Biomaterjali uurimine IF-meetodil. ELISA vereanalüüs - meetodi kirjeldus, eelised ja puudused, tulemuste tõlgendamine. Näidustused analüüsiks

Praegu kasutatakse tohutul hulgal erinevaid ELISA sorte ja modifikatsioone. Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) erinevad variandid on laialt levinud.

Tahkefaasiline ELISA pakuti välja 1971. aastal. Tahkefaasilise ELISA põhiprintsiibid, olenemata modifikatsioonist, on järgmised:

• 1. Reaktsiooni 1. etapis adsorbeeritakse antigeenid või antikehad tahkele faasile. Sel juhul on tahke faasiga mitteseotud reagendid kergesti eemaldatavad pesemisega.
• 2. Uuritavat proovi inkubeeritakse sensibiliseeritud süvendites. Positiivse kontrolli süvendid sisaldavad standardseid reaktiive. Sel juhul moodustuvad immuunkompleksid tahke faasi pinnal. Seondumata komponendid eemaldatakse pesemise teel.
• 3. Antikeha-ensüümi või antigeen-ensüümi konjugaadi lisamisel ja sidumisel immobiliseeritud immuunkompleksiga jääb ensüümi aktiivne sait kättesaadavaks järgnevaks interaktsiooniks substraadiga. Substraadi inkubeerimine süvendites immobiliseeritud konjugaadiga viib värvireaktsiooni tekkeni. Selle reaktsiooni saab peatada soovitud etapis, värvumise raskust saab hinnata visuaalselt või optilise tiheduse järgi. Tahkefaasianalüüsi mis tahes variandi oluline etapp on seondumata reaktiivide mahapesemise protseduur. Oluline on mitte ainult loputada tahkele faasile kinnitatud komponente, vaid eemaldada reaktiivid kogu kihi sügavusest. Proove saab pesta automaatselt pesumasinaga või käsitsi mitme kanaliga pipetiga. ELISA läbiviimiseks vajate:
  • · kasutatud polüstüreentabletti või muid tahke faasi võimalusi;
  • pesulahus;
  • konjugaat (ensüümiga märgistatud antigeenid või antikehad);
  • kasutatud substraatide segu;
  • stopp lahus (Stop reagent – ​​lahus reaktsiooni peatamiseks);
  • Positiivseks ja/või negatiivseks kontrolliks kasutatud proovid;
  • standardantigeen (kalibreerimiskõvera koostamiseks);
  • ühe- ja mitmekanalilised pipetid;
  • · pesumasin;
  • optiline seade uuritava lahuse optilise tiheduse määramiseks (ELISA lugeja, kõiki süvendeid järjestikuliselt fotomeetriv lugeja);
  • · 5-100 µl uuritud bioloogilist materjali.

Otsene ELISA

1. Antigeenid või antikehad (testmaterjal) adsorbeeritakse paneelide süvenditesse. Tihti on otseses ELISA-s tahkele faasile immobiliseeritud antigeeniks rakud ja muud osakeste antigeenid.

Kontroll. Kontrollina kasutatakse süvendeid adsorbeeritud positiivse kontrollprooviga, mis sisaldab tingimata soovitud antigeeni, ja negatiivse kontrollprooviga, mis ilmselt ei sisalda testitavat antigeeni. Puhastatud standardantigeeni juuresolekul viiakse reaktsioon läbi mitmes lahjenduses, nii et saab koostada kalibreerimiskõvera.

• 2. „Blokeerige tahkele faasile jäänud vabad sidumissaidid kaseiini BSA-ga jne (et vältida konjugaadi mittespetsiifilist sorptsiooni tahkel faasil).
• 3. Süvenditesse lisatakse ensüümiga märgistatud antikehad või antigeenid (konjugaat) ja inkubeeritakse. Konjugaadi seondumine tahke faasiga toimub ainult siis, kui süsteemi mõlemad komponendid on komplementaarsed. Pärast konjugaadiga inkubeerimist pestakse süvendid, eemaldades nii konjugaadi sidumata osa.

• 4. Seejärel lisatakse süvenditesse kasutatud ensüümile omane substraat ja inkubeeritakse. Kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumise tase, peatatakse ensüümi reaktsioon.
• 5. Reaktsiooni arvestamine. Esiteks võetakse reaktsiooni tulemusi visuaalselt arvesse. Tulemuste täpsemaks kajastamiseks hinnatakse värvimise intensiivsust ELISA lugejaga koos sobiva valgusfiltriga. Analüüsi tulemuste põhjal koostatakse graafik optilise tiheduse sõltuvusest kontsentratsioonist. ELISA absorptsiooniantikehade immobiliseerimine
• a) antigeeni tuvastamiseks; b) antikehade tuvastamiseks.

Kaudne ELISA.

Seda ELISA varianti kasutatakse tavaliselt spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks. Standardantigeen adsorbeeritakse paneelide süvenditesse ja inkubeeritakse patsiendilt saadud seerumi või muu bioloogilise materjali proovidega (tserebrospinaalvedelik, sülg jne). Tahkel faasil oleva antigeeniga seotud spetsiifilised antikehad tuvastatakse antiglobuliini konjugaati kasutades. Sõltuvalt analüüsi eesmärgist kasutatakse erinevaid antiglobuliinireaktiive, mis tuvastavad kõigi isotüüpide või immunoglobuliinide üksikute klasside ja alamklasside spetsiifilisi antikehi. Meetodi peamine eelis on konjugaadi universaalsus. Sama konjugaati saab kasutada inimese antikehade tuvastamiseks paljude erinevate antigeenide suhtes mis tahes proovis. Reaktsioon on metoodiliselt lihtne.

Kaudse ELISA peamised etapid antikehade tuvastamiseks:

• 1. Antigeen adsorbeeritakse tahkele faasile, seejärel pestakse seondumata komponentidelt maha.
• 2. Blokeeri tasuta sidumissaidid. Pestud.

• 3. Uuritav materjal lisatakse süvenditesse, inkubeeritakse ja seejärel pestakse. Paralleelselt asetatakse positiivsete ja negatiivsete kontrollidega proovid.
• 4. Lisage antiglobuliini konjugaat töölahjenduses, inkubeerige, peske seondumata komponendid maha.
• 5. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Kui positiivsetes kontrollisüvendites on saavutatud optimaalne värvumise tase, peatatakse reaktsioon stopplahuse lisamisega.
• 6. Mõõtke reaktsioonisaaduse kogus ELISA lugejal.

Optimaalsete analüüsitingimuste korral on meetod väga spetsiifiline ja tundlik. See võimaldab tuvastada uuritud patsientide seerumis nanogrammides antikehi. Rahuldavate tulemuste saamiseks on vajalik reaktiivide ja metoodikate standardimine. Seda ELISA varianti saab kasutada ka monoklonaalsete antikehade testimiseks.

"Sandwich" - ELISA variant antigeenide tuvastamiseks.

Selle ELISA variandiga tuvastatud antigeenidel peab olema mitu antikeha siduvat epitoopi või korduvad, ruumiliselt eraldatud epitoobid, millel on sama spetsiifilisus.

Selle ELISA variandi läbiviimisel inkubeeritakse uuritava prooviga tahkele faasile adsorbeeritud väga spetsiifilisi polü- või monoklonaalseid antikehi. Pärast pesemisprotseduuri lisatakse süvenditesse ensüümiga märgistatud antikehad (konjugaat) samale antigeenile ja seejärel viiakse läbi kõik muud reaktsiooni etapid. Spetsiifilise kompleksi moodustumise efektiivsus analüüsi igas etapis sõltub antigeeni-antikeha reaktsiooni seondumiskonstandist.

Analüüsi peamised etapid:

• 1. Monoklonaalsed antikehad või afiinsuspuhastatud polüklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.
• 2. Uuritav proov viiakse paneelide süvenditesse, positiivne kontrollproov ja negatiivne kontrollproov asetatakse paralleelselt erinevatesse lahjendustesse. Inkubeeritakse ja pestakse.
• 3. Süvenditesse lisatakse ensüümiga märgistatud monoklonaalsed või polüklonaalsed antikehad (konjugaat). Pesemine toimub pärast inkubeerimist.
• 4. Substraat sisestatakse, inkubeeritakse. Reaktsioon peatatakse, kui positiivse kontrolli süvendites saavutatakse optimaalne värvumine.
• 5. Tulemuste arvestus ELISA lugejal.

Meetodi peamine eelis on selle kõrge tundlikkus, mis ületab teiste ELISA skeemide võimalused.

Konkurentsivõimeline ELISA.

See analüüsivõimalus põhineb märgistatud (konjugaat) ja märgistamata (test) antikehade konkureerimisel tahkel faasil adsorbeeritud antigeeniga seondumisel. Tahke faasi külge kinnitatud ensüümi hulk väheneb proportsionaalselt vabade antikehade sisaldusega segus. Antigeeni määramiseks kasutatakse sama võimalust, kuid sel juhul konkureerib soovitud antigeen märgistatud standardantigeeniga seondumisel tahke faasi pinnale immobiliseeritud antikehadega.

Võistlusmeetod nõuab minimaalset arvu toiminguid, vähest reaktiivide tarbimist ja seda on lihtne automatiseerida. Antikehade tuvastamiseks konkureeriva ELISA läbiviimisel on parem kasutada märgistatud monokliinseid antikehi, siis konjugaadi konkurents uuritava prooviga toimub tahkele faasile adsorbeeritud antigeeni ühe epitoobi suhtes. Seda ELISA varianti kasutatakse erinevate ühendite, näiteks inimese immunoglobuliinide, vähi-embrüonaalse antigeeni, insuliini jne määramiseks. See võimaldab tuvastada antikehi nakkusetekitajate diagnostiliselt oluliste epitoopide vastu.

Antigeeni tuvastamise analüüsi peamised etapid:

• 1. Detekteeritava antigeeni suhtes spetsiifilised monoklonaalsed antikehad immobiliseeritakse tahkele faasile.
• 2. Lisage paneelide süvenditesse ensüümiga märgistatud antigeen ja uuritav proov teadaolevas kontsentratsioonis. Viige läbi inkubeerimine ja pesemine. Paralleelselt asetatakse positiivsed ja negatiivsed kontrollid külgnevatesse süvenditesse. Kalibreerimise loomiseks, kasutades standardset märgistamata antigeeni erinevates lahjendustes.
• 3. Lisage substraat, inkubeerige, peatage reaktsioon, kui positiivse kontrolli süvendites tekib optimaalne värvumine.
• 4. ELISA lugeja reaktsiooni arvestamine.

Sel juhul on antigeeni kogus uuritavas proovis pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

inhibeeriv ELISA.

Selles ELISA variandis seostub uuritavas proovis olev antigeen ensüümiga märgistatud monoklonaalsete antikehadega ja inhibeerib nende interaktsiooni tahkele faasile immobiliseeritud standardantigeeniga. Konjugaadile spetsiifilise antigeeni isegi mikrokoguste olemasolu proovis pärsib märgistatud antikehade seondumist immobiliseeritud antigeeniga. Inhibeerimise aste on otseselt võrdeline antigeeni sisaldusega lahuses. Kvantitatiivseks analüüsiks koostatakse kalibreerimiskõver, kasutades standardantigeeni seerialahjendusi. Antigeeni tuvastamise inhibeeriva ELISA peamised etapid (joon. 6).

• 1. Adsorbeerige standardantigeen paneelide süvenditesse. Valige tiitrimise teel märgistatud antikehade töölahjendus.
• 2. Konjugaati eelinkubeeritakse töölahjenduses uuritava proovi, standardantigeeni ja positiivse kontrollproovi lahjendustega.
• 3. Segu kantakse paneelide süvenditesse. 100% sidumise kontrollimiseks lisatakse mitmesse süvendisse ainult märgistatud antikehi, ilma inhibeeriva antigeenita. Paneele inkubeeritakse ja seejärel pestakse.
• 4. Lisa substraat.
• 5. Salvestage tulemused.

Määratava antigeeni kontsentratsioon uuritavas proovis on pöördvõrdeline tahke faasi ensümaatilise aktiivsusega.

ELISA abil saab määrata mitte ainult lahustuva antigeeni või antikeha, vaid ka erinevaid valke tootvaid rakke.

Ensüüm-immunovärvimise meetod (ELISPOT).

1983. aastal kohandati ELISA tehnoloogiat lümfoidrakkude tuvastamiseks, mis sekreteerivad antikehi või antigeene (nt tsütokiine) in vitro. Meetodit nimetatakse ELISPOTiks (enzymatic immunoassay või spot method). Meetodi põhiprintsiip:

• 1. Polüstüreeni süvendi pinnale (kasutades 24 süvendiga rakukultuuri paneele) adsorbeeritakse antigeenid või antikehad, mis toimivad „püüdvate“ reagentidena.
• 2. Lisatakse uuritud lümfoidrakud, kultiveeritakse mitu tundi 37°C juures, andes neile võimaluse hõivata teatud koht ja täita sekretoorset funktsiooni. Selliste rakkude poolt sekreteeritud antikehad või antigeenid püütakse kinni tahkele faasile adsorbeeritud reaktiividega.
• 3. Rakud eemaldatakse, kasutades rakke lüüsiva pesuvahendiga pesulahust.
• 4. Sekretoorsete saaduste kogunemiskohad näidatakse ensüümiga seotud antikehade lisamisega (antiglobuliini reaktiiv).
• 5. Lisatakse substraadi-agaroosi segu (kasutatud substraadid peaksid agaroosis lahustuma ja moodustama lahustumatud reaktsiooniproduktid), tahke faasi pinnale tekivad pruunid või sinised laigud (olenevalt kasutatavatest ensüümidest ja substraatidest), paljastades piirkonnad, kus rakud asuvad. asusid.
• * Saadud laigud loendatakse mikroskoobi all, see on sekreteerivate rakkude arv.

Tahke faasina saab kasutada nitrotselluloosmembraani Sel juhul on mitmeid eeliseid: tänu NCM suurele adsorptsioonivõimele on vaja oluliselt väiksemat kogust “püüdva” reagendina kasutatavat antigeeni, lisaks agaroosi ei ole vaja substraadile lisada.

Määrates samaaegselt sekreteerivate rakkude arvu ja sekreteeritava antigeeni või antikeha koguhulga süvendis, mis on võimalik erineva substraadi kasutamisel, on võimalik määrata sekreteeritava aine kogust ühe raku järgi.

See meetod on leidnud laialdast rakendust adsorbeeritud antikehade poolt püütud antigeeni sekreteerivate rakkude arvu hindamiseks, seda kasutatakse tsütokiine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Signaali võimendussüsteemid.

Kõrge afiinsusega antikehade kasutamisel on üksikute ELISA variantide tundlikkus väga kõrge ja võimaldab teoreetiliselt tuvastada üksikuid antigeenimolekule, kuid praktikas piiravad tundlikkust mitmed tegurid: ensüümi aktiivsus, signaali intensiivsus ja signaali arvestusmeetodid. . Signaalivõimendussüsteemid võimaldavad tõsta erinevate ELISA variantide tundlikkust. Mõelge mõnele neist süsteemidest:

Põhineb avidiini ja biotiini koostoimel.

Biotiini koensüümi molekulid (m.m. 244 Da) konjugeeritakse antikehadega, kasutades biotinüül-N-hüdroksüsuktsimiidi. Väikest biotiini molekuli on lihtsam kinnitada immunoglobuliini või muu valgu külge, ilma et see rikuks selle immuun- või ensümaatilisi omadusi. Ensüüm on sel juhul seotud munavalge glükoproteiini avidiiniga. Avidiini seondumisafiinsus biotiini suhtes on väga kõrge (kompleksi dissotsiatsioonikonstant on 10-15 mol), avidiini-ensüümi konjugaat on kindlalt fikseeritud antigeen-antikeha-biotiini kompleksil. Pärast sobiva substraadi lisamist määratakse reaktsiooniprodukt spektrofotomeetriliselt või luminestsentsi intensiivsuse järgi.

Üks avidiini molekul koosneb neljast identsest subühikust, on võimeline interakteeruma nelja biotiini molekuliga, mis võimaldab seda kasutada kahe biotiini sisaldava ühendi ühendava molekulina. Sel juhul biotinüleeritakse ka ensüüm ja avidiin toimib sillana, ühendades kaks biotiinijääke sisaldavat molekuli. Saadud antigeen-antikeha-biotiini kompleksile lisatakse vaba avidiin, millele järgneb biotinüülitud ensüüm. Salvestage reaktsioon.

Avidiini valku saab mittespetsiifiliselt sorbeerida teistele molekulidele; seetõttu kasutatakse üha enam teist biotiini siduvat valku, streptavidiini, mida leidub bakteris Streptomyces avidinii. Streptavidiin moodustab ka biotiiniga tugeva kompleksi ja koosneb neljast identsest subühikust.

Avidiini-biotiini kompleksi kasutamine võimaldab oluliselt tõsta ELISA tundlikkust, kuna konjugaadi sünteesi käigus võib ühe AT molekuliga seonduda kümneid biotiini molekule. Konjugaatide (antikehad ja ensüümid biotiiniga) saamine on üsna lihtne ning sellega kaasnevad minimaalsed muutused nende immunoloogilises ja ensümaatilises aktiivsuses. Ensüümide konjugaate biotiiniga saab kasutada universaalsete reagentidena.

Kemoluminestsentsreaktsioonide kasutamine.

Kemiluminestsentsreaktsioone saab kasutada signaali saamiseks ELISA-s, suurendades samal ajal meetodi tundlikkust ja vähendades analüüsi aega. Mädarõika peroksüdaasi kasutatakse ELISA-s laialdaselt märgisena, selle tuvastamiseks saab kasutada ka erinevaid kemoluminestsentsreaktsioone. Kemiluminestsentsreaktsioonid põhinevad luminooli võimel vesinikperoksiidiga oksüdeerimisel hõõguda. Otseses analüüsis tekitab ensümaatiline reaktsioon vesinikperoksiidi ja oksüdeerib luminooli; seda reaktsiooni katalüüsib mädarõika peroksidaas. Signaali võimendamiseks kasutatakse erinevaid ühendeid, näiteks lutsiferiini, fenoole, sel juhul suurendatakse luminestsentsi intensiivsust 10-100 korda, mõnel juhul 500 korda (võimendatud kemoluminestsentsanalüüs). Luminestsentssignaal on väga stabiilne, selle tase saavutab maksimumi 30 sekundiga (võrdluseks: värvireaktsioon OPD-ga kui indikaatoriga areneb täielikult välja alles 30 minutiga).

Kaudsel analüüsil luminooli või selle derivaatidega antikeha märgistatakse. Sellist vabas olekus olevat märgist on võimalik valguse vabanemisega vesinikperoksiidiga oksüdeerida. Kui see on moodustanud kompleksi, kaotab see oksüdeerumisvõime.

Põhineb kaskaadsüsteemidel.

ELISA tundlikkuse suurendamiseks võib kasutada ensüümikaskaadsüsteeme. Sel juhul annab esimene antikehaga seotud ensüüm teise ensüümsüsteemi jaoks redutseeritava substraadi. Teine ensüümsüsteem võib olla substraattsükliline või redoksütsükliline. Sel juhul võivad fosfoglükoisomeraas, aldolaas, aluseline fosfataas olla ensüümi märgisena. Reaktsiooni lõppsaadus määratakse visuaalselt või spektrofotomeetriliselt.

ELISA võimendussüsteemid saavutavad kõrge tundlikkuse. Selliseid ELISA süsteeme kasutatakse hormoonide taseme määramiseks.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) viiakse läbi keha kaitsefunktsioonide igakülgseks hindamiseks. Uuringu käigus määratakse immuunrakkude arv ja omadused, vajalike antikehade olemasolu. ELISA vereanalüüs tehakse nakkuslike, hematoloogiliste, autoimmuunhaiguste, primaarse ja sekundaarse immuunpuudulikkuse diagnoosimiseks. Mõelge, mis on ELISA vereanalüüs ja millised näidustused selle uuringu jaoks on.

Mis see on

ELISA vereanalüüs on laborimeetod, mis tuvastab vereproovist antikehi või antigeene. Seda uuringut kasutatakse immunoglobuliinide, immunoloogiliste komplekside, hormoonide taseme tuvastamiseks.

Näidustused analüüsiks

ELISA vereanalüüsi määramiseks on järgmised näidustused:

• sugulisel teel levivate infektsioonide diagnoosimine - ureaplasma, mükoplasma, klamüüdia, trichomonas, süüfilis;
• viirushaiguste diagnoosimine - tsütomegaloviirus, herpes, hepatiit, Epstein-Barri viirus;
• hormoonide taseme määramine;
• onkoloogiliste haiguste diagnoosimine;
• immuunpuudulikkuse määramine;
• allergiate diagnoosimine;
• preoperatiivne terviklik läbivaatus enne elundi siirdamist;
• ravi efektiivsuse hindamine.

Meetodi põhimõte

Ensüüm-immunoanalüüsi meetodi tööpõhimõte põhineb spetsiifiliste valkude-antikehade määramisel veres - immunoglobuliinidel. Immunoglobuliine toodab inimese immuunsüsteem, kui antigeenid (võõrad mikroorganismid) sisenevad kehasse. Need immuunmolekulid seostuvad kehas mitmesuguste nakkusetekitajatega ja neutraliseerivad neid.

Immunoglobuliinidel on oluline omadus - spetsiifilisus. Tänu sellele saavad nad seostuda spetsiifilise antigeeniga, moodustades antigeeni-antikeha kompleksi. ELISA vereanalüüsi käigus määratakse see kompleks kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt.

Immunoglobuliine on viis klassi. Kuid tavaliselt on määratletud kolm klassi - immunoglobuliinid A, M, G. Need antikehad kogunevad kehasse erinevatel aegadel alates nakatumise hetkest.

• Immunoglobuliinid klass M (IgM) ilmuvad veres kõige esimesena viiendal päeval nakatumise hetkest. Nad on kehas 5-6 nädalat, seejärel kaovad vereringest. IgM antikehad viitavad haiguse ägedale perioodile või haiguse ägenemisele selle kroonilises käigus.
• Ligikaudu 3-4 nädalat pärast nakatumist ilmuvad verre immunoglobuliinid klass G (IgG). Need võivad inimveres eksisteerida mitu kuud või isegi aastaid. ELISA vereanalüüsi dekodeerimise järgi, kui kahes järjestikuses kaks nädalat hiljem võetud vereproovis on IgG immunoglobuliinide hulk suurenenud, räägivad need jooksvast infektsioonist või reinfektsioonist – sama infektsiooniga uuesti nakatumisest.
• Immunoglobuliinid klass A (IgA) saab selle uurimismeetodiga tuvastada 2–4 ​​nädalat pärast nakatumist või nakkushaiguse ägenemist. Neist ainult 20% ringleb veres, ülejäänu eritub limaskestade kaudu. IgA antikehad kaovad vereringest 2-8 nädalat pärast nakkusetekitajate hävimist. Nende immunoglobuliinide kadumine tähendab infektsiooni paranemist. Kui pärast haiguse lõppu tehakse kindlaks IgA antikehade olemasolu veres, siis on haigus läinud kroonilisse staadiumisse.

Ettevalmistus analüüsiks

ELISA vereanalüüsi tegemiseks kasutatakse kõige sagedamini inimverd. Aga uurida saab ka klaaskeha sisu, tserebrospinaalvedelikku, lootevett.

Patsiendilt võetakse uurimiseks vereproov kubitaalveenist. Soovitatav on anda verd tühja kõhuga (viimasest söögikorrast peab mööduma vähemalt 12 tundi). Kui patsient võtab ravimeid, tuleb arstile teatada, kuna mõned neist võivad analüüsi tulemust muuta. Uuringu tulemuste usaldusväärsust mõjutavad alkoholi ja narkootikumide tarvitamine.

Dekrüpteerimine

Selle analüüsi tulemuse vorm näitab positiivset (+) või negatiivset (-) tulemust iga immunoglobuliinide klassi kohta.

Mõelge ELISA vereanalüüsi võimaliku dekodeerimise tõlgendamisele.

• IgM, IgG, IgA negatiivne tulemus - immuunsuse puudumine infektsioonide suhtes.
• Negatiivne IgM, IgA ja positiivne IgG tulemus – nakkus- või vaktsineerimisjärgne immuunsus.
• Negatiivne või positiivne IgG, IgA ja positiivne IgM on äge infektsioon.
• IgM, IgG, IgA positiivne tulemus on kroonilise nakkushaiguse ägenemine.
• Negatiivne IgM tulemus ja negatiivne või positiivne IgG, IgA tulemus on krooniline infektsioon.
• Negatiivne IgM tulemus ja IgG puudub, IgA - taastumine.

Meetodi eelised

ELISA vereanalüüsil on palju eeliseid. Peamisi saab eristada:

• suhteliselt kõrge täpsus (tundlikkus);
• varajase diagnoosimise võimalus;
• võime jälgida nakkusprotsessi dünaamikat;
• kõrge ühtlustamise tase, mis võimaldab massiuuringuid;
• lühike aeg, mis on vajalik analüüsi tulemuse saamiseks;
• mugavus tööl;
• kõigi analüüsietappide automatiseerimine;
• suhteliselt madalad kulud.

Puudused

ELISA meetodi puuduseks on see, et mõnikord annab see valenegatiivseid või valepositiivseid tulemusi. Lisaks uuringu tehnilistele vigadele võib valetulemuste põhjuseks olla patsiendi reumatoidfaktor, krooniliste haiguste esinemine (mille puhul tekivad antikehad), ainevahetushäired ja teatud ravimite võtmine.

• askariaas;
• trihhinoos - analüüs viiakse läbi mitu korda, antikehade maksimaalne tase määratakse 4-12 nädalat pärast nakatumist;
• tsüstitserkoosi;
• taeniaas;
• fastsioliaas - antikehad määratakse haiguse ägedas staadiumis;
• opisthorchiasis - viige läbi diferentsiaaldiagnostika krooniliste ja ägedate haigusvormide vahel;
• giardiaas;
• vistseraalne ja naha leishmaniaas;
• amööbias;
• toksoplasmoos.

4.2 4,20 5-st (5 häält)

Nakkushaiguste puhul kasutatavate standardsete diagnostiliste meetmete loend sisaldab ensüümi immuunanalüüsi. Kui süüfilise ELISA on positiivne, ärge kohe paanitsege.

Vaatleme üksikasjalikumalt selle uurimismeetodi omadusi ja erinevates patsientide kategooriates saadud tulemuste dešifreerimise põhimõtteid.

Ensüüm-immunoanalüüs on üks levinumaid meetodeid nakkushaiguste diagnoosimiseks. See kuulub treponemaalsete testide kategooriasse, see tähendab, et seda saab kasutada süüfilise põhjustaja - kahvatu treponema - esinemise määramiseks patsiendi kehas.

ELISA abil tuvastatakse süüfilis treponema antikehade tuvastamise tõttu. Need sisalduvad patsiendi veres ning nende tüüp ja kogus sõltuvad haiguse staadiumist ja vormist, mis võimaldab teil saada olulist teavet inimese praeguse terviseseisundi kohta.

Eelised ja miinused

ELISA on väga sageli ette nähtud süüfilise või muude nakkushaiguste kahtluse korral. Selle põhjuseks on asjaolu, et analüüs võimaldab tuvastada haiguse täpse tüübi ja staadiumi ning selle usaldusväärsus püsib kõrgel tasemel - mitme uuringu tulemuste põhjal on vea tõenäosus vaid 1%, esmane ELISA. selle täpsus on umbes 90%.

Kvaliteetsete reaktiivide ja kaasaegsete seadmete kasutamine võimaldab maksimeerida indikaatorite täpsust.

Üldiselt on meetodi eelised järgmised:

1. Tulemuse kõrge täpsus. Valeandmete saamise tõenäosus on väga väike.
2. Inimliku mõjuteguri minimeerimine. ELISA läbiviimise kaasaegsed seadmed välistavad protsessi automatiseerimise tõttu inimese mõjutamise uuringu tulemustele.
3. Spetsiifiliste antikehade tuvastamine. Ühte tüüpi antigeene on võimatu teistega segi ajada, seetõttu näitab analüüs konkreetse diagnoosi täpset tulemust.
4. Väiksemate kõrvalekallete fikseerimine normist. Isegi väikseim patoloogiliste tegurite kontsentratsioon ei jää märkamatuks.

Ärge unustage selle meetodi nõrkusi. ELISA-l on järgmised puudused:

1. Kõrge hind. Kõrge hind on tingitud paljudest teguritest, eelkõige vajadusest hea varustuse, kvaliteetsete reaktiivide ja piisava väljaõppega spetsialistide järele.
2. Vajadus esialgse diagnoosi järele. Peate teadma, milliseid antigeene otsida, kuna ilma täiendavate andmeteta on täpset diagnoosi võimatu panna.
3. Valepositiivse tulemuse tõenäosus. Mõned kehaseisundid ja muud tegurid võivad lõplikke andmeid moonutada.

Näidustused läbiviimiseks

Arst võib määrata ensüümi immuunanalüüsi mitte ainult süüfilise, vaid ka mitmete teiste nakkushaiguste diagnoosimiseks.

Kui käsitleme olukorda otseselt treponema nakatumisega, võib uuringu põhjus olla:

• haiguse väliste sümptomite ilmnemine (šankr, süüfilise lööve, kummid jne);
• immuunsuse märkimisväärne vähenemine;
• süüfilise tuvastamine või kahtlus seksuaalpartneril, sugulastel ja pereliikmetel;
• positiivne reaktsioon teiste testide ajal;
• muude haiguste tuvastamine, mis võivad olla seotud süüfilisega;
• inimese isiklik soov läbi vaadata.

Läbiviimise meetodid

ELISA-d saab läbi viia erinevatel viisidel. Igal juhul valitakse kõige sobivam variant.

Esiteks on meetodid jagatud järgmisteks osadeks:

1. Kvalitatiivne. Patsiendi kehas tuvastatakse infektsiooni või viiruse olemasolu.
2. Kvantitatiivne. Määrab patogeense aine vastaste antikehade kontsentratsiooni inimkehas, mis näitab haiguse arengu staadiumi ja intensiivsust.

Samuti on olemas ELISA läbiviimise meetodite klassifikatsioon vastavalt vajaliku reaktsiooni reprodutseerimise põhimõttele.

Valikuid on 3:

1. Otse. Märgistatud antikehad süstitakse kaasasolevatesse vereproovidesse.
2. Kaudne antigeenidega. Adsorbeeritud antigeenid asetatakse eelnevalt ELISA jaoks mõeldud polüstüreenplaadi rakkudesse. Seejärel lisatakse neile viiruste antikehad, mis provotseerib tulemuste edasiseks hindamiseks vajalike immuunkomplekside moodustumist.
3. Kaudne koos antikehadega. Seda meetodit kasutatakse sageli sugulisel teel levivate haiguste korral. See hõlmab antikehade eelsorptsiooni, alles seejärel lisatakse plaadile antigeenid.

Materjali proovide võtmise reeglid

Valetulemuste saamise riski vähendamiseks on vaja analüüsiks verd õigesti annetada.

Enne ELISA läbimist tuleb järgida mõningaid piiranguid:

• vältida intensiivset füüsilist ja emotsionaalset stressi;
• suitsetamisest ja alkoholi tarvitamisest loobuda vähemalt 1-3 päeva ette;
• mõne päeva jooksul peate üle minema õigele toitumisele;
• naistel on soovitav kontrollida menstruaaltsükli faasi, kuna hormoonid võivad tulemusi moonutada;
• viimane söögikord peaks olema 8-10 tundi enne vere annetamist;
• 10 päeva jooksul on välistatud ravimid, mis võivad uuringu tulemusi mõjutada.

ELISA jaoks võetakse veeniveri kubitaalveenist, see tuleb võtta hommikul tühja kõhuga. Üldiselt kehtivad venoosse vere võtmiseks ettevalmistamise standardreeglid. Olenevalt uuritava haiguse esinemisest võidakse kehtestada täiendavad nõuded patsiendi eelnevale ettevalmistusele.

Metoodika

ELISA läbiviimise juhised on üsna lihtsad:

1. Patsient võtab veenist verd.
2. Võetud materjal valmistatakse ette ja jagatakse proovideks spetsiaalsel peensilmalisel paletil.
3. Antigeenid segatakse antikehadega vastavalt valitud meetodile.
4. Reaktsiooni hinnatakse. Proove võrreldakse kontrollproovidega, viiakse läbi tulemuste kvalitatiivne ja kvantitatiivne hindamine.
5. Andmed kantakse spetsiaalsesse tabelisse kvantitatiivsete näitajate rakendamisega (antikehade koguhulk).
6. Tulemused dešifreerib raviarst. Vajadusel määratakse sobiv ravi.

Pärast uuringut antakse patsiendile tulemustega dokument. See on tabeli kujul, millel on vastavad tähised igat tüüpi immunoglobuliinide vastas, ristumiskohas nakkushaiguste nimetustega.

Dekrüpteerimine

Ainult spetsialist saab analüüside tulemusi õigesti dešifreerida. Üksinda on raske aru saada, mida tähendab näiteks ELISA tulemus k = 1 4. Süüfilis võib esineda ka erinevates vormides, mis mõjutab ka lõppandmeid.

Tulemused näitavad kolme tüüpi immunoglobuliine:

1. IgM. Laske määrata süüfilise nakatumise periood. Positiivne tulemus näitab haiguse ägenemist. Nende puudumine võib viidata krooniliste patoloogiate remissioonile või haiguse varjatud vormile.
2. IgA. Tähistab haigust, mis on nakatumisest möödunud rohkem kui kuu. See on ka märk haiguse ägedast faasist, nii tavaliste patoloogiate kui ka kaugelearenenud krooniliste patoloogiate korral.
3. IgG. See on märk haiguse kõrgperioodist, see tähendab selle ägenemisest. Süüfilise korral ilmneb positiivne reaktsioon mõni aeg pärast ravi. Teatud tüüpi haiguste puhul võib see olla märk arenenud immuunsusest.

Neid aineid toodab organism kindlas järjestuses, mis on haiguse lisamärk. Kvalitatiivsete testidega tehakse kindlaks ainult immunoglobuliinide olemasolu igat tüüpi veres.

See väljendub analüüsis osalevate materjalide värvimuutuses. Kvantitatiivsed näitajad on abistavad, kirjeldavad olukorda täpsemalt. Antigeenide ja antikehade suhe näitab haiguse tõsidust ja organismi reaktsiooni intensiivsust.

Mida teha

Kui patsiendil on tõesti süüfilis, tuvastatakse absoluutselt alati positiivne ELISA, sellises uuringus on võimatu mitte märgata treponeemide esinemist. Ärge heitke meelt, haigus reageerib hästi ravile, eriti algstaadiumis.

Mida teha, kui testi tulemus on positiivne:

• läbima täiendavaid uuringuid vastavalt arsti näidustustele;
• läbima antibiootikumravi kuuri vastavalt valitud skeemile;
• keskenduda immuunsüsteemi tugevdamisele;
• teavitage oma seksuaalpartnerit haigusest;
• tulevikus regulaarselt läbima ennetava diagnostika kuni ambulatooriumis registreerimisest kustutamiseni (positiivsete testitulemuste puudumisel 5 aasta pärast).

Pole vaja haiguslehte edasi lükata ja karta tulemuste avalikustamist. Diagnoos on krüpteeritud ja jääb saladuseks, vaid juhul, kui on oht teistele inimestele nakatuda, tuleb probleemist teavitada lähedasi ja seksuaalpartnerit, et nad läbiksid vajalikud uuringud.

Valepositiivne tulemus ja selle põhjused

Mõnikord registreeritakse teiste testide tulemus ja ELISA on süüfilise suhtes valepositiivne. Seetõttu on soovitatav läbi viia 2-3 abimeetodit ja mõne aja pärast korrata ensüümi immuunanalüüsi.

Sellised ebatäpsused on haruldased, need on peamiselt tingitud järgmistest teguritest:

• Rasedus;
• kroonilised haigused;
• hiljutine vaktsineerimine;
• vigastus.

Valepositiivsed tulemused jagunevad ägedateks ja kroonilisteks, olenevalt neid esile kutsunud teguri olemusest.

Peamised on esitatud tabelis:

Selliste terviseprobleemide esinemisel võib süüfilise test anda positiivse tulemuse, kuid see on vaid tagajärg organismi poolt haigusega võitlemiseks valkude tootmisele. ELISA tunnistab need aga antigeenideks.

Tervel kuni pooleteiseaastasel lapsel võib ELISA valepositiivseid tulemusi saada, kui naine oli raseduse ajal nakatunud süüfilisega. Enne seda vanust ei ole verel veel aega täielikult uueneda, mistõttu võivad selles esineda ema antikehad. Erandiks on olukord IgM immunoglobuliinide tuvastamisel.

Lisateavet ensüümi immuunanalüüsi funktsioonide ja selle metoodika kohta saate sellest artiklist videot vaadates.

ELISA ehk ensüümimmunoanalüüs on kaasaegne viis paljude, sealhulgas nakkusliku iseloomuga patoloogiate määramiseks. Uuring viiakse läbi laboris. Selle tehnika peamine eesmärk on tuvastada antikehad, nende olemasolu näitab patogeensete ainete tungimist kehasse. Kaasaegne meditsiin kasutab ELISA analüüsi paljude haiguste diagnoosimiseks ja kolmandate isikute ühendite tuvastamiseks.

ELISA analüüs: millal ja kuidas seda tehakse

ELISA meetodi abil saavad spetsialistid tuvastada spetsiifiliste antikehade (immunoglobuliinide) olemasolu vereseerumis ja määrata antigeene. Immunoglobuliinid tekivad keerukate närviprotsesside tulemusena, mida teostavad keha kaitsefunktsioonid. Need on immuunsüsteemi loomulik reaktsioon võõrkehade tungimisele. Iga patogeeni tüübi jaoks toodetakse spetsiifilisi antikehi.

Tähtis: teatud komplekside olemasolul võimaldab ensüümi immuunanalüüsi meetod kindlaks teha patogeeni tüübi inimkehas.

ELISA-diagnoos tehakse järgmiste haiguste tuvastamiseks:

• herpes;
• viiruslikku tüüpi hepatiit;
• Epstein-Barri viirus (4. tüüpi herpes);
• tsütomegaloviirus.

Vereanalüüs näitab peamised patogeensed bakterid, mis provotseerivad süüfilise, ureaplasmoosi ja trihhomonoosi arengut. Analüüsi abil määravad eksperdid 600 tüüpi allergeenide antikehad. Ensüümi immuunanalüüsi läbiviimine on sobiv elundisiirdamise ettevalmistamiseks.

Tähtis: mõnel juhul on ELISA täiendav meetod onkoloogia määramiseks inimkehas.

Analüüs viiakse läbi eranditult laboris. Uurimiseks võetakse veeniverd kubitaalveenist. Analüüsi tulemused selguvad järgmisel päeval. Usaldusväärse teabe saamiseks soovitavad eksperdid järgida ELISA ettevalmistamise reegleid:

• üks päev enne uuringut on vaja loobuda vürtsikate ja suitsutatud toitude kasutamisest;
• alkohol on keelatud;
• verd annetatakse hommikul tühja kõhuga;
• enne uuringut on vaja välistada igasugune füüsiline ja emotsionaalne stress;
• soovitav on suitsetamisest loobuda.

Milliseid patoloogiaid tuvastatakse ensüümi immuunanalüüsiga

Ensüümi immuunanalüüsi abil määrab spetsialist immunoglobuliinide erinevad klassid, mille olemasolu näitab patoloogiliste protsesside arengut organismis. Niisiis, ELISA peamised näitajad on IgM ja IgG. IgM immunoglobuliini olemasolu näitab ägeda patoloogilise protsessi arengut. IgG näitaja veres on tüüpiline taastumise staadiumile.

ELISA analüüsi abil tuvastavad spetsialistid mitmeid ohtlikke haigusi. Need sisaldavad:

Tähtis: ELISA test on ette nähtud süüfilise kinnitamiseks, kui RV jaoks vere loovutamisel saadakse positiivne tulemus.

Õigeaegne diagnoosimine võimaldab jälgida ravi efektiivsust ja vajadusel seda kohandada.

Analüüsi dešifreerimine: positiivne ja negatiivne vastus

ELISA tulemuste tõlgendamise teostab saadud andmete põhjal spetsialist. Vastus võib olla kas positiivne või negatiivne.

Positiivne ELISA

Tulemus loetakse positiivseks, kui uuringu käigus tuvastati veres IgG ja IgM klassi immunoglobuliine. Esitatud komponentide olemasolu viitab järgmiste haiguste arengule:

• süüfilis;
• viiruslikku tüüpi hepatiit;
• CMVI (tsütomegaloviirus);
• herpes;
• tuulerõuged;
• stafülokokkide ja streptokokkide põhjustatud haigused;
• klamüüdia.

Süüfilise tekkega leitakse spetsiifilisi antikehi veres 14 päeva pärast nakatumist. Nende arvu järgi määrab spetsialist haiguse käigu raskusastme. Süüfilise aktiivne ravi kõrvaldab kõik bakterid 6 kuu pärast. Kui ravi ei toimu, kulub keha täielikuks taastumiseks vähemalt 1,5 aastat.

ELISA analüüs tuvastab viiruslikku tüüpi hepatiidi isegi inkubatsiooniperioodil, enne esimeste sümptomite ilmnemist.

CMVI on tavaline patoloogia, mis esineb igal kolmandal inimesel. Elanikkonnale see ohtu ei kujuta, nakatumine toimub emakas.

Tavaliselt ei leidu inimkehas herpesviiruse vastaseid antikehi. Nende avastamisel on tavaks diagnoosida haiguse äge faas.

Tuulerõugete tekkega leitakse inimese veres spetsiifilisi IgM immunoglobuliine. Nad suudavad kehas püsida 2 aastat pärast patoloogia täielikku kõrvaldamist.

Streptokokkide ja stafülokokkide põhjustatud haiguste kindlakstegemiseks võimaldab ELISA kahekordne test. Uuel uurimisel suureneb spetsiifiliste antikehade tase kiiresti.

Klamüüdia arengut näitab kõrge immunoglobuliini tase – 1:8 ja üle selle. Indikaator võib varieeruda sõltuvalt haiguse progresseerumisest.

Tähelepanu: teatud patoloogilise protsessi arengu kinnitamiseks määrab spetsialist täiendavaid laboratoorseid ja instrumentaalseid uuringuid. Põhjalik uuring võimaldab teil määrata tõhusa raviskeemi.

Negatiivne ELISA

Negatiivse tulemuse korral ei tuvastata inimese veres spetsiifilisi IgM-klassi immunoglobuliine. Võib-olla on IgG olemasolu, antikehad võimelised jääma kehasse pärast haigusi, bakteriaalset ja viiruslikku tüüpi. Mõnel juhul püsib nende esinemine vereseerumis aastakümneid.

Tähelepanu: ainult kogenud spetsialist saab analüüsi tulemusi õigesti dešifreerida.

Vastuste iseõppimine põhjustab enamikul juhtudel katseid diagnoosida ja määrata vale ravi ilma arsti osaluseta. Sellist mõju peetakse ideaalseks patoloogilise protsessi edasiseks progresseerumiseks.