

Za provođenje ručnog testiranja, 25 μl svakog razrjeđenja ispitivanog lijeka ili standardnog uzorka dodaje se u jažice mikropločice. Dodajte 125 µl pufera za razrjeđivanje i 25 µl ekarina u svaku jažicu i inkubirajte na (37±0,5)°C 2 minute. Nakon vremena inkubacije, u svaku jažicu se doda 25 μl supstrata kromogenog faktora IIa.

A/min).

Ako kontinuirano mjerenje apsorbancije nije moguće, odredite apsorbanciju na 405 nm u uzastopnim vremenskim intervalima (npr. 40 s) i nacrtajte apsorbanciju u odnosu na vrijeme i izračunajte ∆ AA

1. Test na odsutnost trombina

Za ispitivanje pripremite otopinu lijeka rekonstituiranog u skladu s uputama. Ako je u pripravku prisutan heparin, neutralizira se dodavanjem protamin sulfata brzinom od 10 μg protamin sulfata na 1 IU heparina.

Priprema otopine fibrinogena

0,3 g fibrinogena se otopi u 100 ml, pomiješa i drži 15-20 minuta na sobnoj temperaturi.

Otopina ima rok trajanja 1 mjesec na temperaturi od 2 do 8°C.

Priprema otopine trombina

Liofilizat se otopi prema uputama proizvođača, ostavi 15-20 minuta na sobnoj temperaturi i razrijedi 0,9% otopinom natrijevog klorida do sadržaja trombina od 1 IU/ml.

Otopina ima rok trajanja 6 mjeseci na temperaturi od minus 20°C. Otopina se ne može ponovno zamrzavati nakon odmrzavanja.

Napredak odlučnosti

Jednaki volumeni rekonstituiranog lijeka i otopine fibrinogena dodaju se u 2 epruvete. U treću epruvetu (kontrolni uzorak) dodaju se jednaki volumeni otopine trombina i otopine fibrinogena te se sadržaj epruveta miješa rotacijskim pokretima. Jedna epruveta s rekonstituiranim lijekom se inkubira u vodenoj kupelji na 37°C 6 sati, druga epruveta s rekonstituiranim lijekom se inkubira na sobnoj temperaturi 24 sata. Bilježi se prisutnost ili odsutnost koagulacije (ugruška).

Kontrolni uzorak se inkubira u vodenoj kupelji na 37°C i bilježi se vrijeme stvaranja ugruška.

Kriterij za prihvatljivost rezultata je koagulacija u kontrolnom uzorku nakon 30 s.

FaktorVII

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora VII provodi se pomoću ljudske plazme s nedostatkom faktora VII. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u smjesu kalcija.

Za razrjeđivanje standarda i lijekova koristite NaCl-imidazolni pufer pH 7,3 uz dodatak 0,1% otopine humanog ili goveđeg albumina. Za konstruiranje kalibracijske krivulje pripremite seriju serijskih razrjeđenja standarda uzorka faktora VII u rasponu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrjeđuje do koncentracije manje od 1 IU/ml. Analizirati 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak, mjerenja vremena zgrušavanja provode se najmanje 2 puta. Mjerenje se provodi odmah nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se provodi na temperaturi od (37±0,5)°C. U plastičnu epruvetu dodajte 50 μl plazme s nedostatkom faktora VII i 50 μl razrjeđenja standarda ili lijeka. Smjesa se inkubira na (37±0,5)°C 120-240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja 200 μl tromboplastin kalcija prethodno zagrijanog na temperaturu (37±0,5)°C u smjesu. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu varirati u odgovarajućim omjerima.

Kalibracijski graf iscrtava se u polulogaritamskim koordinatama. Na logaritamskoj apscisnoj osi prikazane su vrijednosti aktivnosti faktora VII, a na ordinatnoj osi prikazano je vrijeme zgrušavanja odgovarajućih standardnih razrjeđenja. Aktivnost faktora VII za svako razrjeđenje ispitnog uzorka nalazi se iz kalibracijskog grafikona. aktivnost FVII ( A) u ispitnom uzorku izračunava se pomoću formule:

- aktivnost odgovarajućeg razrjeđenja uzorka za ispitivanje, koja se nalazi iz kalibracijskog grafikona;

k— razrjeđivanje ispitnog uzorka.

1. Kromogena metoda

U prisutnosti tkivnog faktora (TF) i iona Ca 2+ dolazi do aktivacije faktora VII (stvaranje FVIIa). Kompleks FVIIa, TF, Ca 2+ i fosfolipida aktivira faktor X. Aktivirani faktor X (FXa) selektivno cijepa kromogeni supstrat FXa-1 metoksikarbonil-D-cikloheksilalanil-glicil-L-arginin- n nastaje -nitroanilid acetat P-nitroanilin. Uzorak se ispituje fotometrijskom metodom na 405 nm. Vrijednost apsorbancije (ili povećanje apsorbancije) proporcionalna je količini faktora VII.

Određivanje faktora VII kromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test setova. Analiza se provodi u skladu s uputama za pribor. Standardni uzorak i pripravak prethodno su razrijeđeni plazmom s nedostatkom faktora VII do koncentracije od ~ 1 IU/ml (osnovno razrjeđenje). Iz glavnog razrjeđenja pripremaju se 3 razrjeđenja standardnog uzorka i 3 razrjeđenja lijeka s tris-fiziološkim puferom pH 7,3 - 8,0 pomoću puferske otopine uz dodatak 0,1% humanog ili goveđeg albumina. Svako razrjeđenje standardnog uzorka određuje se dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izradu kalibracijskog grafikona. Ispitni uzorci određuju se tri puta.

Razrjeđenja ispitivanog lijeka ili standardnog uzorka dodaju se u jažice mikropločice, dodaju se mješavina kalcija i tromboplastina i otopina faktora X i inkubiraju se na temperaturi od (37 ± 0,5) °C 2 do 5 minuta, nakon čega se dodaje se otopina supstrata kromogenog faktora Xa.

Izmjerite promjenu optičke gustoće na valnoj duljini od 405 nm u kinetičkom načinu rada ili prekinite reakciju hidrolize nakon 3-15 minuta dodavanjem 20% (v/v) otopine ledene octene kiseline i izmjerite optičku gustoću.

FaktorVIII

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora VIII provodi se pomoću ljudske plazme s nedostatkom faktora VIII. Izvor fosfolipida potrebnih za koagulaciju je APTT reagens.

Za razrjeđivanje standarda i lijekova koristi se NaCl-imidazol puferska otopina pH (7,3 ± 0,1), uz dodatak 0,1% otopine ljudskog ili goveđeg albumina. Za konstruiranje kalibracijske krivulje, pripremite niz serijskih razrjeđenja standarda, počevši od koncentracije od 2 IU/ml. Lijek se razrjeđuje do koncentracije od ~ 0,5 – 2 IU/ml. Analizirati 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak, mjerenja vremena zgrušavanja provode se najmanje 2 puta. Mjerenje se provodi unutar 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se provodi na temperaturi od (37±0,5)°C. Dodajte 100 µl plazme s nedostatkom faktora VIII, 100 µl standardnog ili razrijeđenog lijeka i 100 µl APTT reagensa u plastičnu epruvetu i inkubirajte na temperaturi od (37±0,5)°C 2 minute. Vrijeme koagulacije se bilježi od trenutka dodavanja 100 μl 0,025 M otopine kalcijevog klorida prethodno zagrijane na temperaturu od (37 ± 0,5) ° C u smjesu. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu varirati u odgovarajućim omjerima.

Kalibracijski graf iscrtava se u polulogaritamskim koordinatama. Na logaritamskoj apscisnoj osi nanesene su vrijednosti aktivnosti faktora VIII, a na ordinatnoj osi vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora VIII za svako razrjeđenje ispitnog uzorka nalazi se iz kalibracijskog grafikona. aktivnost FVIII ( A) u ispitnom uzorku izračunava se pomoću formule:

— aktivnost odgovarajućeg razrjeđenja ispitivanog lijeka, utvrđena iz kalibracijske krivulje;

k— razrjeđivanje ispitnog uzorka.

1. Kromogena metoda

Kvantitativno određivanje faktora VIII provodi se pomoću seta reagensa u kojem je faktor VIII kofaktor za faktor IXa tijekom aktivacije faktora X u oblik Xa, koji cijepa kromogeni supstrat.

Princip metode

U prisutnosti iona Ca 2+ i fosfolipida dolazi do aktivacije faktora X u Xa pod utjecajem faktora IXa. Uz višak faktora X i optimalne količine Ca 2+, fosfolipida i faktora IXa, brzina aktivacije faktora X linearno ovisi o količini faktora VIII. Faktor Xa hidrolizira kromogeni supstrat S-2765 (N-a-Z-DArg-Gly-Arg-pNA) kako bi se oslobodila kromogena pNA skupina, čija se boja bilježi spektrofotometrijski na 405 nm. Količina proizvedenog faktora Xa, a time i intenzitet bojenja, proporcionalna je aktivnosti faktora VIII u uzorku.

Set reagensa za određivanje aktivnosti faktora VIII stabilan je tijekom vremena koje je odredio proizvođač pri temperaturi skladištenja od 2 do 8 o C.

Komplet reagensa sadrži:

1. 7,7 mg kromogena S-2765 s dodatkom sintetskog inhibitora trombina I-2581. Reagens se rekonstituira u 6,0 ml sterilne vode za injekcije. Rekonstituirana otopina stabilna je 1 mjesec na temperaturama od 2 do 8°C. Prije upotrebe zagrijati na 37°C.
2. Reagens goveđeg faktora: 0,3 U faktora IX, 2,7 IU faktora X i 1 NIH U trombina, liofilizirano u prisutnosti 40 mmol CaCl2 i 0,2 mmol fosfolipida. Reagens se rekonstituira u 2,0 ml sterilne vode za injekcije. Rekonstituirana otopina stabilna je 12 sati na temperaturi od 2 do 8 o C, 2 tjedna na temperaturi od minus 30 o C i 1 mjesec na temperaturi od minus 80 o C. Ne smije se čuvati na temperaturi od minus 20 o C. Prije upotrebe zagrijati na temperaturu od 37 o S.
3. Koncentrat × 10 Tris pufer. Stabilan 1 mjesec na temperaturama od 2 do 8°C. Prije upotrebe razrijediti sterilnom vodom za injekcije u omjeru 1:10.

Dodatni reagensi:

1. Međunarodni referentni standard je otopina koncentrata ljudskog faktora VIII (NIBSC, Eur.Pharm.Ref.Std. BRP H 0920000) ili plazma kalibrirana prema međunarodnom standardu faktora VIII.
2. Kontrolna normalna ili patološka plazma kalibrirana na međunarodni standard faktora VIII.
3. 0,9% otopina natrijeva klorida.
4. 20% octene kiseline ili 2% limunske kiseline (koristi se u tehnici krajnje točke nakupljanja kromogena).
5. Laboratorijska deionizirana voda

Oprema:

1. Plastične epruvete;
2. Mikroploče;
3. Termostat 37 o C;
4. Spektrofotometar 405 nm ili čitač mikroploča 405 nm;
5. Kalibrirane pipete;
6. Vrtlog;
7. Štoperica.

Prije određivanja ispitni uzorak se razrijedi do očekivane aktivnosti od 1 IU/ml.

Određivanje se može provesti kinetičkim načinom i krajnjom točkom, u epruvetama (makro metoda) i u mikropločama (mikro metoda).

Kalibriranje

Tijekom svakog određivanja konstruira se kalibracijska krivulja. Razrjeđenje standardnog uzorka priprema se u 2 stupnja: preliminarno razrjeđivanje do aktivnosti od 1 - 2 IU/ml i konačna razrjeđenja za konstruiranje kalibracijske ovisnosti u rasponu od 0 - 2 IU/ml. Nakon razrjeđivanja, određivanje treba provesti unutar 30 minuta.

Napredak odlučnosti

Određivanje u epruvetama

200 µl razrijeđenog standardnog, kontrolnog ili ispitnog uzorka doda se u epruvete, inkubira se 3-4 minute na temperaturi od 37 o C, doda se 50 µl prethodno zagrijanog reagensa faktora, inkubira se 2-4 minute na temperaturi od 37 o C i doda se 50 µl otopine kromogena.

Određivanje u mikropločicama

Dodajte 50 μl razrijeđenog standardnog, kontrolnog ili ispitnog uzorka u jažice mikropločice, inkubirajte 3-4 minute na 37°C, dodajte 50 μl prethodno zagrijanog reagensa faktora, inkubirajte 2-4 minute na 37 o C i dodajte 50 µl otopine kromogena.

Kinetička metoda određivanja

Nakon dodavanja otopine kromogena 2 - 10 minuta, izmjerite promjenu optičke gustoće otopine na 405 nm.

Definicija prema krajnjoj točki

Nakon dodavanja otopine kromogena, smjesa se nastavlja inkubirati na temperaturi od 37 o C 2 - 10 minuta, nakon čega se dodaje 50 μl 20% octene ili 2% limunske kiseline da se reakcija zaustavi. Izmjerite optičku gustoću otopine prema puferu na 405 nm.

Izračuni

Nacrtajte ovisnost promjene optičke gustoće po minuti (za kinetičku metodu) ili optičke gustoće (za određivanje krajnje točke) razrjeđenja standardne otopine o koncentraciji faktora VIII u njima. Aktivnost u ispitivanom uzorku određuje se pomoću kalibracijske krivulje, uzimajući u obzir prethodno razrjeđivanje uzorka.

FaktorIX

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora IX provodi se pomoću ljudske plazme s nedostatkom faktora IX. Izvor fosfolipida potrebnih za koagulaciju je APTT reagens.

Za razrjeđivanje standarda i lijekova upotrijebite NaCl-imidazolni pufer pH 7,3 uz dodatak 0,1% otopine goveđeg ili humanog albumina. Za konstruiranje kalibracijske krivulje pripremite seriju serijskih razrjeđenja standarda u rasponu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrjeđuje do koncentracije manje od 1 IU/ml. Analizirati 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak, mjerenja vremena zgrušavanja provode se najmanje 2 puta. Mjerenje se provodi unutar 1 sata nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se provodi na temperaturi od (37±0,5)°C. Dodajte 100 µl plazme s nedostatkom faktora IX, 100 µl standardnog ili razrijeđenog lijeka i 100 µl APTT reagensa u plastičnu epruvetu i inkubirajte na temperaturi od (37±0,5)°C 2 minute. Vrijeme koagulacije se bilježi od trenutka dodavanja 100 μl 0,025 M otopine kalcijevog klorida prethodno zagrijane na temperaturu od (37 ± 0,5) °C u smjesu. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu varirati u odgovarajućim omjerima.

Kalibracijski graf iscrtava se u polulogaritamskim koordinatama. Na logaritamskoj apscisnoj osi prikazane su vrijednosti aktivnosti faktora IX, a na ordinatnoj osi prikazano je vrijeme zgrušavanja odgovarajućih standardnih razrjeđenja. Aktivnost faktora IX za svako razrjeđenje ispitnog uzorka nalazi se iz kalibracijskog grafikona. POPRAVAK aktivnosti ( A) u ispitnom uzorku izračunava se pomoću formule:

- aktivnost odgovarajućeg razrjeđenja uzorka za ispitivanje, koja se nalazi iz kalibracijskog grafikona;

k— razrjeđivanje ispitnog uzorka.

Faktorx

1. Metoda zgrušavanja

Određivanje aktivnosti faktora X provodi se pomoću ljudske plazme s nedostatkom faktora X. Proces koagulacije se aktivira dodavanjem tromboplastina u smjesu kalcija.

Za razrjeđivanje standarda i lijekova upotrijebite NaCl-imidazol pufersku otopinu pH 7,3 uz dodatak 0,1% otopine ljudskog ili goveđeg albumina. Za konstruiranje kalibracijske krivulje pripremite seriju serijskih razrjeđenja standarda faktora X u rasponu od 0,3 do 1 IU/ml. Lijek se razrjeđuje do koncentracije manje od 1 IU/ml. Analizirati 3 razrjeđenja lijeka. Za svaki uzorak, mjerenja vremena zgrušavanja provode se najmanje 2 puta. Mjerenje se provodi odmah nakon razrjeđivanja lijeka.

Analiza se provodi na temperaturi od (37±0,5)°C. U plastičnu epruvetu dodajte 50 μl plazme s nedostatkom faktora X i 50 μl razrjeđenja standarda ili lijeka. Smjesa se inkubira na (37±0,5)°C 120-240 s. Vrijeme zgrušavanja se određuje od trenutka dodavanja 200 μl tromboplastin kalcija prethodno zagrijanog na temperaturu (37±0,5)°C u smjesu. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu varirati u odgovarajućim omjerima.

Kalibracijski graf iscrtava se u polulogaritamskim koordinatama. Na logaritamskoj apscisnoj osi prikazane su vrijednosti aktivnosti faktora X , duž y-osi je vrijeme zgrušavanja odgovarajućih razrjeđenja standarda. Aktivnost faktora X za svako razrjeđenje ispitnog uzorka nalazi se iz kalibracijskog grafikona. Aktivnost faktora X ( A) u ispitnom uzorku izračunava se pomoću formule:

- aktivnost odgovarajućeg razrjeđenja uzorka za ispitivanje, koja se nalazi iz kalibracijskog grafikona;

k— razrjeđivanje ispitnog uzorka.

1. Kromogena metoda

Faktor X se aktivira pomoću FX aktivatora dobivenog iz zmijskog otrova. Aktivirani faktor X (FXa) selektivno cijepa kromogeni supstrat FXa-1 N-α-benziloksikarbonil-D-arginil-L-glicil-L-arginin-4-nitroanilid dihidroklorid, N-benzoil-L-izoleucil-L-glutamil-glicil - L-arginin-4-nitroanilid hidroklorid, metansulfonil-D-leucil-glicil-L-arginin-4-nitroanilid, metoksikarbonil-D-cikloheksilalanil-glicil-L-arginin-4-nitroanilid acetat da se formira P-nitroanilin. Uzorci se ispituju fotometrijski na 405 nm. Količina faktora X proporcionalna je porastu optičke gustoće otopine.

Određivanje faktora X kromogenom metodom provodi se pomoću posebnih test setova. Analiza se provodi u skladu s uputama za pribor. Standardni uzorak i pripravak prethodno su razrijeđeni plazmom s nedostatkom faktora X do koncentracije od ~ 1 IU/ml (osnovno razrjeđenje). Od glavnog razrjeđenja pripremaju se 3 razrjeđenja standardnog uzorka (prema uputama) i 3 razrjeđenja lijeka pomoću puferske otopine. Svako razrjeđenje standardnog uzorka određuje se dva puta, a dobivene vrijednosti se koriste za izradu kalibracijskog grafikona. Ispitni uzorci određuju se tri puta.

Testovi se provode ručno pomoću plastičnih epruveta ili mikropločica na temperaturi od (37±0,5)°C ili automatski pomoću koagulometra.

Za provođenje ručnog testiranja, 12,5 μl svakog razrjeđenja ispitivanog lijeka ili standardnog uzorka dodaje se u jažice mikropločice, 25 μl specifičnog aktivatora faktora X iz otrova Russellovog poskoka dodaje se u svaku jažicu i inkubira na temperaturi od (37 ± 0,5) °C tijekom 90 s, nakon čega se u svaku jažicu doda 150 μl radnog razrjeđenja supstrata kromogenog faktora X.

Odredite brzinu promjene optičke gustoće na valnoj duljini od 405 nm neprekidno tijekom 3 minute i izračunajte prosječnu brzinu promjene optičke gustoće (∆ A/min) ili izmjerite apsorbanciju na valnoj duljini od 405 nm u uzastopnim vremenskim intervalima (na primjer, nakon 30 s) i nacrtajte apsorbanciju u odnosu na vrijeme i izračunajte ∆ A/min kao kut nagiba pravca. Iz vrijednosti ∆ A/min svakog pojedinačnog razrjeđenja standardnog uzorka i ispitivanog lijeka, izračunava se aktivnost ispitivanog lijeka.

von Willebrandov faktor

Određivanje aktivnosti von Willebrandovog faktora provodi se aglutinacijom ili enzimskim imunotestom.

Aktivnost von Willebrandovog faktora određuje se usporedbom njegove aktivnosti s aktivnošću standardnog uzorka.

Metoda aglutinacije

Metoda se temelji na određivanju aktivnosti koenzima von Willebrandovog faktora tijekom aglutinacije suspenzije trombocita u prisutnosti ristocetina A.

Test se može provesti kvantitativno pomoću automatizirane opreme ili polukvantitativno vizualnom procjenom aglutinacije u nizu razrjeđenja.

Polukvantitativna metoda

Iz standardnog uzorka i rekonstituirane otopine lijeka pripremaju se uzastopna razrjeđenja u 0,9% otopini natrijeva klorida s 1–5% otopinom humanog albumina do očekivanog sadržaja von Willebrandovog faktora od 0,5, 1,0 i 2,0 IU/ml. 0,05 ml svakog razrjeđenja standardnog uzorka i ispitivanog lijeka nanese se na predmetno staklo, doda se 0,1 ml suspenzije trombocita s ristocetinom i miješa 1 minutu. Otopina za razrjeđivanje koristi se kao negativna kontrola. Nakon 1 minute inkubacije na sobnoj temperaturi vizualno se procjenjuje aglutinacija trombocita. Maksimalno razrjeđenje pri kojem dolazi do aglutinacije trombocita titar je aktivnosti koenzima ristocetina uzorka.

Kvantitativna metoda

Pripremite najmanje 2 serije serijskih razrjeđenja standarda i ispitnih uzoraka pomoću pufera za razrjeđivanje do očekivanog sadržaja VWF od 0,5, 1,0 i 2,0 IU/ml.

Određivanje se provodi u skladu s uputama proizvođača automatizirane opreme. Dobivena je ovisnost promjene optičke apsorpcije (stupnja zamućenja otopine) o aktivnosti von Willebrandovog faktora.

Određivanje sadržaja von Willebrandovog faktora u pripravku za ispitivanje provodi se pomoću koeficijenata linearne jednadžbe ovisnosti optičke gustoće otopine o sadržaju von Willebrandovog faktora u standardnom uzorku.

Imunoenzimska metoda

Metoda se temelji na određivanju aktivnosti vezanja kolagena von Willebrandovog faktora. Kada se VWF specifično veže na kolagene fibrile i naknadno vezanje poliklonalnih protutijela na VWF konjugiranih na enzim nakon dodavanja kromogenog supstrata, formira se kromofor koji se može kvantificirati spektrofotometrijski. Postoji linearni odnos između vezanja kolagena na von Willebrandov faktor i optičke gustoće.

Određivanje se provodi pomoću testnih sustava odobrenih za uporabu u ruskoj zdravstvenoj praksi u skladu s uputama za uporabu.

Za testiranje pripremite najmanje 3 serijska razrjeđenja standarda i uzoraka za ispitivanje pomoću pufera za razrjeđivanje do očekivanog sadržaja von Willebrandovog faktora od 1,0 IU/ml. Zatim se provode ispitivanja u skladu s uputama proizvođača korištenog ispitnog sustava.

Aktivirani faktori zgrušavanja krv

Određivanje se provodi metodom koagulometra.

Za ispitivanje se priprema rekonstituirana otopina lijeka. Ako je u pripravku prisutan heparin, neutralizira se dodavanjem protamin sulfata brzinom od 10 μg protamin sulfata na 1 IU heparina. Pripremite razrjeđenja lijeka 1:10 i 1:100 koristeći Tris-puferiranu otopinu pH 7,5.

U 3 epruvete doda se 0,1 ml standardne ljudske plazme i 0,1 ml otopine fosfolipida, stavi se u vodenu kupelj na temperaturi od (37±0,5) °C 60 s, nakon čega se u prvu epruvetu doda 0,1 ml Tris-pufer otopina (kontrolni uzorak), u drugu 0,1 ml ispitivanog lijeka u razrjeđenju 1:10, u treću epruvetu 0,1 ml ispitivanog lijeka u razrjeđenju 1:100. Zatim se u sadržaj svake epruvete odmah doda 0,1 ml otopine kalcijevog klorida od 3,7 g/l zagrijane na temperaturu od 37 o C. Bilježi se vrijeme nastanka ugruška od trenutka dodavanja otopine kalcijevog klorida.

Kriterij za prihvatljivost rezultata je vrijeme koagulacije u kontrolnom uzorku u rasponu od 200 do 350 s.

Specifična specifična djelatnost

Specifična aktivnost faktora zgrušavanja izračunava se po formuli:

Određivanje aktivnosti antitrombinaIII

Kromogena metoda

Metoda za određivanje aktivnosti ATIII temelji se na njegovoj sposobnosti neutralizacije trombina u prisutnosti heparina. Suvišne količine heparina i trombina dodaju se uzorku koji sadrži ATIII. Nastali kompleks ATIII-heparin neutralizira količinu trombina proporcionalnu količini ATIII. Preostali trombin selektivno cijepa kromogeni supstrat i nastaje P-nitroanilin, čija se apsorpcija određuje na 405 nm. Dakle, količina ATIII je obrnuto proporcionalna količini slobodne apsorpcije P-nitroanilin u uzorku.

Određivanje aktivnosti ATIII provodi se pomoću komercijalnih testnih sustava. Za izradu kalibracijske krivulje upotrijebite standardni uzorak ATIII ili plazma kalibrator certificiran prema međunarodnom standardu. Standardni uzorak ili plazma kalibrator otopi se u destiliranoj vodi prema uputama u uputama. Ovisnost optičke gustoće o aktivnosti ATIII je linearna u rasponu aktivnosti ATIII od 0,1 do 1,0 IU/ml. Koristeći heparinski pufer, pripremite 4 razrjeđenja standardnog uzorka ili plazme kalibratora s ATIII aktivnošću od 0,1 do 1,0 IU/ml. Analiza se provodi na temperaturi od 37°C prema shemi danoj u uputama za kit. Za svako razrjeđenje, vrijednost optičke gustoće na 405 nm određena je tri puta i konstruiran je kalibracijski grafikon ovisnosti apsorbancije o aktivnosti ATIII u linearnim koordinatama.

Pripremite 2 razrjeđenja ispitnog uzorka s približnom aktivnošću ATIII manjom od 1,0 IU/ml. Određivanje aktivnosti ATIII u ispitivanim uzorcima provodi se na temperaturi od 37°C prema uputama u uputama za kit. Aktivnost ATIII u ispitnim razrjeđenjima određena je iz kalibracijske krivulje. Aktivnost ATIII u ispitnom uzorku određena je kao:

A x– aktivnost ATIII u odgovarajućem razrjeđenju;

k– razrjeđivanje uzorka.

Kvantitativno određivanje heparina

1. Metoda zgrušavanja

Metoda se temelji na sposobnosti heparina da produži vrijeme zgrušavanja normalne plazme inhibicijom niza čimbenika.

Za provođenje analize koristi se normalna ljudska plazma, standardni uzorak heparina, PTT reagens i 0,025 M otopina kalcijevog klorida. Kao razrjeđivač standardnih i ispitnih uzoraka koristi se 0,9% otopina natrijeva klorida. Standardni uzorak heparina otopi se u destiliranoj vodi prema uputama u uputama. Pripremite 3 razrjeđenja standardnog uzorka s aktivnošću heparina od 0,3, 0,4 i 0,5 IU/ml. Standardni uzorci s ovim aktivnostima trebali bi produžiti vrijeme zgrušavanja normalne plazme za najmanje 1,5 puta, inače bi se trebala koristiti razrjeđenja s većom aktivnošću heparina. Paralelno se pripremaju 3 razrjeđenja ispitnog uzorka tako da približna aktivnost heparina u tim razrjeđenjima bude unutar raspona aktivnosti heparina u razrjeđenjima standardnog uzorka.

Analiza se provodi automatskim ili poluautomatskim koagulometrom u plastičnim epruvetama na temperaturi od 37°C. U epruvetu dodajte 100 μl normalne ljudske plazme, 100 μl razrijeđenog standardnog ili ispitnog uzorka ili 100 μl 0,9% otopine natrijeva klorida (slijepi pokus), dodajte 100 μl reagensa APTT i inkubirajte smjesu 120–240 s na temperaturi ( 37±0,1)°S. Zatim se u epruvetu doda 100 μl 0,025 M otopine kalcijevog klorida prethodno zagrijane na temperaturu od 37°C i zabilježi se vrijeme zgrušavanja uzorka. Ovisno o tehnici analize, volumeni reagensa mogu se mijenjati u skladu s omjerima. Vrijeme zgrušavanja normalne plazme (slijepi pokus) trebalo bi biti 25 – 40 s. Za svako razrjeđenje standardnog i ispitnog uzorka vrijeme zgrušavanja određuje se tri puta.

1. Kromogena metoda

Metoda se temelji na cijepanju kromogenog supstrata specifičnog za aktivirani faktor X (FXa). Kada se višak ATIII i FXa doda uzorku koji sadrži heparin, inhibira se količina FXa proporcionalna količini heparina. Preostali FXa se cijepa od specifičnog kromogenog supstrata P-nitroanilin, čija se apsorpcija određuje na 405 nm. Dakle, količina apsorpcije je obrnuto proporcionalna količini heparina. Ovom se metodom određuje sadržaj i nefrakcioniranog i niskomolekularnog heparina u anti-Xa jedinicama.

Količina heparina određuje se kromogenom metodom pomoću komercijalnih test sustava. Za izradu kalibracijskog grafikona upotrijebite standardni uzorak heparina ili kalibrator plazme certificiran u skladu s međunarodnim standardom. Standardni uzorak ili plazma kalibrator razrijedi se u destiliranoj vodi prema uputama. Pripremite 4 razrjeđenja standardnog uzorka s koncentracijom heparina manjom od 1 anti-Xa jedinice/ml koristeći pufer za razrjeđivanje pH 8,4. Analiza se provodi na temperaturi od 37°C u skladu s uputama za kit. Za svako razrjeđenje tri puta se odredi apsorbancija na 405 nm, nakon čega se konstruira kalibracijski grafikon ovisnosti vrijednosti apsorbancije o koncentraciji heparina u linearnim koordinatama. Ovisnost je linearna u rasponu koncentracije heparina 0 – 1,0 anti-Xa jedinica/ml.

Za ispitni uzorak pripremite 2 razrjeđenja s koncentracijom heparina manjom od 1 anti-Xa jedinice/ml. Analiza se provodi prema uputama za kit na temperaturi od 37°C. Za svako razrjeđenje vrijednost apsorpcije određuje se tri puta.

Određivanje se provodi ručno pomoću plastičnih epruveta, mikropločica ili automatski pomoću koagulometra.

Za provođenje ručnog testiranja, 20 μl standardne ljudske plazme i 20 μl otopine antitrombina III dodaje se u jažice mikropločice. Zatim se u te jažice doda 20, 60, 100 i 140 µl ispitivanog ili standardnog lijeka, a volumen otopine u svakoj jažici se podesi na 200 µl puferom (aktivnost heparina u konačnoj reakcijskoj smjesi je 0,02 - 0,08 IU/ml).

40 μl iz svake jažice ploče prenese se u drugu seriju jažica, u koje se doda 20 μl otopine goveđeg faktora Xa i inkubira na temperaturi od (37 ± 0,5) °C 30 s, nakon čega se doda 40 μl otopina se dodaje u jažice kromogenog supstrata faktora Xa i ponovno se inkubira na temperaturi od (37 ± 0,5) °C tijekom 3 – 15 minuta, mjereći brzinu cijepanja supstrata kontinuiranim mjerenjem optičke gustoće na valnoj duljini od 405 nm (kinetička načinu) ili nakon zaustavljanja reakcije dodavanjem 20% (v/v) otopine ledene octene kiseline (krajnja točka određivanja).

Pri provođenju studija u automatskom načinu rada pomoću koagulometra dobiva se ovisnost promjene optičke gustoće o koncentraciji heparina.

Razina faktora zgrušavanja krvi VIII od 0 do 1% uzrokuje izrazito težak oblik bolesti, od 1 do 2% - težak, od 2 do 5% - umjeren, iznad 5% - blagi oblik, ali s rizikom od teška i čak smrtonosna krvarenja od ozljeda i kirurških intervencija.

Među svim mogućim manifestacijama hemofilije na prvom mjestu su krvarenja u velikim zglobovima ekstremiteta (kuku, koljenu, skočnom zglobu, ramenu i laktu), duboka potkožna, međumišićna i intramuskularna krvarenja, obilna i dugotrajna krvarenja uslijed ozljeda, te pojava krvi u mokraći. Ostala krvarenja su nešto rjeđa, uključujući i ona teška i opasna kao što su retroperitonealna krvarenja, krvarenja u trbušnim organima, gastrointestinalna krvarenja, intrakranijalna krvarenja (moždani udar).

Kod hemofilije možete prilično jasno pratiti progresiju svih manifestacija bolesti kako dijete raste, a zatim i odrasla osoba. Pri rođenju se mogu uočiti manje ili više opsežna krvarenja ispod periosta kostiju lubanje, potkožna i intradermalna krvarenja te kasno krvarenje iz pupkovine. Ponekad se bolest otkrije već prvom intramuskularnom injekcijom, što može uzrokovati veliki, po život opasni intermuskularni hematom. Nicanje zuba često je popraćeno ne baš jakim krvarenjem. U prvim godinama života često dolazi do krvarenja iz oralne sluznice povezanog s ozljedama raznim oštrim predmetima. Kad dijete uči hodati, padovi i modrice često su praćeni teškim krvarenjem iz nosa i modricama na glavi. Krvarenja u orbiti, kao i postorbitalni hematomi, mogu dovesti do gubitka vida. U djeteta koje je počelo puzati tipična su krvarenja u području stražnjice. Tada do izražaja dolaze krvarenja u velikim zglobovima udova. Javljaju se ranije, što je hemofilija teža. Prva krvarenja predisponiraju ponovno krvarenje u iste zglobove. U svake pojedine osobe koja boluje od hemofilije, 1-3 zgloba su zahvaćena posebno uporno i često krvarenjima. Najčešće zahvaćeni zglobovi su koljena, zatim gležnjevi, laktovi i kukovi. Relativno su rijetka krvarenja u male zglobove šaka i stopala (manje od 1% svih lezija) i zglobove između kralježaka. U svake osobe, ovisno o dobi i težini bolesti, zahvaćeno je od 1-2 do 8-12 zglobova.

Potrebno je razlikovati akutnu hemartrozu (primarnu i rekurentnu), kroničnu hemoragijsko-destruktivnu osteoartrozu (artropatiju) i sekundarni imunološki reumatoidni sindrom kao komplikaciju glavnog procesa.

Akutna hemartroza manifestira se kao iznenadna pojava (često nakon manje ozljede) ili naglo pojačana bol u zglobu. Zglob je često povećan, koža iznad njega je crvena i vruća na dodir. Nakon prve transfuzije krvnih sastojaka bol brzo (unutar nekoliko sati) slabi, a uz istodobno uklanjanje krvi iz zgloba gotovo odmah nestaje.

Razlikuju se IV stupnjevi oštećenja zglobova. U stadiju I, ili ranom stadiju, volumen zgloba može biti povećan kao posljedica krvarenja. U "hladnom" razdoblju funkcija zgloba nije poremećena, ali rendgenski pregled otkriva karakteristične znakove lezije. U fazi II primjećuje se progresija procesa, što se otkriva rendgenskim podacima. U stadiju III zglob se naglo povećava u veličini, deformira se, često je neravan i neravan na dodir, a utvrđuje se izraženo trošenje mišića zahvaćene noge. Pokretljivost zahvaćenih zglobova je više ili manje ograničena, što je povezano kako s oštećenjem samog zgloba tako i s promjenama na mišićima i tetivama. U ovoj fazi se razvija teška osteoporoza, a unutar zglobova lako dolazi do prijeloma. U femuru se primjećuje kratersko ili tunelsko razaranje koštane supstance, tipično za hemofiliju. Patela je djelomično uništena. Intraartikularne hrskavice su uništene, a pokretni fragmenti tih hrskavica nalaze se u zglobnoj šupljini. Moguće su različite vrste subluksacija i pomaka kostiju. U IV stadiju funkcija zgloba je gotovo potpuno izgubljena. Mogući su prijelomi unutar zglobova. S godinama, težina i prevalencija oštećenja zglobnog aparata napreduje i postaje sve izraženija kada se oko patološki promijenjenih zglobova pojave hematomi.

Sekundarni reumatoidni sindrom (Barkagan-Egorov sindrom) čest je oblik oštećenja zglobova u bolesnika s hemofilijom. Ovaj sindrom je prvi put opisan 1969. U mnogim slučajevima, liječnici ga zanemaruju, jer se javlja u pozadini postojeće hemartroze i destruktivnih procesa u zglobovima karakterističnih za hemofiliju. Sekundarni reumatoidni sindrom prati kronični upalni proces (često simetričan) u malim zglobovima šaka i stopala, koji prethodno nisu bili zahvaćeni krvarenjima. Naknadno, kako proces napreduje, ovi zglobovi prolaze kroz tipičnu deformaciju. Povremeno se javlja jaka bol u velikim zglobovima, može se primijetiti jaka jutarnja ukočenost zglobova. Bez obzira na pojavu novih krvarenja, zglobni proces stalno napreduje. U ovom trenutku krvni test otkriva pojavu ili oštro povećanje postojećih laboratorijskih znakova upalnog procesa, uključujući i imunološke.

Kod većine osoba s hemofilijom sindrom se javlja u dobi od 10-14 godina. Do dobi od 20 godina, njegova učestalost doseže 5,9%, a do 30 - do 13% svih slučajeva bolesti. S godinama, učestalost i težina svih lezija zglobova stalno napreduje, što dovodi do invaliditeta i prisiljava na korištenje štaka, invalidskih kolica i drugih pomagala. Progresija oštećenja zglobova ovisi o učestalosti akutnih krvarenja, pravodobnosti i potpunosti njihovog liječenja (vrlo je važna rana transfuzija krvi i njezinih sastojaka), kvaliteti ortopedske skrbi, pravilnoj primjeni fizikalne terapije, fizioterapeutskim i balneološkim učincima. , izbor zanimanja i niz drugih okolnosti. Trenutačno su sva ova pitanja iznimno relevantna, budući da se očekivani životni vijek za hemofiliju naglo povećao zbog uspjeha korektivnog liječenja.

Opsežni i intenzivni potkožni, intermuskularni, subfascijalni i retroperitonealni hematomi vrlo su ozbiljni i opasni. Postupno rastući, mogu doseći ogromne veličine, sadržavati od 0,5 do 3 litre krvi ili više, dovesti do razvoja anemije, uzrokovati kompresiju i uništavanje okolnih tkiva i krvnih žila koje ih hrane, nekrozu. Na primjer, retroperitonealni hematomi često potpuno uništavaju velika područja zdjeličnih kostiju (promjer zone uništenja može doseći 15 cm ili više), hematomi na nogama i rukama uništavaju cjevaste kosti i petnu kost. Smrt koštanog tkiva dovodi do stvaranja krvarenja ispod periosta. Proces takve destrukcije kosti na radiografiji se često pogrešno smatra tumorskim procesom. Često se kalcijeve soli talože u hematomima, što ponekad dovodi do stvaranja novih kostiju koje mogu zatvoriti zglobove i potpuno ih imobilizirati.

Mnogi hematomi, vršeći pritisak na živčana debla ili mišiće, uzrokuju paralizu, senzorne poremećaje i brzo progresivnu atrofiju mišića. Posebno su opasna opsežna krvarenja u mekim tkivima submandibularne regije, vrata, ždrijela i ždrijela. Ova krvarenja uzrokuju sužavanje gornjeg dišnog trakta i gušenje.

Ozbiljan problem kod hemofilije uzrokuje teško i dugotrajno bubrežno krvarenje koje se opaža kod 14-30% osoba s ovom bolešću krvi. Ova krvarenja mogu se pojaviti i spontano iu vezi s ozljedama lumbalne regije, popratnim pijelonefritisom. Osim toga, može doći do bubrežnog krvarenja zbog povećanog izlučivanja kalcija u mokraći zbog razaranja kostiju kod hemofilije. Pojavu ili pojačanje takvog krvarenja može pospješiti primjena analgetika (acetilsalicilna kiselina i dr.), masivne transfuzije krvi i plazme, što dovodi do dodatnog oštećenja bubrega. Bubrežnom krvarenju često prethodi dugotrajno izlučivanje čestica krvi u mokraći, što se može otkriti samo laboratorijskim pretragama.

Pojava krvi u mokraći često je praćena teškim poremećajima mokrenja, kao i promjenom količine izlučenog urina (može doći do povećanja ili smanjenja njegovog dnevnog volumena), napadaja bubrežne kolike uzrokovane stvaranjem krvi ugrušci u urinarnom traktu. Ovi fenomeni su posebno intenzivni i izraženi tijekom liječenja, kada se privremeno uspostavi normalno stanje krvi. Prestanku izlučivanja krvi u urinu često prethodi bubrežna kolika, a često i privremeni izostanak izlučivanja urina uz pojavu znakova intoksikacije organizma toksičnim produktima metabolizma.

Povremeno se ponavlja bubrežno krvarenje, što tijekom godina može dovesti do teških distrofično-destruktivnih promjena u ovom organu, sekundarne infekcije i smrti od razvoja zatajenja bubrega.

Gastrointestinalna krvarenja kod hemofilije mogu biti spontana, ali su češće uzrokovana uzimanjem acetilsalicilne kiseline (aspirin), butadiona i drugih lijekova. Drugi izvor krvarenja su očiti ili skriveni ulkusi želuca ili dvanaesnika, kao i erozivni gastritis različitog podrijetla. Međutim, ponekad se uočava difuzno kapilarno krvarenje bez ikakvih destruktivnih promjena na sluznici. Ta se krvarenja nazivaju dijapedetskim. Kada se pojave, stijenka crijeva je zasićena krvlju na velikom području, što brzo dovodi do kome kao posljedica teške anemije, nesvjestice zbog naglog pada krvnog tlaka i smrti. Mehanizam razvoja takvog krvarenja do danas ostaje nejasan.

Krvarenja u trbušnim organima imitiraju razne akutne kirurške bolesti - akutni apendicitis, crijevnu opstrukciju i dr.

Krvarenja u mozgu, leđnoj moždini i njihovim ovojnicama kod hemofilije gotovo su uvijek povezana ili s ozljedom ili s uzimanjem lijekova koji oštećuju funkciju trombocita koji izravno sudjeluju u zgrušavanju krvi. Između trenutka ozljede i razvoja krvarenja može postojati lagani interval u trajanju od 1 do 2 sata do jednog dana.

Karakteristična značajka hemofilije je dugotrajno krvarenje tijekom ozljeda i operacija. Razderane rane mnogo su opasnije od linearnih puknuća. Krvarenje se često ne javlja odmah nakon ozljede, već nakon 1-5 sati.

Uklanjanje krajnika kod hemofilije puno je opasnije od operacije abdomena.

Uklanjanje zuba, osobito kutnjaka, često je popraćeno višednevnim krvarenjem ne samo iz zubnih utičnica, već i iz hematoma nastalih na mjestu infiltracije tkiva novokainom, što dovodi do razvoja anemije. Ovi hematomi uzrokuju destrukciju čeljusti. U slučaju hemofilije zubi se vade pod utjecajem antihemofiličkih lijekova u općoj anesteziji. Bolje je ukloniti nekoliko zuba odjednom.

Neke komplikacije kod hemofilije uzrokovane su gubitkom krvi, kompresijom i razaranjem tkiva hematomima te infekcijom hematoma. Velika skupina komplikacija također je povezana s imunološkim poremećajima. Najopasniji od njih je pojava u krvi velikih količina imunoloških inhibitora ("blokatora") faktora zgrušavanja krvi VIII (ili IX), pretvarajući hemofiliju u tzv. inhibitorni oblik, u kojem je glavna metoda liječenja transfuzijska terapija (transfuzija krvi ili njezinih komponenti) - gotovo potpuno gubi svoju učinkovitost. Štoviše, ponovljena primjena antihemofilnih lijekova često uzrokuje nagli porast količine inhibitora u krvi, zbog čega transfuzije krvi i njezinih komponenti, koje su u početku davale određeni učinak, ubrzo postaju beskorisne. Učestalost inhibitornog oblika hemofilije, prema različitim autorima, kreće se od 1 do 20%, češće od 5 do 15%. Kod inhibicijskih oblika osjetno je poremećena funkcija trombocita, češća su krvarenja u zglobovima i izlučivanje krvi mokraćom, a oštećenje zglobova znatno je veće.

Glavna metoda liječenja i prevencije krvarenja i krvarenja bilo kojeg mjesta i bilo kojeg podrijetla kod hemofilije je intravenska primjena dovoljnih doza krvnih pripravaka koji sadrže faktor VIII. Faktor VIII je varijabilan i praktički se ne zadržava u konzerviranoj krvi, prirodnoj i osušenoj plazmi. Za nadomjesno liječenje prikladne su samo izravne transfuzije krvi davatelja i krvni pripravci s očuvanim faktorom koagulacije VIII. Izravnim transfuzijama krvi davatelja pribjegava se samo kada liječnik nema drugih antihemofilnih lijekova. Velika je greška transfuzirati krv od majke, jer je ona prijenosnik bolesti, a razina faktora VIII u njezinoj krvi naglo je smanjena. Zbog kratkog vijeka trajanja faktora VIII u krvi primatelja (oko 6-8 sati), transfuzije krvi, kao i transfuzije antihemofilne plazme, moraju se ponavljati najmanje 3 puta dnevno. Takve transfuzije krvi i plazme nisu prikladne za zaustavljanje masivnih krvarenja i pouzdano pokrivanje raznih kirurških intervencija.

Jednak volumen antihemofilne plazme otprilike je 3-4 puta učinkovitiji od svježe konzervirane krvi. Dnevna doza od 30-50 ml/kg tjelesne težine antihemofilne plazme omogućuje održavanje razine faktora VIII od 10-15% neko vrijeme. Glavna opasnost takvog liječenja je volumensko preopterećenje krvotoka, što može dovesti do razvoja plućnog edema. Primjena antihemofilne plazme u koncentriranom obliku ne mijenja situaciju, jer visoka koncentracija ubrizganog proteina uzrokuje intenzivno kretanje tekućine iz tkiva u krv, zbog čega se volumen cirkulirajuće krvi povećava na isti način kao i uz infuziju plazme u normalnom razrjeđenju. Koncentrirana suha antihemofilna plazma ima samo tu prednost što sadrži više koncentriranog faktora VIII zgrušavanja krvi, te se u malom volumenu brže unosi u krvotok. Suha antihemofilna plazma se prije upotrebe razrijedi destiliranom vodom. Liječenje antihemofilnom plazmom sasvim je dovoljno za zaustavljanje većine akutnih krvarenja u zglobovima (osim najtežih), kao i za prevenciju i liječenje manjih krvarenja.

Najpouzdaniji i najučinkovitiji za hemofiliju su koncentrati faktora VIII za zgrušavanje krvi. Najpristupačniji od njih je krioprecipitat. To je proteinski koncentrat izoliran iz plazme hlađenjem (krioprecipitacijom) koji sadrži dovoljne količine faktora zgrušavanja, ali malo proteina. Nizak sadržaj proteina omogućuje primjenu lijeka u krvotok u vrlo velikim količinama i povećanje koncentracije faktora VIII na 100% ili više, bez straha od preopterećenja cirkulacije i plućnog edema. Krioprecipitat se mora čuvati na -20 °C, što otežava njegov transport. Kada se odmrzne, lijek brzo gubi svoju aktivnost. Suhi krioprecipitat i moderni koncentrati faktora zgrušavanja krvi VIII nemaju te nedostatke. Mogu se čuvati u običnom hladnjaku. Prekomjerna primjena krioprecipitata je nepoželjna, jer stvara visoku koncentraciju čimbenika zgrušavanja u krvi, zbog čega dolazi do poremećaja mikrocirkulacije u organima i opasnosti od stvaranja krvnih ugrušaka i razvoja sindroma diseminirane intravaskularne koagulacije.

Svi antihemofilici daju se intravenski samo u mlazu, u što koncentriranijem obliku i što je moguće brže nakon ponovnog konzerviranja bez miješanja s drugim otopinama za intravenoznu primjenu. Jedan od glavnih razloga neuspjeha nadomjesne terapije je primjena krvnih pripravaka kapanjem, koja ne dovodi do povećanja razine faktora koagulacije VIII u plazmi. Sve dok se krvarenje trajno ne zaustavi, ne smiju se koristiti krvni nadomjesci i krvni pripravci koji ne sadrže antihemofilne čimbenike, jer to dovodi do razrjeđenja faktora VIII i smanjenja njegove koncentracije u serumu.

U slučaju akutnih krvarenja u zglobovima potrebna je privremena (ne dulje od 3-5 dana) imobilizacija (imobilizacija) oboljelog ekstremiteta u fiziološkom položaju, zagrijavanje oboljelog zgloba (kompresije), ali ne i hlađenje. Rano uklanjanje izlivene krvi u zglob ne samo da odmah uklanja bol i sprječava daljnje zgrušavanje krvi u zglobu, već također smanjuje opasnost od razvoja i brzog napredovanja osteoartritisa. Za prevenciju i liječenje sekundarnih upalnih promjena nakon vađenja krvi u zglobnu šupljinu ubrizgava se 40-60 mg hidrokortizona. Održavanje transfuzijske terapije, koja se provodi tijekom prvih 3-6 dana, sprječava daljnje krvarenje i omogućuje rano započinjanje vježbi fizikalne terapije, što doprinosi bržem i potpunijem obnavljanju funkcije zahvaćenog ekstremiteta i sprječava atrofiju mišića. Bolje je razvijati pokrete u zahvaćenom zglobu u fazama. U prvih 5-7 dana nakon uklanjanja zavoja, aktivni pokreti se izvode kako u zahvaćenom zglobu tako iu drugim zglobovima ekstremiteta, postupno povećavajući učestalost i trajanje vježbi. Od 6.-9. dana prelaze na vježbe "opterećenja", korištenjem biciklističkih ergometara, pedalnih vrata za ruke i elastične vuče. Od 11. do 13. dana, kako bi se uklonila zaostala ukočenost i ograničenja maksimalne fleksije ili ekstenzije, vježbe pasivnog opterećenja izvode se s oprezom. Istodobno, od 5-7 dana, propisan je fizioterapeutski tretman - hidrokortizonska elektroforeza, anodna galvanizacija.

Kod krvarenja u mekim tkivima liječenje antihemofilnim lijekovima je intenzivnije nego kod krvarenja u zglobovima. Ako se razvije anemija, dodatno se propisuju intravenske infuzije crvenih krvnih stanica. Ako se pojave znakovi infekcije hematoma, odmah se propisuju antibiotici širokog spektra. Bilo kakve intramuskularne injekcije za hemofiliju su kontraindicirane, jer mogu uzrokovati opsežne hematome i pseudotumore. Penicilin i njegovi polusintetski analozi također su nepoželjni, jer u velikim dozama povećavaju krvarenje.

Rano i intenzivno liječenje antihemofilnim lijekovima pridonosi brzom obrnutom razvoju hematoma. Nastali hematomi uklanjaju se, ako je moguće, kirurški zajedno s kapsulom.

Vanjska krvarenja iz oštećene kože, krvarenja iz nosa i krvarenja iz rana u usnoj šupljini zaustavljaju se kako transfuzijskom terapijom, tako i lokalnim utjecajima - tretiranjem mjesta krvarenja lijekovima koji pospješuju zgrušavanje krvi. Osim toga, ovi se lijekovi mogu uzimati i oralno. Na rane se stavljaju zavoji pod pritiskom ili šavovi. Na isti način se zaustavlja i krvarenje nakon vađenja zuba. Kod vađenja žvačnih zuba provodi se nešto intenzivnija transfuzijska terapija, a istovremeno vađenje više zuba (3-5 ili više) zahtijeva davanje antihemofilnih lijekova u prva 3 dana.

U slučaju krvarenja iz nosa treba izbjegavati čvrstu tamponadu jer se nakon vađenja tampona krvarenje često još jače nastavi. Brzo zaustavljanje krvarenja iz nosa obično se osigurava antihemofilnom plazmom i antihemofilnim lijekovima uz istodobno ispiranje nosne sluznice otopinama koje pospješuju zgrušavanje krvi.

Ozbiljnu opasnost predstavlja bubrežno krvarenje, u kojem su intravenske infuzije antihemofilne plazme i krioprecipitata neučinkovite.

Gastrointestinalno krvarenje se zaustavlja velikim dozama koncentrata faktora zgrušavanja. Treba imati na umu da je želučano krvarenje često izazvano uzimanjem aspirina, brufena ili indometacina u vezi s bolovima u zglobovima, zuboboljom ili glavoboljom. Kod hemofiličara čak i jedna doza aspirina može uzrokovati želučano krvarenje.

U prevenciji i liječenju kroničnog osteoartritisa i drugih lezija mišićno-koštanog sustava potrebno je osigurati različite metode zaštite zglobova i prevencije ozljeda ekstremiteta. Da bi se to postiglo, štitnici od pjene ušivaju se u odjeću oko zglobova koljena, gležnja i lakta, a izbjegavaju se sportovi koji uključuju skakanje, padanje i modrice (uključujući vožnju bicikla i motocikla). Važnost se pridaje što ranijem i cjelovitom liječenju akutnih krvarenja u zglobovima i mišićima te intenzivnoj cjelogodišnjoj fizikalnoj terapiji. U tu svrhu postoje posebni kompleksi atraumatskih vježbi u vodi, na mekim strunjačama i uređajima za opterećenje - biciklistički ergometri, ručna vrata. Nastavu treba započeti u predškolskoj ili osnovnoškolskoj dobi, tj. prije nego što se razviju teški poremećaji mišićno-koštanog sustava. Kompleksna terapija nadopunjuje se fizioterapijom (visokofrekventne struje, elektroforeza glukokortikosteroida) i balneološkim metodama liječenja, prvenstveno blatnom terapijom, slanom vodom i radonskim kupkama. Kod čestih i stalno ponavljajućih krvarenja u istim zglobovima provodi se radioterapija i kirurško liječenje.

U prevenciji krvarenja važno je smanjiti rizik od ozljeda i posjekotina od ranog djetinjstva. Lako lomljive igračke (uključujući metalne i plastične), kao i nestabilni i teški predmeti isključeni su iz svakodnevne uporabe. Namještaj treba imati zaobljene rubove, rubove koji strše treba omotati vatom ili pjenastom gumom, a pod prekriti tepihom od flora. Bolje je da pacijenti komuniciraju i igraju se s djevojčicama nego s dječacima. Za pacijenta je važan pravilan izbor profesije i mjesta rada.

Prevencija hemofilije još nije razvijena. Utvrđivanje spola nerođenog djeteta genetskim testiranjem stanica dobivenih iz amnionske tekućine omogućuje pravovremeni prekid trudnoće, ali ne ukazuje je li fetus nositelj gena za hemofiliju. Trudnoća se održava ako je fetus muški, budući da su svi sinovi pacijenata rođeni zdravi. Trudnoća se prekida ako je fetus ženskog spola, jer su sve kćeri hemofiličara nositeljice bolesti.

Kod žena koje su nositeljice hemofilije, koje imaju 50% šanse da rode bolesno dijete (ako je fetus muški) ili koje su prenositelji hemofilije (ako je fetus ženski), rođenje samo djevojčica prenosi rizik od oboljelih od hemofilije u obitelji od prve do druge generacije, istovremeno povećavajući ukupan broj prenositelja bolesti.

Kromatografski pročišćena liofilizirana frakcija ljudske krvne plazme koja sadrži faktor koagulacije krvi VIII. Antihemofilni globulin, nadoknađuje manjak koagulacijskog faktora VIII, privremeno nadoknađuje koagulacijski defekt kod bolesnika s hemofilijom A. Nalazi se u prirodnoj kombinaciji s proteinom C faktorom VIII, von Willebrandovim faktorom. Uključen u procese koagulacije krvi, potiče prijelaz protrombina u trombin i stvaranje fibrinskog ugruška. Neposredno nakon primjene povećava koagulacijski potencijal krvi. Smanjenje aktivnosti antihemofilnog čimbenika je dvofazno: rana faza je brzo smanjenje aktivnosti, karakterizira vrijeme uspostavljanja ravnoteže s ekstravaskularnim prostorom, druga faza je spora, odražava biološki poluživot primijenjenog antihemofilika. faktor i iznosi 9-14 sati Specifična aktivnost (nakon dodavanja humanog albumina) – 9-22 IU proteina. 1 IU (kako je definirano standardom WHO faktora zgrušavanja krvi VIII) približno je jednaka razini antihemofilnog faktora prisutnog u 1 ml svježe donorske ljudske plazme.
Vrijeme postizanja maksimalne koncentracije u krvnoj plazmi nakon intravenske primjene je od 10 minuta do 2 sata.Poluživot je 8,4-19,3 sata.Aktivnost faktora koagulacije VIII smanjuje se postupno - za 15% unutar 12 sati.S hipertermijom , razdoblje Poluživot koagulacijskog faktora VIII može se smanjiti.

Indikacije za primjenu lijeka Faktor koagulacije VIII

Hemofilija A, von Willebrandova bolest (liječenje i prevencija krvarenja, uključujući tijekom operacije); stečeni nedostatak faktora VIII, bolesti praćene stvaranjem antitijela na faktor VIII.

Primjena lijeka Faktor koagulacije VIII

IV. Za sprječavanje spontanog krvarenja ili za blago krvarenje - 10 IU/kg (sadržaj faktora VIII, potrebnog za sprječavanje spontanog krvarenja, iznosi 5% normalne razine); za umjereno krvarenje i manje kirurške intervencije (na primjer, vađenje zuba) - 15-25 IU/kg (sadržaj faktora VIII - 30-80% normale) nakon čega slijedi doza održavanja od 10-15 IU/kg svaka 12-24 sata tijekom 3 dana ili dok se ne postigne dovoljan klinički učinak; za akutno krvarenje opasno po život - 40-50 IU/kg (sadržaj faktora VIII - 60-100% normale) nakon čega slijedi doza održavanja od 20-25 IU/kg svaka 8-24 sata; za opsežne kirurške intervencije - 40-50 IU/kg 1 sat prije zahvata i 20-25 IU/kg 5 sati nakon prve doze (tj. 80-100% norme prije i poslije operacije), zatim ponoviti svakih 8 -24 h dok se ne postigne dovoljan klinički učinak. Za dugotrajnu prevenciju krvarenja kod teške hemofilije A - 12-25 IU/kg svaka 2-3 dana.
Krioprecipitat se koristi uzimajući u obzir ABO kompatibilnost krvnih grupa. Spremnik sa smrznutim krioprecipitatom stavlja se u vodenu kupelj na temperaturi ne višoj od 35-37 °C radi odmrzavanja i potpunog otapanja i drži se ne više od 7 minuta. Dobivena prozirna žućkasta otopina, koja ne smije sadržavati pahuljice, koristi se odmah nakon pripreme. Primijeniti intravenozno pomoću štrcaljke ili sustava za transfuziju s jednokratnim filtrom. Doza ovisi o početnom sadržaju faktora VIII u krvi bolesnika s hemofilijom, prirodi i mjestu krvarenja, stupnju rizika od kirurške intervencije, prisutnosti specifičnog inhibitora u krvi bolesnika koji može neutralizirati aktivnost faktor VIII (izražen u jedinicama aktivnosti faktora VIII). Kako bi se osigurala učinkovita hemostaza tijekom najčešćih komplikacija hemofilije (hemartroza, bubrežno, gingivalno i nazalno krvarenje), kao i ekstrakcija zuba, sadržaj faktora VIII u plazmi trebao bi biti najmanje 20%; za intermuskularne hematome, gastrointestinalno krvarenje, prijelome i druge ozljede - ne manje od 40%; za većinu kirurških intervencija - najmanje 70%. Kada se faktor VIII primjenjuje u količini od 1 jedinice po 1 kg tjelesne težine, njegov sadržaj u krvi se povećava u prosjeku za 1%. Na temelju toga izračunava se broj doza potrebnih za povećanje koncentracije faktora VIII u krvi na određenu razinu pomoću formule: tjelesna težina bolesnika (u kg) pomnožena s potrebnim sadržajem faktora VIII u krvi bolesnika i podijeljeno s 200 (minimalni sadržaj faktora VIII u jedinicama aktivnosti u 1 dozi krioprecipitata). Nakon potpunog prestanka krvarenja, u bolesnika s hemofilijom primjenjuje se faktor VIII u razmacima od 12-24 sata u dozi koja osigurava povećanje razine faktora VIII za najmanje 20%. Liječenje se nastavlja nekoliko dana do vidljivog smanjenja veličine hematoma. Tijekom kirurških intervencija hemostatska doza se primjenjuje 30 minuta prije operacije. U slučaju masivnog krvarenja nadoknađuje se gubitak krvi, a na kraju operacije ponovno se uvodi krioprecipitat (1/2 doze izvorne). 3-5 dana nakon operacije potrebno je održavati koncentraciju faktora VIII u krvi bolesnika u istim granicama kao tijekom operacije. U postoperativnom razdoblju, kako bi se održala hemostaza, dovoljno je povećati sadržaj faktora VIII na 20%. Trajanje hemostatske terapije je 7-14 dana i ovisi o prirodi, mjestu krvarenja i reparativnim karakteristikama tkiva. Preporučljivo je kombinirati liječenje bolesnika s hemofilijom s krioprecipitatom uz istovremenu primjenu antifibrinolitičkih lijekova i kortikosteroida u profilaktičkim i srednjim terapijskim dozama.

Kontraindikacije za primjenu lijeka Faktor koagulacije VIII

Povećana osjetljivost.

Nuspojave lijeka Faktor zgrušavanja VIII

Alergijske i transfuzijske reakcije (urtikarija, osip, piskanje, sniženi krvni tlak, zimica, hipertermija, anafilaksija), prolazna parestezija sluznice usne šupljine, mučnina, povraćanje, glavobolja.

Posebne upute za uporabu lijeka Faktor zgrušavanja VIII

Koristite s oprezom tijekom trudnoće i dojenja.
Potrebno je pratiti broj otkucaja srca prije i tijekom terapije: ako se broj otkucaja srca značajno poveća, usporite brzinu infuzije ili prekinite davanje. Tijekom i nakon završetka terapije potrebno je pratiti razinu faktora VIII u krvi. Za prepoznavanje znakova progresivne hemolitičke anemije potrebno je pratiti hematokrit i izravnu Coombsovu reakciju. Promjene u imunološkom statusu u bolesnika s asimptomatskom hemofilijom uzrokovane su ponavljanim izlaganjem virusnim patogenima i/ili mogućom prisutnošću nečistoća u pripravcima faktora VIII (na primjer, IgG). Za postizanje zadovoljavajućih kliničkih rezultata, uz početno izračunatu dozu, može se primijeniti dodatna doza. Ako nema kliničkog učinka, potrebno je provesti test za identifikaciju inhibitora i određivanje njegove količine u neutraliziranim antihemofilnim jedinicama po 1 ml ili ukupnom volumenu plazme. Kako bi se smanjio rizik od nuspojava, preporuča se koristiti najkasnije 1 sat nakon razrjeđivanja, primijeniti samo IV, tijekom najmanje 3 sata (brzinom od 10 ml/min), ne zamrzavati otopinu i ne koristiti ponovno to. Moguć je razvoj protutijela na faktor koagulacije VIII, u takvim slučajevima obično je smanjena učinkovitost terapije, što može zahtijevati povećanje doze faktora koagulacije VIII. Moguće je povećati stopu pada broja CD4 stanica kod HIV-seropozitivnih hemofiličara.