Молекулярное профилирование опухоли – шаг к персонифицированному лечению рака. Молекулярный тест гена CYP2D6. Медуллярный рак щитовидной железы

Завершаем цикл статей об онкологических заболеваниях.
Сегодня подробно расскажет, что такое молекулярное тестирование и как оно влияет на постановку диагноза.

На фото: Владислав Милейко, руководитель направления ,
биомедицинский холдинг «Атлас».

Чтобы понять, как работает молекулярная диагностика и какое место она занимает в онкологии, нужно сначала разобраться в механизмах, происходящих в опухоли.

Молекулярные процессы в опухоли

Мутации в протоонкогенах и генах-супрессорах, отвечающие за деление и смерть клетки, приводят к тому, что клетка перестает следовать инструкции и синтезирует белки и ферменты неправильно. Молекулярные процессы выходят из-под контроля: клетка постоянно делится, отказывается умирать и копит генетические и эпигенетические мутации. Поэтому злокачественные новообразования часто называют болезнью генома.

В клетках опухоли могут происходить сотни тысяч мутаций, но только несколько из них способствуют росту, генетическому разнообразию и развитию опухоли. Они называются драйверными (driver). Остальные мутации, «пассажирские» (passanger), сами по себе не делают клетку злокачественной.

Драйверные мутации создают различные популяции клеток, что обеспечивает разнообразие опухоли. Эти популяции или клоны по-разному реагируют на лечение: некоторые из них устойчивы и приводят к рецидиву. К тому же разная чувствительность клонов к терапии может привести к радикальному изменению молекулярного профиля в ходе лечения: даже незначительные в начале популяции клетки могут получить преимущество и стать доминирующими в конце лечения, что приведет к устойчивости и развитию опухоли.

Молекулярная диагностика

Драйверные мутации, изменения в количестве или структуре белков используют в качестве биомаркеров - мишеней, по которым подбирают лечение. Чем больше мишеней известно, тем более точным может быть выбор из потенциально эффективных схем лечения.

Отделить драйверные мутации от остальных и определить молекулярный профиль опухоли непросто. Для этого применяется технология секвенирования, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), микросателлитного анализа и иммуногистохимии.

Методы секвенирования нового поколения позволяют выявить драйверные мутации, включая те, что делают опухоль чувствительной к таргетной терапии.

С помощью технологии FISH подкрашивают участки хромосом, на которых расположен определенный ген. Две соединенные разноцветные точки - это химерный или слитый ген: когда в результате перестройки хромосом вместе соединяются участки разных генов. Это может привести к тому, что онкоген попадет под влияние регуляции другого более активного гена. Например, слияние генов EML4 и ALK имеет ключевое значение в случае рака легкого. Протоонкоген ALK активируется под влиянием своего «партнера» по перестройке, что приводит к неконтролируемому делению клеток. Онколог, учитывая перестройку, может применить лекарство, которое будет направлено против активированного продукта гена ALK (Кризотиниб).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

Микросателлитный анализ показывает степень нарушения системы репарации ДНК, а иммуногистохимия - белковые биомаркеры, расположенные на поверхности, в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток.

Все эти исследования входят в новый продукт биомедицинского холдинга «Атлас» - тест Solo. С помощью такого теста онколог получает информацию о молекулярном профиле опухоли и о том, как он влияет на потенциальную эффективность широкого спектра противоопухолевых препаратов.

Специалисты Solo исследуют до 450 генов и биомаркеров, чтобы оценить, как опухоль может ответить на применение более таргетных препаратов для лечения онкологических заболеваний. Для некоторых из них анализ биомаркера продиктован производителем. Для других используют данные клинических исследований и рекомендации международных сообществ онкологов.

Помимо выбора мишеней для таргетной терапии, молекулярное профилирование помогает обнаружить мутации, которые напротив, делают опухоль устойчивой к определенному лечению, или генетические особенности, которые связаны с повышенной токсичностью и требуют индивидуального подбора дозы лекарства.

Для исследований используется материал биопсии или парафинизированные блоки послеоперационного материала.

Молекулярное профилирование дает дополнительную информацию о заболевании, но она не всегда применима для выбора лечения. Например, в ситуациях, когда стандартная терапия обладает достаточной эффективностью или показано хирургическое лечение. Можно определить клинические ситуации когда такое исследование может быть наиболее полезно:

• Редкий вид опухоли;
• Опухоли с неустановленным первичным очагом (неизвестно, где изначально появилась опухоль, давшая метастазы);
• Тех случаев, когда требуется выбор из нескольких вариантов применения таргетной терапии;
• Исчерпаны возможности стандартной терапиии требуется экспериментальное лечение или включение пациента в клинические исследования.

Специалисты проекта Solo консультируют онкологов или пациентов и подсказывают, нужен ли тест в данном случае.

Прецизионная медицина и клинические исследования

Обычно в медицинской практике применяют общие стратегии для лечения пациентов с определенным диагнозом. Для мелкоклеточного рака легкого используется одна стратегия, для немелкоклеточного - другая. Для онкологических заболеваний этот метод подходит не всегда. Из-за различий на молекулярном уровне даже при одном и том же типе опухоли пациенты могут получить неэффективное или лишнее лечение.

С увеличением исследований и изобретением таргетных препаратов, подход к лечению онкологических заболеваний начал меняться. Чтобы увеличить безрецидивный период и продолжительность жизни пациента, нужно учитывать молекулярный профиль опухоли, ответ организма на лекарственные препараты и химиотерапию (фармакогеномика), знать главные биомаркеры.

Прецизионная медицина позволяет существенно улучшить прогноз конкретного пациента, избежать серьезных побочных эффектов онкологических препаратов и значительно повысить качество жизни больного. Но и у этого метода существуют недостатки.

Таргетных препаратов становится все больше, и они имеют два основных ограничения: большинство молекулярно-направленных агентов обеспечивают лишь частичное подавление сигнальных путей и многие из них слишком токсичны для использования в комбинации.

Представьте, что вы архитектор Москвы. Перед вами стоит непростая задача - решить проблему с пробками в час пик, построив один мост. Молекулярные механизмы можно сравнить с движением машин, а мост - главный препарат, который должен решить основную проблему. Кажется, что несколько лекарств (серия мостов), направленные на главные молекулярные нарушения, могут решить эту проблему. Но токсичность препаратов при этом увеличивается и может быть непредсказуемой.

Мы стали лучше понимать молекулярные процессы злокачественных опухолей, но текущие методы внедрения точной онкологии в клиническую практику сильно отстают. Чтобы ускорить изучение таргетной терапии, ученые разработали два новых подхода - Basket и Umbrella.

Суть метода Basket в том, что для исследования выбирают пациентов с определенным биомаркером, независимо от расположения и названия опухоли. В мае 2017 года FDA одобрила такой метод лечения для биомаркера под названием высокая микросаттелитная нестабильность (MSI-H) или дефект восстановления несоответствия (dMMR).

Молекулярные нарушения отличаются не только у разных пациентов, но и в пределах одной опухоли. Гетерогенность - большая проблема в онкологии, для решения которой был разработан дизайн исследования Umbrella. Для метода Umbrella пациентов сначала отбирают по типу злокачественных новообразований, а потом учитывают генетические мутации.

Такие исследования помогают не только собрать информацию о действии таргетных препаратов - иногда это единственная возможность для пациентов, которые не отвечают на стандартное лечение зарегистрированными препаратами.

Клинический пример

Мы решили привести наглядный пример, как может выглядеть использование расширенного молекулярного профилирования.

Пациент с меланомой кожи и метастазами в печени обратился к онкологу. Врач и пациент приняли решение сделать молекулярное профилирование, чтобы получить более полную информацию о заболевании. Пациенту провели биопсию и отправили образцы ткани на исследование. В результате диагностики в опухоли обнаружили несколько важных генетических нарушений:

• Мутация в гене BRAF. Указывает на активацию сигнального пути онкогенов RAS-RAF-MEK, который участвует в дифференцировке и выживаемости клеток.
• Мутация в гене NRAS. Указывает на дополнительную активацию сигнального каскада RAS-RAF-MEK.
• Наследственный вариант гена TPMT. Указывает на особенности метаболизма противоопухолевого препарата «Цисплатин».

Ориентируясь на результаты клинических исследований и рекомендации можно прийти к следующим выводам:

• Потенциально эффективными могут быть препараты класса BRAF-ингибиторов (Вемурафениб), более того, наличие мутации NRAS может служить дополнительным основанием для назначения двойной блокады сигнального каскада - комбинацией с MEK-ингибиторами (Траметиниб).
• Несмотря на то что нет одобренной терапии, направленной непосредственно на онкоген NRAS, известно, что мутации в нем повышают вероятность успешного лечения при назначении иммунотерапии (Ипилимумаб и Пембролизумаб).
• Наследственный генетический вариант в гене TPMT указывает на повышенную индивидуальную токсичность Цисплатина, что требует коррекции дозы при назначении платиносодержащих режимов терапии.

Таким образом, врач получает возможность ориентироваться среди возможных вариантов лечения отталкиваясь не только от клинических параметров пациента, но и учитывая молекулярные особенности опухоли.

Молекулярная диагностика - это не панацея для всех онкологических заболеваний. Но это важный инструмент для онколога, который позволяет подойти к лечению злокачественных опухолей с новой стороны.

Спасибо, что читали и комментировали наши материалы об онкологии. Вот полный список статей.

В РНПЦ онкологии и медрадиологии им. Н. Н. Александрова сегодня выполняется 56 научных проектов, из них 23 связаны с молекулярно-генетическими исследованиями. Проводятся они в Республиканской молекулярно-генетической лаборатории канцерогенеза (онкоотделения генетики, клеточных и биочиповых технологий, вирусологии, иммунологии и протеоники).

Традиционные средства диагностики исчерпывают свой потенциал, - считает заместитель директора по научной работе РНПЦ, член-корреспондент НАН Беларуси, доктор мед. наук, профессор Сергей Красный. - Пришло время использовать такой резерв, как молекулярно-генетические исследования. Они дают возможность с высокой точностью тестировать опухоли для определения химиочувствительности, по генетическому портрету пациента устанавливать наследственный характер заболевания и целенаправленно действовать на опережение, назначая адресное лечение.

В 2016 году через РНПЦ прошло около 10 000 пациентов, примерно 7 000 из них были выполнены молекулярно-биологические исследования; масштабное профилирование опухоли для индивидуализации терапии было проведено примерно сотне человек. На основании молекулярно-биологических маркеров выполнялась диагностика опухолей ЦНС, мягких тканей и костей, лимфомы, велись исследования по оценке наследственных рисков развития злокачественных новообразований, мониторингу концентрации лексредств в жидкостях организма для индивидуальной коррекции дозы препарата, разрабатывались и внедрялись технологии клеточной терапии.

Для внедрения достижений молекулярной биологии в отечественную клинику уже получены первые международные сертификаты, приобретено современное оборудование для выполнения методик флуоресцентной in situ гибридизации, молекулярного секвенирования, полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуногистохимии, хромато-масс-спектрометрии, проточной цитометрии, иммуноферментного анализа.

Биолог Виктория Майорова проводит пробоподготовку образцов к проведению ПЦР-реакции.

Новые разработки

Метод оценки прогноза клинического течения рака мочевого пузыря посредством комплексного анализа клинико-морфологических параметров опухоли и молекулярно-генетического статуса гена FGFR3.

На основе этого анализа была создана модель молекулярных путей патогенеза рака мочевого пузыря. В зависимости от наличия определенной мутации патология может развиваться двумя путями: так называемый поверхностный рак, характеризующийся низкой злокачественностью и благоприятным прогнозом (мутации в генах FGFR3 и HRAS); более агрессивный мышечно-инвазивный рак, рано дающий метастазы и характеризующийся неблагоприятным прогнозом (мутации в генах TP53 и RUNX3).

С помощью этого метода была выделена группа пациентов с очень высоким риском прогрессирования заболевания, у которых выявлены мутации в генах TP53 и RUNX3. Это важно для прогноза течения заболевания и определения степени агрессивности лечения. Зная, что у пациента опухоль будет развиваться как поверхностная, после лечения в основном будет контролироваться мочевой пузырь.

Если же предполагается прогрессирование заболевания, то в отношении метастазирования будет отслеживаться состояние других внутренних органов. Кроме того, могут быть определены пациенты, которым надо немедленно выполнять радикальное удаление мочевого пузыря, иначе разовьются метастазы.

Неинвазивный комплексный метод молекулярно-генетической и лучевой диагностики рака предстательной железы.

Такое обследование должно проводиться, когда пациенту с высоким уровнем простат-специфического антигена (ПСА) в крови выполнена первичная биопсия, которая оказалась отрицательной. Обычно спустя полгода выполняется еще одна биопсия, следом еще одна (и так 10–15 раз), однако это агрессивное исследование, так что требовалось решение, позволяющее ограничиться только одним подобным вмешательством. Ученые нашли выход. Благодаря определению в моче экспрессии онкогена PCA3 и химерного гена TMPRSS2-ERG можно выделять пациентов, которым действительно необходимо выполнять биопсию (у остальных можно повременить).

Разработка и внедрение метода трансплантации тканеинженерных дыхательных путей с их поражением опухолевой или рубцовой этиологии.

Речь идет о категории пациентов, которые умирают в течение 2–5 месяцев. Был предложен метод децеллюляризации трупной трахеи, по сути, с приготовлением матрицы, затем заселением ее хондроцитами и после этого - эпителиоцитами. Кроме того, технология предусматривает реваскуляризацию трахеи с последующей трансплантацией пациентам. Все это делается с целью замещения дефекта трахеи после удаления опухоли либо рубца. В настоящее время проведены 3 операции. Все пациенты живут уже более полугода - это считается обнадеживающим результатом.

Врач лабораторной диагностики Стукалова Ирина Владимировна и старший фельдшер-лаборант Пищик Наталия Захаровна производят подготовку анализатора для выделения ДНК вируса папиломы человека.

Совместно с Институтом генетики и цитологии НАН Беларуси запланирована тема «Протеомные и молекулярно-генетические исследования стволовых опухолевых клеток (СОК) колоректального рака для разработки новых методов направленной клеточной терапии» (программа Союзного государства «Стволовая клетка - 2»).

На модели, устойчивой к 5-фторурацилу клеточной линии колоректального рака, планируется изучить роль СОК в механизмах опухолевой прогрессии и подобрать возможные молекулярные мишени направленного воздействия на СОК методами клеточной терапии на основе вакцин с использованием дендритных клеток и/или дендритных клеток и лимфокин-активированных киллеров. Это будет новый этап в иммунотерапии злокачественных опухолей.

Биолог Игорь Северин в криобанке опухолевых клеточных линий.

Еще один проект - «Разработка технологии выявления риска онкологических заболеваний на основе молекулярно-генетических и эпигенетических маркеров» (программа Союзного государства «ДНК-идентификация»). Планируется разработать инновационную ДНК-технологию, позволяющую определить молекулярно-генетические и эпигенетические маркеры риска рецидивирования или прогрессирования заболевания у пациентов с колоректальным раком. По оценкам специалистов, новая технология позволит вовремя провести профилактическое лечение и предотвратить появление метастазов.

Перспективным направлением исследований становится изучение эпигенетических механизмов регуляции, т. е. процессов, которые не затрагивают структуру генов, однако изменяют их уровень активности. Одним из них является РНК-интерференция - механизм подавления экспрессии генов на этапе трансляции, когда РНК синтезируется, но не проявляет себя в белке. И если обнаруживается высокий уровень экспрессии какой-то микроРНК, можно предположить, что именно в этом органе имеется проблема.

Семейство генов микроРНК составляет немногим более 1 % от всего генома человека, но регулирует экспрессию почти трети всех генов. Ряд выполняемых научных проектов посвящен изучению микроРНК при различных опухолях. В отделении разрабатывается неинвазивный метод диагностики герминогенных опухолей яичка, основанный на определении в крови экспрессии панели микроРНК. Это же семейство молекул, кроме диагностики заболеваний, используется для прогнозирования течения онкозаболеваний и для выбора индивидуальной лекарственной терапии.

Задача исследования - определить маркеры неблагоприятного прогноза (можно выделить группу таких пациентов и подобрать дополнительное лечение). Также важно определить спектр микроРНК. Он будет свидетельствовать о чувствительности к определенным схемам химиотерапии (речь о РМЖ, для которого найдена панель маркеров).

Изучая молекулярные характеристики в ходе лечения, можно корректировать схему лечения при появлении дополнительных мутаций. Метод называется «жидкой» биопсией: по анализу крови можно следить за генетическими изменениями и гораздо раньше предполагать прогрессирование развития заболевания.

Препараты для терапии дорогостоящие и высокотоксичные, поэтому важно на ранних этапах определить резистентность к лексредству и найти замену.

Молекулярное профилирование предполагает определение генетических нарушений, характерных для каждой конкретной опухоли, поскольку известно, что одни и те же нозологические формы различаются по молекулярным характеристикам. Знать молекулярный портрет опухоли необходимо и для прогнозирования течения онкопроцесса и индивидуализации лечения. Персонализированный подход к назначению цитостатических препаратов и средств направленной терапии у онкопациентов с учетом молекулярных биомаркеров чувствительности и токсичности обеспечивает наиболее точный подбор лексредств.

В рамках молекулярного профилирования опухолей на основании масштабного анализа данных мировых публикаций разработаны многоплатформенные панели биомаркеров РМЖ, рака яичников, колоректального рака, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, предназначенные для выбора системной противоопухолевой терапии.

Химик Колос Ольга Константина запускает синтез олигонуклеотидов.

Нужно ли расширять географию исследований?

Анна Портянко ,

заведующая Республиканской

молекулярно-генетической

лабораторией канцерогенеза,

доктор мед. наук:

На современном этапе из группы глиобластом выделили варианты, которые характеризуются разным прогнозом. С морфологической точки зрения легко перепутать глиобластому и анапластическую олигодендроглиому: при окраске гематоксилином-эозином они выглядят практически одинаково. Но благодаря генетическим тестам мы находим отличия. Более того, это рутинно выполняется в нашем патологоанатомическом отделении.

Подобным образом «размножились» и лимфомы. Например, благодаря молекулярно-генетическому тестированию было выделено несколько лимфом из лимфомы Ходжкина. Раньше на основании гематоксилин-эозиновой гистологии их классифицировали как лимфому Ходжкина, а когда появился молекулярно-генетический анализ по Т-клеточным рецептором, выяснилось, что это фолликулярная Т-клеточная лимфома.

Как это сказывается на лечении? Прежде всего, можно дать более точный прогноз. Если у человека глиобластома, то медиана выживаемости составляет 1 год, а если речь об анапластической олигодендроглиоме, то 10 лет.

Мы развиваем связи с зарубежными специалистами из лучших европейских научных центров. Вместе с коллегами из Германии пытаемся развить важные направления протеомики - анализ не одного белка, а протеома в целом. Создан весь цикл начиная от цитологического препарата, есть система лазерной микродиссекции на базе микроскопа, которая позволяет из большой опухоли выделить именно опухолевые клетки, сделать после этого масс-спектрометрию и определить спектр всех белков в этой опухоли.

Нужно ли расширять географию исследований? Думаю, для страны достаточно иметь один такой центр - Республиканскую молекулярно-генетическую лабораторию канцерогенеза, где можно оперативно выполнять все необходимые молекулярно-биологические исследования (в т. ч. с гистологическим материалом, полученным из областей).

У нас есть возможность проводить не только гистологическую диагностику, но и предварительную диагностику с помощью проточного цитофлуориметра. Буквально в течение часа после того, как у человека удалили лимфатические узлы, мы можем предварительно сказать, есть ли лимфома (и если да, то какая). Это большое подспорье для клиницистов.

Биолог Анастасия Пашкевич загружает образцы в генетический анализатор.

Чего опасалась Анджелина Джоли?

Мы изучаем генетические поломки, возникающие в процессе развития опухоли, - рассказывает заведующая онкологическим отделением генетики Республиканской молекулярно-генетической лаборатории канцерогенеза Елена Субоч. - Актуальное направление - оценка наследственных рисков развития онкозаболеваний. Наследственные формы опухолей составляют 1–2 % всех онкопатологий, и здесь должны применяться особые схемы лечения и оперативного вмешательства. Важная цель выявления семейных опухолевых синдромов - идентификация еще здоровых родственников пациента, у которых имеются патогенные мутации. В итоге можно разработать комплекс мероприятий, направленных на предотвращение неблагоприятного исхода онкопатологии.

На слуху пример: американская актриса Анджелина Джоли, имеющая мутацию в гене BRCA1, увеличивающую риск развития РМЖ, пошла на радикальную операцию, чтобы предотвратить возникновение злокачественной опухоли.

Ученые Республиканской молекулярно-генетической лаборатории канцерогенеза занимаются этой патологией.

По гранту Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований в 2015–2017 годах была выполнена работа «Система аллельной дискриминации мутационного статуса генов BRCA1 и BRCA2 при злокачественных новообразованиях молочной железы человека». Проведено популяционное исследование, и оказалось, что частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 составляет примерно 2,5 % среди женщин (частотный спектр мутаций отличается от того, что наблюдается у жителей соседних стран).

Для каждой популяции типичен свой спектр генетических нарушений. Зная характерные мутации, можно в первую очередь протестировать их, а потом уже искать другие варианты. Результатом выполнения научного проекта стала разработка системы аллельной дискриминации мутационного статуса генов BRCA1/BRCA2 с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделили 5 основных мутаций, которые встречаются у белорусских женщин.

Специалисты онкологического отделения генетики также тестируют большую панель маркеров, позволяющую оценить риск развития рака яичников, эндометрия, щитовидной железы, почки, колоректального рака, меланомы, полипозных синдромов.

На сегодня имеются новые международные классификации опухолей головного мозга и лимфом, требующие обязательного проведения молекулярно-генетических исследований. Поэтому в отделениях генетики и клеточных технологий разрабатывается алгоритм диагностики таких заболеваний с использованием биомаркеров.

«Мы редко можем отказаться от своей любимой
клинической гипотезы и продолжаем лечить больных так,
как лечили их на протяжении многих десятков лет…
Между тем, настало время для смены существующих парадигм».

Richard Schilsky, президент ASCO

«Для самых тяжелых болезней нужны самые сильные лекарства, точно применяемые...»
Гиппократ

Прогноз при лечении рака зависит от клинической стадии заболевания (TNM), биологии опухоли и проведенного лечения. Современные достижения клинической онкологии неоспоримы. И все же, несмотря на очевидные успехи в создании новых противоопухолевых препаратов, каждый день тысячи онкологических больных принимают лекарства, которые им не помогают. Для некоторых пациентов эмпирическое лечение будет полезным и безопасным. Однако для множества других больных терапия может оказаться и бесполезной, и токсичной.

К концу 90-х гг. ХХ ст. цитотоксическая химиотерапия достигла предела своих возможностей. Развитие молекулярной биологии и ориентация на персонифицированную медицину привели к принципиально новому подходу в лечении больных c использованием молекулярных таргетных препаратов нового поколения. Блокада пролиферации раковой клетки была достигнута с помощью селективной ингибиции ее основных сигнальных путей – лигандов, мембранных рецепторов, внутриклеточных белков.
Однако, несмотря на очевидные успехи нового подхода, в конце первого десятилетия постгеномной эры возникла настоятельная необходимость пересмотра и этой, новой, лечебной парадигмы, что было обусловлено большим количеством клинических неудач в связи с развитием приобретенной резистентности опухоли.

Мишени таргетной терапии и механизмы резистентности
Наиболее целостный взгляд на развитие и эволюцию рака был представлен в двух хрестоматийных статьях D. Hanaan and R. Weinberg (Cell, 2000, 2011). Исходя из характеристик, мишенями терапии должны быть не только раковые клетки с их нестабильным геномом, особым типом метаболизма, активным неоангиогенезом и приобретенной способностью уклоняться от сигналов роста, циркулировать в кровотоке и метастазировать. Мишенями терапии должны быть также опухолевое микроокружение, стволовые клетки рака, а также все компоненты метастатического каскада.
Очевидно, что реализовать такую программу в рамках лечебного протокола для конкретного пациента просто невозможно, даже при использовании комбинации нескольких таргетных препаратов. Одно лекарство, даже с уникальным молекулярным механизмом действия, не может быть эффективным для лечения генетически гетерогенной прогрессирующей опухоли, в которой появляются и закрепляются многочисленные механизмы резистентности.
Частные механизмы резистентности к различным таргетным препаратам хорошо изучены. К ним относятся активация альтернативных EGFR-путей, способствующих выживанию клетки в ответ на ее лекарственное повреждение, формирование онкогенного bypass и аутокринной петли, потеря внеклеточного домена мембранного рецептора (формирование усеченного рецептора – truncated), перепрограммирование кинома, аутофагия, эпителиально-мезенхимальный переход, эпигенетические механизмы и др.
Во время прогрессии и под влиянием терапии в опухоли появляются дополнительные онкогенные мутации, меняется ее молекулярный ландшафт и развивается нестабильность генома, что сегодня принято называть геномным хаосом (W. George, Jr. Sledge, 2011).
Не только раковые клетки характеризуются индивидуальностью и изменчивостью. Кроме эпителиальных клеток изменения происходят также в опухоль-ассоциированной строме. Стромальные клетки также подвержены молекулярной эволюции, хотя и являются генетически более стабильным компонентом солидной опухоли.
Микроокружение, состоящее из доброкачественных клеток стромы, клеток иммунной системы и клеток воспаления, также влияет на эволюцию злокачественного клона и формирование вторичной резистентности к терапии.

Гетерогенность как причина неэффективности противоопухолевой терапии

Основной причиной низкой эффективности эмпирической терапии является опухолевая гетерогенность.
В течение многих десятилетий гистологи классифицировали рак по морфологическим признакам, описывая различные типы раковых клеток и их взаимоотношение со стромой опухоли.
Методы молекулярного анализа, особенно быстро развивающиеся в постгеномной эре, показали истинные масштабы опухолевой неоднородности.

Индивидуальная (интертуморальная) гетерогенность
Микрочиповая технология анализа уровня экспрессии тысяч генов позволила вначале (2000 г.) классифицировать рак грудной железы (РГЖ) на люминальный А, люминальный В, HER/2 и базальный. Несколько позже уточнение молекулярной таксономии с акцентом на базальные раки выявило дополнительные подтипы. Среди них выделяют такие, как Сlaudin-low (характерна экспрессия генов, аналогичная стволовым клеткам молочной железы), подтипы мезенхимальных опухолей (гены, регулирующие эпителиально-мезенхимальный переход), подтипы апокринных опухолей с экспрессией андрогенных рецепторов и активацией соответствующего сигнального пути, подтипы с активностью генов, регулирующих иммунный ответ.
Дальнейшие молекулярные исследования РГЖ были связаны с реализацией проекта METABRIC (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium). Было установлено, что на геномный ландшафт опухоли могут влиять такие молекулярные события, как точечные мутации, инсерции, делеции, амплификации, дупликации, транслокации и инверсии. При этом оказалось, что соматическим мутациям могут подвергаться как гены, не связанные с канцерогенезом, так и гены, мутации которых при развитии рака встречаются часто (GATA3, TP53 и PIK3CA). Кроме повреждения генома при РГЖ были обнаружены различные эпигеномные нарушения (метилирование ДНК), повреждения на уровне транскрипции и микроРНК. В результате данных исследований только при люминальном А подтипе были классифицированы еще 10 различных молекулярных интегративных кластеров, влияющих на исход заболевания. Установлено также, что все четыре «основные» подклассы и новые «дополнительные» молекулярные подтипы РГЖ имеют разные профили чувствительности к противоопухолевым препаратам.
Молекулярно-генетические классификации, влияющие на особенности лечения, создаются для рака желудка, колоректальной карциномы, рака яичника и других локализаций.

Внутриопухолевая (интратуморальная) гетерогенность
Значительно большую фундаментальную проблему онкологии представляет внутриопухолевая гетерогенность. Сосуществование в опухоли нескольких субклонов с различными наборами молекулярных аберраций и различной чувствительностью к лекарственным препаратам делает неэффективными стратегии подавления одной фракции клеток по отношению ко всей опухоли. Дополнительным неблагоприятным фактором является изменение биологии опухоли во время ее развития.
Внутриопухолевую гетерогенность принято разделять на пространственную (географическую) и временную (эволюционную).
Пространственная неоднородность предполагает присутствие молекулярно-генетических различий в отдельных регионах опухоли, генетические различия между первичной опухолью и ее метастазами, а также различия между метастазами разных анатомических локализаций.
В зависимости от уровня генетической гетерогенности наблюдаются моногеномные (одинаковые генетические профили в различных географических районах) и полигеномные опухоли (различные субклональные популяции клеток в различных отделах).
Принципиальные изменения в геноме во время развития опухоли происходят в трех временных точках: в момент перехода cancer in situ в инвазивный рак, во время медленной эволюции первичного инвазивного рака и во время метастатической прогрессии.
Есть много причин полагать, что рак ведет себя как открытая нестабильная экосистема, развитие которой зависит от давления окружающих факторов, таких как действие иммунной системы и гипоксии. На формирование эволюционной (временной) гетерогенности первичной опухоли активно влияет также проводимое противоопухолевое лечение.
В солидной опухоли всегда существует редкий субклон клеток критической важности, определяющий окончательный исход заболевания. Смерть пациента чаще всего наблюдается в результате воздействия на организм того клона клеток, который в момент первичного диагноза не был доминирующим и представлял не более 1% от всех клеток опухоли. Наличие таких клеток было доказано на примере злокачественной миеломы, рака предстательной железы и при опухолях других локализаций. Анализ серийных биопсий, выполненных многократно на протяжении всей истории заболевания (от момента первичной диагностики до смерти больного) показал, что выживший в результате терапии клон клеток не был доминирующим вначале и получил свое развитие после лекарственной элиминации других, «основных», быстро пролиферирующих клонов.
Выявление и ликвидация этого смертельного клона клеток, приводящего к гибели пациентов, является необходимой терапевтической стратегией.

Неоднородность опухоли на уровне клетки
Большинство современных исследований молекулярных аберраций было проведено на клетках, представляющих основную популяцию опухоли. При этом выявлялись структурные изменения ДНК, происходящие на ранних стадиях развития опухоли и приводящие к вспышкам геномной эволюции (так называемые «большие мутационные часы»). Недостатком этих методик было то, что в процессе исследований не учитывалось наличие редких субклонов с уникальными генетическими мутациями, скрытых в общей массе основных клеток. Именно в этих клетках происходит постепенное накопление точечных мутаций, способствующих обширной субклональной генетической дивергенции («малые мутационные часы»).
В настоящее время этот недостаток (исследование опухоли на уровне одного, ведущего, злокачественного клона) пытаются преодолеть. Современные методы молекулярного профилирования позволяют это сделать. Установлено, что в опухоли имеются т.н. «мутации-драйверы» и «мутации-пассажиры». Мутации-драйверы придают селективное преимущество роста клеткам, несущим такие мутации. Мутации-пассажиры такого эффекта не имеют.
Обычно только мутации-водители были объектом исследований в качестве терапевтических мишеней. Однако в последнее время внимание исследователей привлекают и мутации-пассажиры, поскольку от них зависят такие эффекты, как индукция иммунного ответа и протеотоксический стресс. Мутации-пассажиры также могут быть объектом противоопухолевых стратегий.
Накопление многочисленных мутаций, являющееся характерным для опухолей с геномной и хромосомной нестабильностью, может завершиться мутационным кризисом. При превышении оптимального порога геномной нестабильности происходит нарушение жизнеспособности и снижение численности элементов всей системы.

Методы анализа опухолевой ткани
Методы молекулярного анализа опухолевой ткани чрезвычайно разнообразны и находятся далеко за пределами классической гистологии. Сегодня эти методы включают: метод микроматриц, саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, вестерн-блоттинг, гибридизацию in situ, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), обратнотранскриптазную ПЦР в режиме реального времени, иммуногистохимию, иммунофлуоресцентную микроскопию, мальди-масс-спектрометрию.
Анализ опухолевой клетки можно провести на уровне генома (флуоресцентная гибридизация in situ, спектральное кариотипирование, сравнительная геномная гибридизация), транскрипции (технология микроматриц: профилирование экспрессии генов и РНК), протеома (двумерный гелевый электрофорез, масс-спектрометрия, поверхностно-усиленная лазерная десорбционная ионизация в режиме TOF: технология матриц + масс-спектрометрия).
Молекулярная томография тканей опухоли позволяет осуществлять визуализацию пространственного распределения белков, пептидов, лекарственных соединений, метаболитов, а также молекулярных предиктивных биомаркеров.
Молекулярному анализу должны подвергаться ткани первичной солидной опухоли, ткани реализовавшихся гематогенных метастазов (быстро растущих и клинически значимых), а также циркулирующие опухолевые клетки и циркулирующая опухолевая ДНК (показатель наличия «дремлющих» метастазов). Биопсия опухоли и метастазов должна выполняться из различных географических участков одной и той же солидной опухоли. Считается, что более информативной (и безопасной) является liquid-биопсия.

От эмпирической к персонифицированной терапии
Опухоль, являясь открытой нестабильной биологической системой, не только демонстрирует индивидуальную гетерогенность, но и изменяет свои молекулярные характеристики на протяжении всей эволюции, и особенно – во время метастатической прогрессии. Изменениям подвергаются как основные, так и недоминирующие клоны клеток солидной опухоли, а также клетки опухолевого микроокружения.
Для подавления пролиферации всех клеток опухоли используется стратегия комбинированной терапии. Впервые концепцию комбинированного (одновременного или последовательного) лечения более 30 лет назад предложили Goldie и Coldman. Концепция объединяла такие понятия, как рост опухоли, увеличение в ней частоты мутаций, появление устойчивых клонов клеток и развитие резистентности.
Сегодня стратегия современной терапии рака включает использование комбинаций цитостатиков, цитостатиков и таргетных препаратов и даже комбинации двух таргетных препаратов (ингибиторов тирозинкиназ и моноклональных антител). В основе этой стратегии лежит подавление опухоли с помощью лекарственных препаратов, воздействующих на пул основных, быстро пролиферирующих клеток. Жизненный цикл этих клеток определяется активностью мутаций-водителей. В целом же устойчивость системы объясняется множеством факторов, в том числе активностью мутаций-пассажиров, роль которых в терапевтических протоколах не учитывается.
Стратегия персонифицированной терапии, являющаяся сегодня основной парадигмой противоопухолевого лечения, учитывает постоянно изменяющийся ландшафт всего «опухолевого поля»: гетерогенность клонов первичной солидной опухоли, гетерогенность циркулирующих опухолевых клеток, а также фенотипическую и метаболическую гетерогенность «спящих» раковых клеток в многочисленных метастатических нишах костного мозга и висцеральных органов.

Caris Molecular Intelligence Services
Идея выявления индивидуальных предиктивных онкомаркеров, которые могли бы предсказать результаты противоопухолевой терапии, возникла в 2008 г., когда профессор Daniel D. Von Hoff создал уникальную лабораторию Caris Molecular Intelligence Services (CША). Сегодня для молекулярного профилирования тканей опухоли в лаборатории используется комбинация методов – IHC, CISH, FISH, Next-Generation Sequencing, Sanger Sequencing, Pyro Sequencing, PCR (cobas ®), Fragment Analysis.
За несколько лет молекулярная томография в этой лаборатории выполнена 65 тыс. пациентов при более чем 150 гистопатологических подтипах злокачественных опухолей. Комплексный подход, основанный на использовании не одного метода (например, только иммуногистохимического), а комбинации молекулярных методов, позволяет выявлять индивидуальные предиктивные онкомаркеры конкретного пациента и на основании этого анализа принимать решения о проведении персонифицированной терапии.
Экспрессия одних белков (или амплификация генов) требует назначения соответствующих препаратов, экспрессия других белков – исключает назначение того или иного препарата. Так, экспрессия TOPO1 является предпочтительной для назначения иринотекана, экспрессия RRM1 – для назначения гемцитабина, экспрессия MGMT является основанием для назначения темозоламида или дакарбазина, экспрессия TOPO2A с одновременной амплификацией HER2 позволяет проводить терапию доксорубицином, липосомальным доксорубицином и эпирубицином.
Для назначения трастузумаба, помимо выявления экспрессии/амплификации HER/2, с целью прогнозирования резистентности к препарату, необходимо исследовать PTEN (IHC) и PIK3CA (NGS).
С другой стороны, экспрессия TS требует избегать назначения флуороурацила, капецитабина, пеметрекседа; экспрессия SPARC (IHC), TLE3 (IHC), Pgp (IHC) требует избегать назначения доцетаксела, паклитаксела, наб-паклитаксела.
При такой комбинации онкомаркеров, как ER (IHC), HER2 (IHC), HER2 (CISH), PIK3CA (NGS), не следует назначать эверолимус и темсиролимус.
Комбинация современных методов биологической визуализации позволяет выявлять молекулярные предиктивные онкомаркеры для каждого известного цитосатика или таргетного препарата, применяющегося сегодня в клинической онкологии. Подобный подход, основанный сначала на проведении молекулярного профилирования тканей опухоли, выявлении в ней индивидуальных предиктивных онкомаркеров и только потом – выработке плана лечебной стратегии, получил доказательства в ряде клинических исследований. Одно из них – Bisgrove Study, в котором принимали участие TGen, Scottsdale Healthcare and Caris Dx.
Дизайн этого исследования был революционно новым. Учитывая тот факт, что каждая опухоль является индивидуальной, авторы дизайна исследования отказались от рандомизации больных на многочисленные группы, исходя из анатомической локализации опухоли или только одного иммуногистохимического признака. В данном исследовании не было групп сравнения – каждый пациент выступал в качестве собственного контроля.
Всего в исследовании принимали участие 66 больных из 9 онкологических центров США: 27% – РГЖ, 17% – КРР, 8% – РЯ, 48% – другие локализации. Все пациенты до включения в исследование получали терапию по поводу метастатического рака по общепринятым стандартам – всего от 2 до 6 линий. После последней прогрессии продолжали терапию, основанную на молекулярном профилировании.
Результаты исследования показали, что время до прогрессирования у больных РГЖ увеличилось на 44%, при КРР – на 36%, при РЯ – на 20%, при прочих локализациях – на 16%. Следует учесть, что у всех пациентов на момент включения в исследование развилась вторичная резистентность к лекарственной терапии, и общепринятых рекомендаций по их дальнейшему лечению не было. Таким образом, сделан вывод, что для агрессивных, редких опухолей, а также прогрессирующих опухолей с развившейся резистентностью, альтернативы молекулярному профилированию и персонификации лечения не существует.

Смена дизайна клинических исследований
Отдельно следует отметить, что парадигма персонифицированной терапии в онкологии активно меняет общепринятый дизайн клинических исследований. Все громче звучат голоса о том, что результаты клинических трайлов, основанные на рандомизации и стратификации пациентов на многочисленные популяции и когорты, следует пересмотреть с учетом индивидуальной интра- и интертуморальной гетерогенности. Как результат, дизайн современных клинических исследований становится все более персонифицированным.
Примером таких новейших современных дизайнов являются Master protocols, Basket trials, Adaptive trial design и, наконец, N-of-1 studies. Основная идея новых дизайнов следующая. Спонсорами исследования выступают одновременно несколько фармацевтических компаний, имеющих для терапии рака данной локализации препараты с различными мишенями и различным молекулярным механизмом действия. В исследование включаются больные после проведения возможно полного молекулярного профилирования опухоли. Участвуя в одном исследовании, пациент, в зависимости от наличия у него соответствующих белков-мишеней, может получать поочередно наиболее эффективные препараты. Во время терапии может проводиться индивидуальная адаптация препарата по дозе или использоваться cocktailmix из комбинации различных препаратов, необходимость в которых появилась во время лечения. Опухолевая прогрессия и токсичность не являются основанием для прекращения лечения, а только для смены вида терапии. На клиническое решение влияют результаты молекулярного профилирования опухоли, которое проводится сразу же после опухолевой прогрессии или очередного курса терапии. Таким образом, в процессе исследования пациент может получать совсем не тот препарат, который ему был первоначально назначен.
Наконец, уже существуют трайлы только для одного пациента – N-of-1 studies. Этот дизайн наиболее подходит парадигме персонифицированной терапии. Подобный подход позволит в ближайшем будущем создавать индивидуальные препараты для терапии рака.
Однако, уже и сегодня протоколы персонифицированной терапии, основанные на молекулярном профилировании опухоли, широко используются в клинической практике ведущих онкологических центров США, Европы, Японии, позволяя получать клинические результаты нового уровня. В числе подобных мировых центров – Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Center for Personalized Genetic Medicine at Harvard, Institute for Personalized Medicine at MD Anderson, Center for Personalized Health Care at the Ohio State University.
С января 2014 г. молекулярное профилирование тканей опухоли на основе платформы Caris Molecular Intelligence Services доступно в Украине. Это стало возможным благодаря компании Амакса Фарма (AmaxaPharma), которая является официальным партнером компании Caris Life Sciences в области проведения молекулярного профилирования опухолевой ткани в странах Восточной Европы. С января 2014 года благодаря такому сотрудничеству молекулярное профилирование Molecular Intelligence в Украине уже прошли десятки пациентов с редкими опухолями, при которых отсутствуют стандарты терапии, а также онкологические больные с первичной и приобретенной химиорезистентностью. Получены первые результаты, которые существенно отличаются от результатов эмпирического подхода.
Возможность осуществления молекулярного профилирования в нашей стране позволила вплотную приблизиться к решению проблемы персонифицированного лечения рака.

Заключение
Опухолевая неоднородность имеет глубокие клинические последствия для онкологических пациентов. Для принятия правильных клинических решений необходимо иметь наиболее целостную картину биологии раковой клетки и ее микроокружения. Молекулярное профилирование тканей первичной опухоли, гематогенных метастазов, циркулирующих опухолевых клеток и клеток метастатической ниши позволяет сделать большой шаг к реализации программы персонифицированного лечения рака.

СТАТТІ ЗА ТЕМОЮ Онкологія та гематологія

06.01.2019 Онкологія та гематологія Променева діагностика раку яєчника: можливості сучасних діагностичних зображень Применение микафунгина в гематологии

Инвазивные грибковые инфекции (ИГИ) повышают заболеваемость, смертность, длительность госпитализации и связанные с ней затраты у онкогематологических больных с тяжелым иммунодефицитом. У этих пациентов имеется большое количество взаимосвязанных факторов риска развития ИГИ, таких как нарушенные анатомические барьеры, супрессия иммунного ответа, индуцированная химиотерапией нейтропения, почечная или печеночная недостаточность, гипергликемия и реакция трансплантата против хозяина, а также лечение антибиотиками широкого спектра действия или кортикостероидами, установка центральных венозных катетеров....

06.01.2019 Онкологія та гематологія Резолюція засідання Ради експертів із проблеми тромбоцитопенії у практиці онкологів та гематологів

Тромбоцитопенії – ​це група захворювань і синдромів, об’єднаних спільною ознакою: наявністю геморагічного синдрому, що розвивається в результаті зниження числа кров’яних пластинок у периферичній крові <150×109/л....

Источник: Материалы третьей ежегодной Российской онкологической конференции
29 ноября - 1 декабря 1999 года, Санкт-Петербург

ПЕРСПЕКТИВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В ОНКОЛОГИИ. К.П. Хансон
НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова

Достижения генетики и молекулярной биологии последних десятилетий оказали огромное влияние на понимание природы инициализации и прогрессии злокачественных образовании. Окончательно установлено, что рак представляет собой гетерогенную группу заболеваний, каждое из которых вызывается комплексом генетических нарушений, определяющих свойство неконтролируемого роста и способность к метастазированию. Эти современные знания открыли принципиально новые возможности в диагностике и лечении злокачественных новообразований.

Влияние конкретных генетических нарушений, лежащих в основе опухолевого роста, позволило обнаружить специфические молекулярные маркеры и разработать на их основе тесты ранней диагностики опухолей.

Известно, что неопластические трансформация клеток происходит в результате накопления наследуемых (герминативных) и приобретенных (соматических) мутаций в протоонкогенах или генах-супрессорах . Именно эти генетические нарушения с первую очередь могут быть использованы для обнаружения злокачественных клеток в клиническом материале.

Наиболее подходящим субстратом молекулярной диагностики является ДНК, т.к. она длительно сохраняется в образцах тканей и может быть легко размножена с помощью т.н. полимеразной цепной реакции (ПЦР) . Это позволяет осуществлять диагностику даже при наличии минимального количества исследуемого материала.

Помимо определения мутаций в онкогенах и генах-супрессорах в диагностических целях используют изменения, выявляемые в повторяющихся последовательностях ДНК , т.н. микро сателлитах.

При сравнении парных образцов опухоли и нормальных тканей может быть выявлено выпадение одного из аллелей в опухоли (потеря гетерозиготности (ПГ), что отражает наличие хромосомных делеций, лежащих в основе инактивации генов-супрессоров.

Рак грудной железы (РГЖ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний в Украине. По данным Национального канцер-регистра Украины, стандартизованный показатель заболеваемости РГЖ в 2009 г. составляет 60,5 случая на 100 тыс. женского населения. Хотя заболеваемость злокачественными новообразованиями грудных желез постоянно повышается, смертность от них имеет тенденцию к снижению .

РГЖ - это неоднородная группа опухолей, отличающихся по морфологии, клиническому течению и чувствительности к лечению. Однако даже гистологически аналогичные опухоли имеют разную естественную историю, что обусловлено определенной ограниченностью морфологической классификации РГЖ. Исследование экспрессии генов клетками РГЖ и их корреляции с фенотипическими проявлениями позволили выделить ряд биологических подтипов РГЖ, которые определяют естественную историю, клинические, патологические и молекулярные свойства опухоли, а также являются ключевыми факторами, предрешающими прогноз течения и эффективность системной лекарственной терапии. Использование в повседневной клинической практике трудоемких и дорогостоящих методик генетического анализа невозможно. Изучение корреляции между экспрессией генов и иммуногистохимическими маркерами в опухоли позволило выделить ряд так называемых молекулярных субтипов РГЖ, определение которых возможно в рутинной клинической практике. На основе иммуногистохимического исследования экспрессии клетками карциномы грудной железы рецепторов к эстрогену и прогестерону (ER и PR), а также рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (Hеr2/neu, ErbB2), РГЖ можно классифицировать на 4 молекулярных подтипа, которые отличаются между собой по прогнозу течения и ответом на медикаментозную терапию . Молекулярные подтипы РГЖ, которые имеют принципиальное клиническое значение, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Иммуногистохимический фенотип молекулярных подтипов РГЖ

Выделяют люминальный, HER2+ и трижды негативный (ТН) молекулярные подтипы РГЖ. К люминальным относятся опухоли, экспрессирующие рецепторы к ER и PR, и в зависимости от экспрессии Hеr2/neu их классифицируют на А (не экспрессируют Hеr2/neu) и Б (экспрессируют Hеr2/neu). HER2+ называются опухоли с гиперэкспрессией Hеr2/neu и отсутствием ER и РR. Опухоли, негативные по 3 выше названным признакам, относятся к ТН (базальноподобному) РГЖ. Установлено, что люминальные типы связаны с менее агрессивным течением и хорошим прогнозом по сравнению с HER2+ и ТН РГЖ . ТН подтип связан с высокой частотой мутации BRCA1 , агрессивным течением, отсутствием реакции на гормонотерапию и трастузумаб, низкой общей и безрецидивной выживаемостью .

Корреляция между иммуногистохимическими маркерами и чувствительностью опухоли к медикаментозному лечению хорошо изучена и лежит в основе клинических рекомендаций по адъювантному лечению РГЖ. Однако количество исследований, в которых бы оценивали взаимосвязь между молекулярными подтипами и клинико-биологическими характеристиками РГЖ, ограничено.

Целью данного популяционного исследования является изучение распространенности, клинико-морфологических особенностей, общей и безрецидивной выживаемости больных РГЖ в зависимости от молекулярного портрета.

Материалы и методы

Подбор пациентов

В исследование включено 350 больных РГЖ в возрасте от 23 до 76 лет (средний возраст - 53±1,7 года), которые находились на лечении в клинике кафедры онкологии Национального медицинского университета имени А.А. Богомольца на базе хирургического отделения Киевского городского клинического онкологического центра с 1 января 2005 г. по 31 декабря 2006 г.

У всех пациенток регистрировали возраст на момент установления диагноза, менструальную функцию, определяли размер, гистологический тип и степень дифференциации опухоли, а также наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах (РЛУ).

Размер опухоли оценивали после измерения ее максимального диаметра и классифицировали согласно Международной TNM-классификации (5-е издание, 1997 г.) как Т1 (<2 см), Т2 (2–5 см), Т3 (≥5 см). Отсутствие менструаций у больных в течение 1 года до момента установления диагноза расценивалось как менопауза. Гистологический тип и степень дифференциации опухоли определяли в соответствии с национальными стандартами диагностики и лечения злокачественных новообразований, основанных на рекомендациях ведущих международных организаций. Для оценки метастатического поражения РЛУ из послеоперационного материала макроскопически отбирали 10 подозреваемых на наличие метастазов лимфатических узлов, из которых готовили гистологические препараты для микроскопического изучения.

Молекулярные подтипы РГЖ устанавливали на основании результатов иммуногистохимического исследования экспрессии ER, РR и Hеr2/neu. Все опухоли разделили на 4 подтипа: люминальний А (Luminal A) - ER+ и/или PR+, Hеr2/neu-, люминальний Б (Luminal B) - ER+ и/или PR+, Hеr2/neu+, HER2+ (ER- и PR-, Hеr2/neu+), ТН (Triple negative) - ER- и PR-, Hеr2/neu-.

Все больные получили адъювантную системную и лучевую терапию согласно национальным стандартам лечения РГЖ. Однако при гиперэкспрессии Hеr2/neu ни одна из пациенток, включенных в данное исследование, в адъювантном режиме не получала трастузумаб.

Иммуногистохимическое исследование

С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4–5 микрон, которые помещали на стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином. Затем материал исследовали по общепринятой стандартной методике с использованием следующих антител: ER - клон 1D5, PgR - клон 636, Hеr2/neu - клон СВ11.

Интерпретацию результатов иммуногистохимической реакции проводили с использованием качественной оценки ядерной реакции: отрицательная «-», слабо положительная «+», умеренно положительная «++», выражено положительная «+++» - и количественной системы оценки реакции в процентах окрашенных опухолевых клеток.

При определении экспрессии Hеr2/neu отмечали выраженность окраски цитоплазматической мембраны: реакция «-», «+» - отсутствие гиперэкспрессии, реакция «+++» - гиперэкспрессия Hеr2/neu. Наличие гиперэкспрессии Hеr2/neu в случаях реакции «++» оценивали с помощью метода гибридизации in situ с использованием флюоресцентной метки FISH (fluorescence in situ hybridization - флюоресцентная in situ гибридизация). Исследования проводили в патогистологической лаборатории Киевского городского клинического онкологического центра (заведующая лабораторией - доктор медицинских наук Л.М. Захарцева).

Статистический анализ

Статистическую достоверность различий между клинико-биологическими особенностями молекулярных типов РГЖ оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (analysis of variance - ANOVA). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости (р) <0,05.

Общую и безрецидивную выживаемость определяли с помощью метода Каплана - Мейера.

Все статистические расчеты проводили с помощью программы MS Exсel.

Результаты

В результате проведенного исследования всех больных на основе данных иммуногистохимического исследования экспрессии ER, РR и Hеr2/neu разделили на 4 группы: люминальний А - 152 (57,5%) пациентки, ТН - 49 (26,5%), люминальний Б - 28 (9%) и HER2+ - 15 (7%) женщин.

Клинико-биологические характеристики различных молекулярных типов РГЖ представлены в табл. 2.

Таблица 2. Клинико-биологические характеристики молекулярных подтипов РГЖ

Примечания: *дольково-протоковая карцинома; **слизистая, медуллярная, папиллярная карцинома.

Статистически значимой достоверности различий в стадии заболевания между исследуемыми группами не выявлено, что свидетельствует об однородном распределении больных в группах по данному критерию.

Частота выявления различных молекулярных подтипов РГЖ статистически достоверно зависит от следующих клинико-морфологических характеристик: возраста и менструальной функции на момент установления диагноза, гистологического типа и степени дифференциации опухоли. У больных в возрасте 40–49 лет достоверно чаще диагностируют HER2+ и ТН подтипы РГЖ (34,5 и 34% случаев соответственно). Почти у половины пациенток (48%) с ТН молекулярным типом диагноз установлен в пременопаузе. У больных, которые на момент диагностирования находились в менопаузе, чаще других встречается люминальний А (63%) и люминальный Б (68%) типы РГЖ.

Также статистически значимые различия между иммуногистохимическими подтипами наблюдали при различных гистологических типах и степени дифференциации опухоли. Дольковые карциномы чаще диагностировали при люминальном А (19%) и ТН (16%) типах. Протоковый РГЖ регистрировали в 84 и 92% случаев HER2+ и люминального Б молекулярных подтипах соответственно. Дольково-протоковую, слизистую, медуллярную и папиллярную карциному одинаково часто выявляют при люминальных и ТН типах РГЖ, однако в данном исследовании не зафиксировано ни одного случая вышеперечисленных гистологических вариантов при типе HER2+. В исследуемых группах высокодифференцированные (G1) опухоли определяют с одинаковой частотой. Умереннодифференцированные (G2) карциномы грудной железы характерны для люминального А (82%) и Б (86%), а также HER2+ (80%) типов. У 28% пациенток из группы ТН РГЖ выявлены низкодифференцированные (G3) опухоли.

Статистически достоверной взаимозависимости между иммуногистохимическим фенотипом РГЖ и размером первичной опухоли, а также статусом РЛУ не установлено, что наряду со стадией заболевания свидетельствует о равномерном распределении больных в исследуемых группах по этим показателям.

Результаты анализа 5-летней общей и безрецидивной выживаемости пациенток с различными молекулярными типами РГЖ представлены на рис. 1 и 2, а также в табл. 3 и 4 соответственно.

Рис. 1.

Рис. 2.

Таблица 3. Общая выживаемость пациенток в зависимости от молекулярного типа РГЖ

Таблица 4. Безрецидивная выживаемость пациенток в зависимости от молекулярного типа РГЖ

Общая выживаемость наиболее высокая у пациенток с люминальным А (74%) типом РГЖ, а наиболее низкая - при HER2+ и люминальном Б (58 и 57% соответственно).

5-летняя безрецидивная выживаемость хуже у больных люминальным Б и ТН РГЖ (42 и 45% соответственно) по сравнению с пациентками с люминальным А иммуногистохимическим подтипом.

Обсуждение

Результаты настоящего исследования подтверждают вариабельность РГЖ, которая заключается в наличии различных молекулярных типов данной нозологической формы. Разделение РГЖ на биологические подтипы, которые имеют собственную естественную историю, находит все большее применение в повседневной клинической практике, так как позволяют определить прогноз течения заболевания и являются ключевым фактором для выбора тактики системной медикаментозной терапии . Тем не менее классификация на молекулярные типы не заменяет, а скорее дополняет важные традиционные прогностические критерии, такие как возраст и состояние менструальной функции на момент установления диагноза, размер и степень дифференциации опухоли, наличие метастазов в РЛУ, а также выявление сопутствующей патологии.

Определение молекулярных типов РГЖ на основе имммуногистохимической оценки экспрессии ER, РR и Hеr2/neu является недорогим и достаточно информативным, но вместе с тем упрощенным методом диагностики. Благодаря внедрению новых маркеров молекулярная классификация претерпевает изменения, что позволяет повысить ее прогностическую достоверность. Так, например, при высокой митотической активности клеток (Кі-67 >14%) опухоли с люминальным А фенотипом, согласно рекомендациям Сент-Галленского конгресса по лечению РГЖ (2011 г.), отнесены к люминальному Б Her2/neu-негативному молекулярному подтипу. Необходимость выделения люминального Б Her2/neu-негативного типа РГЖ продиктована особенностями естественной истории этих опухолей, которая больше сходна с естественной историей люминальных Б, чем люминальных А опухолей. Поэтому пациенткам с ER+ и/или PR+, Her2/neu- РГЖ при высокой митотической активности опухоли, которая определяет плохой прогноз течения заболевания, перед назначением антигормональной терапии показано проведение адъювантной полихимиотерапии .

Полученные в данном популяционном исследовании результаты свидетельствуют о том, что частота выявления различных молекулярных типов РГЖ, определенных на основе имммуногистохимической оценки экспрессии ER, РR и Hеr2/neu, неодинакова. Чаще всего встречается люминальный А (57,5%) молекулярный подтип РГЖ, вторым по частоте является ТН (26,5%), потом люминальный Б (9%) и HER2+ (7%) типы.

Люминальный А иммуногистохимический тип РГЖ в большинстве случаев диагностируют у пациенток после 50 лет, которые находятся в менопаузе. Данный вариант РГЖ чаще других характеризуется дольчатым гистологическим типом и умеренной степенью дифференциации опухоли. 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость больных с этим молекулярным типом РГЖ наиболее высокая и составляет 74 и 62% соответственно.

ТН РГЖ чаще выявляют у больных в возрасте от 40 до 60 лет независимо от состояния менструальной функции, для него характерен дольчатый гистологическим тип в 16% случаев, и в 28% данные опухоли являются низкодифференцированными. По сравнению с люминальным А типом у больных ТН РГЖ 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость ниже и составляет 60 и 45% соответственно.

Люминальный Б молекулярный тип, как и люминальный А, чаще диагностируют у женщин после 50 лет, которые находятся в постменопаузе. Более чем в 80% случаев это умереннодифференцированная протоковая карцинома. У пациенток с люминальным Б РГЖ - наименьшая 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость и составляет 58 и 42% соответственно.

HER2+ тип, как и ТН, чаще возникает у пациенток в возрасте от 40 до 60 лет независимо от статуса менструальной функции, практически всегда является умереннодифференцированной карциномой. 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость одинаковая и составляет 57%.

Итак, наиболее благоприятным молекулярным подтипом РГЖ с точки зрения прогноза течения является люминальный А. Неблагоприятное клиническое течение люминального Б и HER2+ типов, возможно, связано с отсутствием терапии трастузумабом.

Список использованной литературы

1. Бюллетень Национального канцер-регистра № 12. «Рак в Україні, 2009–2010», Киев: 2011.

2. Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B. et al. (2000) Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 406(6797): 747–752.

3. Sorlie T., Perou C.M., Tibshirani R. et al. (2001) Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19(98): 10869–10874.

4. Sorlie T., Tibshirani R., Parker J. et al. (2003) Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14(100): 8418–8423.

5. Sotiriou C., Neo S.Y., McShane L.M. et al. (2003)Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 18(100): 10393–10398.

6. Carey L.A., Perou C.M., Livasy C.A. et al. (2006) Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study. JAMA, 21(295): 2492–2502.

7. Foulkes W.D., Stefansson I.M., Chappuis P.O. et al. (2003) Germline BRCA1 mutations and a basal epithelial phenotype in breast cancer. J. Natl. Cancer Inst., 19 (95): 1482–1485.

8. Liu H., Fan Q., Zhang Z. et al. (2008) Basal-HER2 phenotype shows poorer survival than basal-like phenotype in hormone receptor-negative invasive breast cancers. Hum. Pathol., 2 (39): 167–174.

9. Goldhirsch A., Wood W.C., Coates A.S. et al. (2011) Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann. Oncol., 8(22): 1736–1747.

Молекулярні типи раку грудної залози, визначені на основі імуногістохімічних маркерів: клініко-біологічні особливості та прогноз перебігу

І.Б. Щепотін¹, О.С. Зотов¹, Р.В. Любота¹, М.Ф. Анікусько², І.І. Любота²

¹Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, Київ

2 Київський міський клінічний онкологічний центр

Резюме. Рак грудної залози - неоднорідна група пухлин, які відрізняються етіологією, морфологічною картиною, клінічним перебігом і чутливістю до проведеного лікування. Метою даного популяційного дослідження було вивчення поширеності, клініко-морфологічних особливостей, загальної та безрецидивної виживаності хворих на РГЖ залежно від молекулярного типу. Обстежено 350 пацієнток із РГЖ у віці від 23 до 76 років (середній вік - 53±1,7 року), які проходили лікування в клініці кафедри онкології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця на базі хірургічного відділення Київського міського клінічного онкологічного центру в 2005–2006 рр. Виявлено ​статистично значущі відмінності між молекулярним типом РГЖ та клініко-морфологічними особливостями, а саме: вік і статус менструальної функції на момент встановлення діагнозу, гістологічний тип і ступінь диференціювання пухлини, а також загальна та безрецидивна виживаність хворих.

Ключові слова: рак грудної залози, молекулярні типи, прогноз перебігу, клініко-морфологічні особливості.

Molecular types of breast cancer, established on the basis of immunohistochemical markers: clinical and biological characteristics and prognosis

I.B. Schepotin¹, A.S. Zotov¹, R.V. Lіubota¹, N.F. Anikusko², I.I. Lіubota²

¹A.A. Bogomolets National Medical University, Kyiv

2 Kyiv municipal clinical oncological centre

Summary. Breast cancer (BC) is heterogeneous group of tumors that has different etiology, morphological pattern, clinical course and sensitivity to the treatment. The aim of this study was to investigate population prevalence, clinical and morphological features, general and disease-free survival of patients BC depending on the molecular type. The study involved 350 patients with BC aged 23 to 76 years (mean age 53±1,7 years.) They were treated in the clinic of the Department of Oncology A.A. Bogomolets National Medical University, based on the surgical department of the Kyiv City Clinical Cancer Center in 2005–2006 years. A statistically significant difference between type BC molecular and morphological features, namely age and status of menstrual function at the time of diagnosis, histological type and degree of tumor differentiation, as well as general and disease-free survival of patients.

Key words: breast cancer, molecular types, prognosis, clinical and morphological features.