ओके के एटियलजि को समझने और परिणामों के मूल्यांकन में बैक्टीरियोलॉजिकल, वायरोलॉजिकल, सीरोलॉजिकल स्टडीज के लिए संकेतों का निर्धारण। वायरोलॉजिकल रिसर्च क्या है रिसर्च का मतलब

साइटों का संग्रह इंटरनेट आर्काइव वेबैक मशीन बहुत बार काले पीआर लोगों का हमला आपके लिए अप्रत्याशित रूप से आता है। इस मामले में, आपको पहली बार दुश्मन का बारीकी से अध्ययन करने की आवश्यकता का सामना करना पड़ रहा है। यदि आपने घटनाओं के इस तरह के विकास को भी मान लिया है (उदाहरण के लिए, में

4.9. टाइम मशीन के साथ बैकअप

4.9. टाइम मशीन मैक ओएस एक्स तेंदुए के साथ बैक अप लेने से आप टाइम मशीन एप्लिकेशन का उपयोग करके नियमित रूप से अपने कंप्यूटर का बैक अप ले सकते हैं। उपयुक्त सेटिंग्स के बाद, एप्लिकेशन अपने आप हो जाएगा

4.9.2। Time Machine के साथ अपना पहला बैकअप बनाएं

4.9.2। Time Machine का उपयोग करके अपना पहला बैकअप बनाएं अपना पहला बैकअप बनाना शुरू करने से पहले, आपको या तो एक बाहरी ड्राइव डालना होगा या केवल बैकअप के लिए एक मुफ्त हार्ड ड्राइव विभाजन अलग रखना होगा।

4.9.4. टाइम मशीन का उपयोग करना

4.9.4. Time Machine का उपयोग करना एक बार जब आप आवश्यक Time Machine सेटिंग्स बना लेते हैं और कई बैकअप बना लेते हैं, तो आप अपनी फ़ाइलों के पुराने संस्करणों को खोजना और पुनर्स्थापित करना शुरू कर सकते हैं। इसके लिए: 1. एक खोजक विंडो खोलें और उस फ़ाइल का चयन करें जिसे आपको पुनर्स्थापित करने की आवश्यकता है।2। यदि एक

विषाणुओं के जीव विज्ञान और उनकी पहचान के अध्ययन के तरीके। वायरोलॉजी में, आणविक जीव विज्ञान के तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जिसकी मदद से वायरल कणों की आणविक संरचना को स्थापित करना संभव था, वे कोशिका में कैसे प्रवेश करते हैं और वायरस के प्रजनन की विशेषताएं, वायरल न्यूक्लिक एसिड की प्राथमिक संरचना और प्रोटीन। वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन अमीनो एसिड के घटक तत्वों के अनुक्रम को निर्धारित करने के तरीके विकसित किए जा रहे हैं। न्यूक्लिक एसिड के कार्यों और उनके द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन को न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम से जोड़ना और इंट्रासेल्युलर प्रक्रियाओं के कारणों को स्थापित करना संभव हो जाता है जो वायरल संक्रमण के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

वायरोलॉजिकल अनुसंधान विधियां भी प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रक्रियाओं (एंटीबॉडी के साथ एक एंटीजन की बातचीत), वायरस के जैविक गुणों (हेमाग्लगुटिनेट करने की क्षमता, हेमोलिसिस, एंजाइमेटिक गतिविधि), मेजबान सेल के साथ वायरस की बातचीत की विशेषताओं पर आधारित हैं। साइटोपैथिक प्रभाव की प्रकृति, इंट्रासेल्युलर समावेशन का गठन, आदि)।

वायरल संक्रमण के निदान में, वायरस की खेती, अलगाव और पहचान के साथ-साथ टीके की तैयारी में ऊतक और कोशिका संवर्धन की विधि का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। प्राथमिक, द्वितीयक, स्थिर सतत और द्विगुणित कोशिका संवर्धन का उपयोग किया जाता है। प्राथमिक संस्कृतियों को प्रोटीयोलाइटिक एंजाइम (ट्रिप्सिन, कोलेजेनेज) के साथ ऊतक को फैलाकर प्राप्त किया जाता है। कोशिकाओं का स्रोत मानव और पशु भ्रूण के ऊतक और अंग (अक्सर गुर्दे) हो सकते हैं। पोषक माध्यम में कोशिकाओं का निलंबन तथाकथित गद्दे, बोतलों या पेट्री डिश में रखा जाता है, जहां, पोत की सतह से जुड़ने के बाद, कोशिकाएं गुणा करना शुरू कर देती हैं। वायरस के संक्रमण के लिए, आमतौर पर एक सेल मोनोलेयर का उपयोग किया जाता है। पोषक तत्व तरल निकाला जाता है, वायरल निलंबन कुछ कमजोर पड़ने में पेश किया जाता है, और कोशिकाओं के संपर्क के बाद, ताजा पोषक माध्यम जोड़ा जाता है, आमतौर पर सीरम के बिना।

अधिकांश प्राथमिक संस्कृतियों की कोशिकाओं को उपसंस्कृत किया जा सकता है और उन्हें द्वितीयक संस्कृतियों के रूप में संदर्भित किया जाता है। कोशिकाओं के आगे बढ़ने के साथ, फ़ाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं की आबादी बनती है, जो तेजी से प्रजनन करने में सक्षम होती हैं, जिनमें से अधिकांश गुणसूत्रों के मूल सेट को बनाए रखती हैं। ये तथाकथित द्विगुणित कोशिकाएँ हैं। कोशिकाओं की क्रमिक खेती में, स्थिर सतत कोशिका संवर्धन प्राप्त होते हैं। मार्ग के दौरान, गुणसूत्रों के हेटरोप्लोइड सेट के साथ सजातीय कोशिकाओं को तेजी से विभाजित करते हुए दिखाई देते हैं। स्थिर सेल लाइनें मोनोलेयर और सस्पेंशन हो सकती हैं। मोनोलेयर कल्चर कांच की सतह पर एक सतत परत के रूप में विकसित होते हैं, निलंबन संस्कृतियां आंदोलनकारियों का उपयोग करके विभिन्न जहाजों में निलंबन के रूप में विकसित होती हैं। 40 विभिन्न पशु प्रजातियों (प्राइमेट, पक्षी, सरीसृप, उभयचर, मछली, कीड़े) और मनुष्यों सहित 400 से अधिक सेल लाइनें हैं।

कृत्रिम पोषक माध्यमों में व्यक्तिगत अंगों और ऊतकों (अंग संस्कृतियों) के टुकड़ों की खेती की जा सकती है। इस प्रकार की संस्कृतियां ऊतक संरचना को संरक्षित करती हैं, जो विषाणुओं के अलगाव और पारित होने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो अविभाजित ऊतक संस्कृतियों (उदाहरण के लिए, कोरोनविर्यूज़) में प्रजनन नहीं करते हैं।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में, सेल आकारिकी, साइटोपैथिक क्रिया में परिवर्तन द्वारा वायरस का पता लगाया जा सकता है, जो विशिष्ट हो सकता है, समावेशन की उपस्थिति, सेल में वायरल एंटीजन का निर्धारण करके और संस्कृति तरल पदार्थ में; संवर्धन द्रव में विषाणु संतति के जैविक गुणों का निर्धारण और ऊतक संवर्धन, चूजों के भ्रूण या संवेदनशील पशुओं में विषाणुओं का अनुमापन; आणविक संकरण द्वारा कोशिकाओं में व्यक्तिगत वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके साइटोकेमिकल विधि द्वारा न्यूक्लिक एसिड के समूहों का पता लगाना।

वायरस का अलगाव एक श्रमसाध्य और लंबी प्रक्रिया है। यह आबादी के बीच घूम रहे वायरस के प्रकार या प्रकार को निर्धारित करने के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा वायरस के सेरोवेरिएंट की पहचान करने के लिए, पोलियो वायरस के जंगली या वैक्सीन स्ट्रेन, आदि); ऐसे मामलों में जहां तत्काल महामारी विज्ञान के उपाय करना आवश्यक है; जब नए प्रकार या वायरस के प्रकार प्रकट होते हैं; यदि आवश्यक हो, प्रारंभिक निदान की पुष्टि करें; पर्यावरणीय वस्तुओं में वायरस के संकेत के लिए। वायरस को अलग करते समय, मानव शरीर में उनके बने रहने की संभावना के साथ-साथ दो या दो से अधिक वायरस के कारण मिश्रित संक्रमण की घटना को भी ध्यान में रखा जाता है। किसी एक विषाणु से प्राप्त विषाणु की आनुवंशिक रूप से सजातीय जनसंख्या को विषाणु क्लोन कहा जाता है, और इसे प्राप्त करने की प्रक्रिया को क्लोनिंग कहा जाता है।

वायरस को अलग करने के लिए, अतिसंवेदनशील प्रयोगशाला जानवरों के संक्रमण, चिकन भ्रूण का उपयोग किया जाता है, लेकिन ऊतक संस्कृति का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। एक वायरस की उपस्थिति आमतौर पर विशिष्ट कोशिका अध: पतन (साइटोपैथिक प्रभाव), सिम्प्लास्ट और सिंकाइटिया के गठन, इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाने के साथ-साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस, हेमडॉरप्शन, हेमग्लगुटिनेशन (हेमाग्लगुटिनेटिंग वायरस में) आदि का उपयोग करके पता लगाया गया एक विशिष्ट एंटीजन द्वारा निर्धारित किया जाता है। . इन संकेतों का पता वायरस के 2-3 मार्ग के बाद ही लगाया जा सकता है।

कई वायरसों के अलगाव के लिए, जैसे कि इन्फ्लूएंजा वायरस, चिकन भ्रूण का उपयोग किया जाता है, कुछ कॉक्ससेकी वायरस और कई अर्बोवायरस के अलगाव के लिए, नवजात चूहों का उपयोग किया जाता है। सीरोलॉजिकल परीक्षणों और अन्य तरीकों का उपयोग करके पृथक वायरस की पहचान की जाती है।

वायरस के साथ काम करते समय, उनका अनुमापांक निर्धारित किया जाता है। वायरस का अनुमापन आमतौर पर टिशू कल्चर में किया जाता है, जो वायरस युक्त तरल पदार्थ के उच्चतम कमजोर पड़ने का निर्धारण करता है, जिस पर ऊतक अध: पतन होता है, समावेशन और वायरस-विशिष्ट एंटीजन बनते हैं। प्लाक विधि का उपयोग कई विषाणुओं को अनुमापन करने के लिए किया जा सकता है। सजीले टुकड़े, या वायरस के नकारात्मक उपनिवेश, अगर कोटिंग के तहत एकल-परत ऊतक संस्कृति के वायरस-नष्ट कोशिकाओं के केंद्र हैं। कॉलोनी काउंटिंग इस आधार पर वायरस की संक्रामक गतिविधि के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक संक्रामक वायरस कण एक पट्टिका बनाता है। सजीले टुकड़े की पहचान महत्वपूर्ण रंगों के साथ संस्कृति को धुंधला करके की जाती है, आमतौर पर तटस्थ लाल; सजीले टुकड़े डाई को सोखते नहीं हैं और इसलिए सना हुआ जीवित कोशिकाओं की पृष्ठभूमि के खिलाफ हल्के धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। वायरस का अनुमापांक 1 में पट्टिका बनाने वाली इकाइयों की संख्या के रूप में व्यक्त किया जाता है एमएल.

विषाणुओं का शुद्धिकरण और सांद्रण आमतौर पर विभेदक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा किया जाता है, जिसके बाद सांद्रता या घनत्व ग्रेडिएंट्स में सेंट्रीफ्यूजेशन होता है। वायरस को शुद्ध करने के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीके, आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी, इम्यूनोसॉर्बेंट्स आदि का उपयोग किया जाता है।

वायरल संक्रमण के प्रयोगशाला निदान में नैदानिक ​​सामग्री में रोगज़नक़ या उसके घटकों का पता लगाना शामिल है; इस सामग्री से वायरस अलगाव; सेरोडायग्नोसिस प्रत्येक व्यक्तिगत मामले में प्रयोगशाला निदान पद्धति का चुनाव रोग की प्रकृति, रोग की अवधि और प्रयोगशाला की क्षमताओं पर निर्भर करता है। वायरल संक्रमण का आधुनिक निदान एक्सप्रेस विधियों पर आधारित है जो आपको रोग के बाद प्रारंभिक अवस्था में नैदानिक ​​सामग्री लेने के कुछ घंटों बाद प्रतिक्रिया प्राप्त करने की अनुमति देता है। इनमें इलेक्ट्रॉन और प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, साथ ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आणविक संकरण की विधि शामिल है। , आईजीएम वर्ग के एंटीबॉडी का पता लगाना, आदि।

नकारात्मक दाग वाले वायरस की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वायरस के भेदभाव और उनकी एकाग्रता के निर्धारण की अनुमति देती है। वायरल संक्रमण के निदान में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग उन मामलों तक सीमित है जहां नैदानिक ​​​​सामग्री में वायरल कणों की एकाग्रता पर्याप्त रूप से अधिक है (10 5 में 1 एमएलऔर उच्चा)। विधि का नुकसान एक ही टैक्सोनोमिक समूह से संबंधित वायरस के बीच अंतर करने में असमर्थता है। प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इस कमी को समाप्त कर दिया गया है। विधि प्रतिरक्षा परिसरों के गठन पर आधारित है जब वायरल कणों में विशिष्ट सीरम जोड़ा जाता है, जबकि वायरल कणों की एक साथ एकाग्रता होती है, जिससे उन्हें पहचानना संभव हो जाता है। एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए भी विधि का उपयोग किया जाता है। एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक्स के उद्देश्य से, ऊतक के अर्क, मल, पुटिकाओं से तरल पदार्थ और नासोफरीनक्स से स्राव की एक इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म जांच की जाती है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का व्यापक रूप से वायरस के आकारिकी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है; लेबल वाली एंटीबॉडी के उपयोग के साथ इसकी क्षमताओं का विस्तार किया जाता है।

वायरस-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के आधार पर आणविक संकरण की विधि, जीन की एकल प्रतियों का पता लगाना संभव बनाती है और संवेदनशीलता के मामले में इसके बराबर नहीं है। प्रतिक्रिया डीएनए या आरएनए (जांच) के पूरक किस्में के संकरण और डबल-फंसे संरचनाओं के निर्माण पर आधारित है। सबसे सस्ता जांच क्लोन पुनः संयोजक डीएनए है। जांच को रेडियोधर्मी अग्रदूतों (आमतौर पर रेडियोधर्मी फास्फोरस) के साथ लेबल किया जाता है। वर्णमिति प्रतिक्रियाओं का उपयोग आशाजनक है। आणविक संकरण के कई रूप हैं: बिंदु संकरण, धब्बा संकरण, सैंडविच संकरण, स्वस्थानी संकरण, आदि।

एलजीएम वर्ग के एंटीबॉडी कक्षा जी एंटीबॉडी (बीमारी के 3-5 वें दिन) से पहले दिखाई देते हैं और कुछ हफ्तों के बाद गायब हो जाते हैं, इसलिए उनका पता लगाना हाल के संक्रमण का संकेत देता है। IgM वर्ग के एंटीबॉडी का पता एंटी-μ एंटीसेरा (एंटी-IgM हैवी चेन सेरा) का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस या एंजाइम इम्युनोसे द्वारा लगाया जाता है।

वायरोलॉजी में सीरोलॉजिकल तरीके शास्त्रीय प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रियाओं पर आधारित होते हैं (अनुसंधान के इम्यूनोलॉजिकल तरीके देखें) : पूरक निर्धारण प्रतिक्रियाएं, रक्तगुल्म निषेध, जैविक उदासीनीकरण, इम्यूनोडिफ्यूजन, अप्रत्यक्ष रक्तगुल्म, रेडियल हेमोलिसिस, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, एंजाइम इम्यूनोसे, रेडियोइम्यूनोसे। कई प्रतिक्रियाओं के लिए माइक्रोमैथोड्स विकसित किए गए हैं, और उनकी तकनीकों में लगातार सुधार किया जा रहा है। इन विधियों का उपयोग ज्ञात सीरा के एक सेट का उपयोग करके और सेरोडायग्नोसिस के लिए वायरस की पहचान करने के लिए किया जाता है ताकि पहले की तुलना में दूसरे सीरम में एंटीबॉडी में वृद्धि का निर्धारण किया जा सके (पहला सीरम रोग के बाद पहले दिनों में लिया जाता है, दूसरा - बाद में 2-3 सप्ताह)। नैदानिक ​​​​मूल्य दूसरे सीरम में एंटीबॉडी में चार गुना वृद्धि से कम नहीं है। यदि एलजीएम वर्ग के एंटीबॉडी का पता लगाना हाल के संक्रमण का संकेत देता है, तो एलजीसी वर्ग के एंटीबॉडी कई वर्षों तक और कभी-कभी जीवन के लिए बने रहते हैं।

इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग प्रोटीन के पूर्व शुद्धिकरण के बिना जटिल मिश्रणों में वायरस और एंटीबॉडी के व्यक्तिगत एंटीजन की पहचान करने के लिए किया जाता है। विधि एंजाइम इम्युनोसे द्वारा प्रोटीन के बाद के इम्युनोसे के साथ पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके प्रोटीन विभाजन को जोड़ती है। प्रोटीन का पृथक्करण एंटीजन की रासायनिक शुद्धता की आवश्यकताओं को कम करता है और व्यक्तिगत एंटीजन-एंटीबॉडी जोड़े की पहचान करना संभव बनाता है। यह कार्य प्रासंगिक है, उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण के सेरोडायग्नोसिस में, जहां झूठी-सकारात्मक एंजाइम इम्युनोसे प्रतिक्रियाएं कोशिका प्रतिजनों के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के कारण होती हैं, जो वायरल प्रोटीन की अपर्याप्त शुद्धि के परिणामस्वरूप मौजूद हैं। आंतरिक और बाहरी वायरल एंटीजन के लिए रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी की पहचान रोग के चरण को निर्धारित करना संभव बनाती है, और आबादी के विश्लेषण में - वायरल प्रोटीन की परिवर्तनशीलता। एचआईवी संक्रमण में इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग व्यक्तिगत वायरल एंटीजन और एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक पुष्टिकरण परीक्षण के रूप में किया जाता है। आबादी का विश्लेषण करते समय, वायरल प्रोटीन की परिवर्तनशीलता को निर्धारित करने के लिए विधि का उपयोग किया जाता है। विधि का महान मूल्य पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग करके संश्लेषित एंटीजन का विश्लेषण करने, उनके आकार और एंटीजेनिक निर्धारकों की उपस्थिति का निर्धारण करने की संभावना में निहित है।

20) विषाणुओं का मुख्य संरचनात्मक घटक (पूर्ण वायरल कण) एक न्यूक्लियोकैप्सिड है, अर्थात। प्रोटीन म्यान (कैप्सिड) जो वायरल जीनोम (डीएनए या आरएनए) को घेरता है। अधिकांश वायरस परिवारों का न्यूक्लियोकैप्सिड एक लिपोप्रोटीन लिफाफे से घिरा होता है। कुछ वायरस (ऑर्थो-, पैरामाइक्सो-, रबडो-, फिलो- और रेट्रोवायरस) में लिफाफा और न्यूक्लियोकैप्सिड के बीच एक गैर-ग्लाइकोसिलेटेड मैट्रिक्स प्रोटीन होता है, जो विषाणुओं को अतिरिक्त कठोरता देता है। अधिकांश परिवारों के वायरस में एक लिफाफा होता है जो संक्रामकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। जब न्यूक्लियोकैप्सिड नवोदित होकर कोशिका झिल्ली में प्रवेश करता है, तो विषाणु लिफाफे की बाहरी परत का अधिग्रहण कर लेते हैं। लिफाफा प्रोटीन वायरस द्वारा एन्कोडेड होते हैं, और लिपिड कोशिका झिल्ली से उधार लिए जाते हैं। ग्लाइकोप्रोटीन आमतौर पर डिमर और ट्रिमर के रूप में विषाणुओं (ऑर्थो-, पैरामाइक्सोवायरस, रबडो-, फिलो-, कोरोना-, बनिया-, एरिना-, रेट्रोवायरस) की सतह पर पेप्लोमर्स (प्रोट्रूशियंस) बनाते हैं। ग्लाइकोसिलेटेड फ्यूजन प्रोटीन पेप्लोमर्स से जुड़े होते हैं और कोशिका में वायरस के प्रवेश में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। स्व-संयोजन प्रक्रिया के परिणामस्वरूप एक या एक से अधिक प्रकार के प्रोटीन सबयूनिट्स की कई प्रतियों द्वारा कैप्सिड और वायरियन के लिफाफे बनते हैं। कमजोर रासायनिक बंधों के कारण प्रोटीन-प्रोटीन प्रणाली में परस्पर क्रिया, सममित कैप्सिडों के एकीकरण की ओर ले जाती है। विषाणुओं के आकार और आकार में अंतर संरचनात्मक प्रोटीन उप-इकाइयों के आकार, आकार और संख्या और उनके बीच परस्पर क्रिया की प्रकृति पर निर्भर करता है। कैप्सिड में अपेक्षाकृत सरल ज्यामितीय सिद्धांतों के अनुसार, कड़ाई से परिभाषित तरीके से वायरल पॉलीपेप्टाइड्स से इकट्ठे किए गए कई रूपात्मक रूप से व्यक्त सबयूनिट्स (कैप्सोमेरेस) होते हैं। प्रोटीन सबयूनिट, एक दूसरे से जुड़कर, दो प्रकार की समरूपता के कैप्सिड बनाते हैं: आइसोमेट्रिक और पेचदार। ढके हुए विषाणुओं के न्यूक्लियोकैप्सिड की संरचना गैर-लिफाफा वाले विषाणुओं के न्यूक्लियोकैप्सिड की संरचना के समान होती है। वायरस के लिफाफे की सतह पर, रूपात्मक रूप से व्यक्त ग्लाइकोप्रोटीन संरचनाएं - पेप्लोमर्स प्रतिष्ठित हैं। सुपरकैप्सिड झिल्ली की संरचना में लिपिड (20-35% तक) और कार्बोहाइड्रेट (7-8% तक) शामिल हैं, जो सेलुलर मूल के हैं। इसमें लिपिड बायोलेयर के बाहर और अंदर स्थित सेलुलर लिपिड और वायरस-विशिष्ट प्रोटीन की दोहरी परत होती है। सुपरकैप्सिड झिल्ली की बाहरी परत को एक या अधिक प्रकार के पेप्लोमीटर (प्रोट्रूशियंस) द्वारा दर्शाया जाता है, जिसमें एक या अधिक ग्लाइकोप्रोटीन अणु होते हैं। छाए हुए विषाणुओं के न्यूक्लियोकैप्सिड को अक्सर कोर के रूप में संदर्भित किया जाता है, जबकि न्यूक्लिक एसिड वाले विषाणुओं के मध्य भाग को न्यूक्लियॉइड कहा जाता है। कैप्सोमेरेस (पेप्लोमर्स) में एक या कई समरूप या विषम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं (प्रोटीन सबयूनिट्स) से निर्मित संरचनात्मक इकाइयाँ होती हैं। विषाणुओं का वर्गीकरण आइसोमेट्रिक कैप्सिड गोले नहीं हैं, बल्कि नियमित पॉलीहेड्रा (आइकोसाहेड्रोन) हैं। उनके रैखिक आयाम समरूपता के अक्षों के साथ समान हैं। कास्पर और क्लुग (1962) के अनुसार, कैप्सिड्स में कैप्सोमेरेस को इकोसाहेड्रल समरूपता के अनुसार व्यवस्थित किया जाता है। इस तरह के कैप्सिड एक समान सबयूनिट्स से बने होते हैं जो एक इकोसाहेड्रोन बनाते हैं। उनके पास समद्विबाहु त्रिभुज के रूप में 12 शीर्ष (कोने), 30 फलक और 20 पृष्ठ हैं। इस नियम के अनुसार, पोलियोवायरस और पैर और मुंह रोग वायरस का कैप्सिड 60 प्रोटीन संरचनात्मक इकाइयों से बनता है, जिनमें से प्रत्येक में चार पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं होती हैं। icosahedron एक न्यूनतम मात्रा के साथ एक सख्त कॉम्पैक्ट संरचना में दोहराए जाने वाले सबयूनिट्स को पैक करने की समस्या को बेहतर ढंग से हल करता है। केवल संरचनात्मक उपइकाइयों के कुछ विन्यास वायरल आईकोसाहेड्रोन की सतहों, शीर्षों और चेहरों का निर्माण कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एडेनोवायरस के संरचनात्मक सबयूनिट सतहों और चेहरों पर हेक्सागोनल कैप्सोमेरेस (हेक्सॉन) और शीर्ष पर पेंटागोनल कैप्सोमेरेस (पेप्टोन) बनाते हैं। कुछ विषाणुओं में, दोनों प्रकार के कैप्सोमेरेस एक ही पॉलीपेप्टाइड द्वारा बनते हैं, अन्य में, विभिन्न पॉलीपेप्टाइड्स द्वारा। चूँकि विभिन्न विषाणुओं की संरचनात्मक उपइकाइयाँ एक दूसरे से भिन्न होती हैं, कुछ विषाणु अधिक षट्कोणीय प्रतीत होते हैं, अन्य अधिक गोलाकार। चेचक के विषाणुओं के अपवाद के साथ सभी ज्ञात डीएनए युक्त कशेरुकी विषाणु, साथ ही कई आरएनए युक्त विषाणु (7 परिवार) में घन कैप्सिड समरूपता प्रकार होता है। अन्य कशेरुकी विषाणुओं के विपरीत, पुन: विषाणु में एक डबल कैप्सिड (बाहरी और आंतरिक) होता है, प्रत्येक में रूपात्मक इकाइयाँ होती हैं। एक पेचदार समरूपता प्रकार वाले वायरस में एक बेलनाकार फिलामेंटस संरचना का रूप होता है, उनके जीनोमिक आरएनए में एक सर्पिल का रूप होता है और कैप्सिड के अंदर स्थित होता है। पेचदार समरूपता के सभी जंतु विषाणु एक लिपोप्रोटीन लिफाफे से घिरे होते हैं। पेचदार न्यूक्लियोकैप्सिड लंबाई, व्यास, हेलिक्स पिच, और हेलिक्स के प्रति मोड़ कैप्सोमेरेस की संख्या की विशेषता है। इस प्रकार, सेंडाई वायरस (पैरामाइक्सोवायरस) में, न्यूक्लियोकैप्सिड लगभग 1 माइक्रोन लंबा, 20 एनएम व्यास और 5 एनएम की एक हेलिक्स पिच है। कैप्सिड में लगभग 2400 संरचनात्मक इकाइयाँ होती हैं, जिनमें से प्रत्येक एक प्रोटीन है जिसका आणविक भार 60 kD है। हेलिक्स के हर मोड़ पर 11-13 सबयूनिट होते हैं। पेचदार न्यूक्लियोकैप्सिड समरूपता वाले वायरस में, प्रोटीन अणुओं को एक हेलिक्स में तह करना न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन सबयूनिट्स के बीच अधिकतम संपर्क सुनिश्चित करता है। इकोसाहेड्रल वायरस में, न्यूक्लिक एसिड विषाणुओं के अंदर कुंडलित होता है और कैप्सिड के अंदर स्थित एक या एक से अधिक पॉलीपेप्टाइड के साथ संपर्क करता है।

एंटीरिसेप्टर (रिसेप्टर्स) वायरल- सरफेस वायरियन प्रोटीन, उदाहरण के लिए, हेमाग्लगुटिनिन, जो एक अतिसंवेदनशील कोशिका के संबंधित रिसेप्टर के पूरक तरीके से बांधता है।

21) वायरोलॉजिकल रिसर्च में इम्यूनोलॉजिकल तरीके।

सीरोलॉजिकल परीक्षण एंटीबॉडी के अलग-अलग वर्गों का पता लगाने की उनकी क्षमता में भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एग्लूटिनेशन परीक्षण, आईजीएम एंटीबॉडी का पता लगाने में अच्छा है, लेकिन आईजीजी एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए कम संवेदनशील है। पूरक निर्धारण और हेमोलिसिस परीक्षण, जिन्हें पूरक की आवश्यकता होती है, गैर-पूरक-संलग्न एंटीबॉडी का पता नहीं लगाते हैं, जैसे कि IgA एंटीबॉडी और IgE एंटीबॉडी। केवल रोगजनकता से जुड़े विषाणु सतह के एंटीजेनिक निर्धारकों के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी ही वायरस के बेअसर होने की प्रतिक्रिया में भाग लेते हैं। संवेदनशीलता आई एम और। एंटीजन और एंटीबॉडी के अध्ययन के लिए अन्य सभी तरीकों से आगे निकल जाता है, विशेष रूप से, रेडियोइम्यूनोसे और एंजाइम इम्यूनोसे नैनोग्राम और यहां तक ​​कि पिकोग्राम में मापी गई मात्रा में प्रोटीन की उपस्थिति को कैप्चर करने की अनुमति देते हैं। आई एम और की मदद से। समूह का निर्धारण करें और रक्त की सुरक्षा (हेपेटाइटिस बी और एचआईवी संक्रमण) की जांच करें। कपड़े और निकायों के प्रत्यारोपण पर और एम। ऊतक संगतता के निर्धारण और असंगति दमन विधियों के परीक्षण की अनुमति दें। फोरेंसिक चिकित्सा में, कैस्टेलानी प्रतिक्रिया का उपयोग प्रोटीन की प्रजातियों की विशिष्टता और रक्त के प्रकार को निर्धारित करने के लिए एग्लूटीनेशन प्रतिक्रिया को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

संक्रामक रोगों के प्रयोगशाला निदान में इम्यूनोलॉजिकल विधियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। रोग के पहले दिनों में लिए गए नमूने की तुलना में रोग के एटियलजि को रोगज़नक़ के रक्त सीरम में रोगज़नक़ के प्रति एंटीबॉडी में वृद्धि के आधार पर भी स्थापित किया जाता है। आई एम और के आधार पर। इन्फ्लूएंजा जैसे बड़े पैमाने पर संक्रमण के संबंध में जनसंख्या की प्रतिरक्षा का अध्ययन करें, और निवारक टीकाकरण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन भी करें।

उनके तंत्र और परिणामों के खाते के आधार पर I. m. और। एग्लूटिनेशन की घटना के आधार पर प्रतिक्रियाओं में विभाजित किया जा सकता है; वर्षा की घटना पर आधारित प्रतिक्रियाएं; पूरक शामिल प्रतिक्रियाएं; निराकरण प्रतिक्रिया; रासायनिक और भौतिक विधियों का उपयोग करके प्रतिक्रियाएं।

एग्लूटिनेशन की घटना पर आधारित प्रतिक्रियाएं। एग्लूटीनेशन कोशिकाओं या व्यक्तिगत कणों का ग्लूइंग है - इस एंटीजन को प्रतिरक्षा सीरम की मदद से एंटीजन के वाहक।

एक उपयुक्त जीवाणुरोधी सीरम का उपयोग करके जीवाणु समूहन परीक्षण सबसे सरल सीरोलॉजिकल परीक्षणों में से एक है। परीक्षण किए गए रक्त सीरम के विभिन्न कमजोर पड़ने पर बैक्टीरिया का निलंबन जोड़ा जाता है और t ° 37 ° पर एक निश्चित संपर्क समय के बाद यह दर्ज किया जाता है कि रक्त सीरम एग्लूटिनेशन का उच्चतम कमजोर पड़ना होता है। बैक्टीरिया की एग्लूटिनेशन प्रतिक्रिया का उपयोग कई संक्रामक रोगों के निदान के लिए किया जाता है: ब्रुसेलोसिस, टुलारेमिया, टाइफाइड बुखार और पैराटाइफाइड बुखार, बेसिलरी पेचिश और टाइफस।

निष्क्रिय, या अप्रत्यक्ष, रक्तगुल्म की प्रतिक्रिया (RPGA, RNGA)। यह एरिथ्रोसाइट्स या तटस्थ सिंथेटिक सामग्री (उदाहरण के लिए, लेटेक्स कण) का उपयोग करता है, जिसकी सतह पर एंटीजन (बैक्टीरिया, वायरल, ऊतक) या एंटीबॉडी का विज्ञापन किया जाता है। उनका एग्लूटीनेशन तब होता है जब उपयुक्त सीरा या एंटीजन जोड़े जाते हैं।

निष्क्रिय रक्तगुल्म प्रतिक्रिया का उपयोग बैक्टीरिया (टाइफाइड और पैराटाइफाइड, पेचिश, ब्रुसेलोसिस, प्लेग, हैजा, आदि), प्रोटोजोआ (मलेरिया) और वायरस (इन्फ्लूएंजा, एडेनोवायरस संक्रमण, वायरल हेपेटाइटिस बी, खसरा, टिक-जनित) के कारण होने वाले रोगों के निदान के लिए किया जाता है। एन्सेफलाइटिस, क्रीमियन रक्तस्रावी बुखार, आदि), साथ ही कुछ हार्मोन का निर्धारण करने के लिए, रोगी की दवाओं और हार्मोन, जैसे पेनिसिलिन और इंसुलिन के प्रति अतिसंवेदनशीलता की पहचान करने के लिए।

हेमाग्लगुटिनेशन इनहिबिशन टेस्ट (एचआईटीए) वायरस द्वारा एरिथ्रोसाइट्स के हेमाग्लगुटिनेशन के प्रतिरक्षा सीरम की रोकथाम (अवरोध) की घटना पर आधारित है, और इसका उपयोग एंटीवायरल एंटीबॉडी का पता लगाने और शीर्षक देने के लिए किया जाता है। यह इन्फ्लूएंजा, खसरा, रूबेला, कण्ठमाला, टिक-जनित एन्सेफलाइटिस और अन्य वायरल संक्रमणों के सेरोडायग्नोसिस की मुख्य विधि के रूप में कार्य करता है, जिसके प्रेरक एजेंटों में रक्तगुल्म गुण होते हैं। उदाहरण के लिए, टिक-जनित एन्सेफलाइटिस के सेरोडायग्नोसिस के लिए, क्षारीय बोरेट बफर समाधान में रोगी के सीरम के दो गुना कमजोर पड़ने को पैनल के कुओं में डाला जाता है। फिर टिक-जनित एन्सेफलाइटिस एंटीजन की एक निश्चित मात्रा, आमतौर पर 8 एयू (एग्लूटिनेटिंग यूनिट) जोड़ा जाता है, और टी ° 4 ° पर एक्सपोजर के 18 घंटे के बाद, एक अम्लीय फॉस्फेट बफर समाधान में तैयार हंस एरिथ्रोसाइट्स का निलंबन जोड़ा जाता है। यदि रोगी के रक्त सीरम में टिक-जनित एन्सेफलाइटिस वायरस के प्रति एंटीबॉडी हैं, तो एंटीजन बेअसर हो जाता है और एरिथ्रोसाइट एग्लूटिनेशन नहीं होता है।

वर्षा की घटना पर आधारित प्रतिक्रियाएं। घुलनशील एंटीजन के साथ एंटीबॉडी की बातचीत के परिणामस्वरूप वर्षा होती है। वर्षा प्रतिक्रिया का सबसे सरल उदाहरण एक एंटीबॉडी पर एंटीजन लेयरिंग की सीमा पर एक टेस्ट ट्यूब में एक अपारदर्शी वर्षा बैंड का निर्माण है। अर्ध-तरल अगर या agarose जैल (Ouchterlon डबल इम्यूनोडिफ्यूजन विधि, रेडियल इम्यूनोडिफ्यूजन विधि, इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस) में विभिन्न प्रकार की वर्षा प्रतिक्रियाओं का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, जो गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों हैं। उनके इष्टतम अनुपात के क्षेत्र में एंटीजन और एंटीबॉडी के जेल में मुक्त प्रसार के परिणामस्वरूप, विशिष्ट परिसरों का निर्माण होता है - वर्षा बैंड, जो नेत्रहीन या धुंधला हो जाते हैं। विधि की एक विशेषता यह है कि प्रत्येक एंटीजन-एंटीबॉडी जोड़ी एक व्यक्तिगत वर्षा बैंड बनाती है, और प्रतिक्रिया अध्ययन के तहत सिस्टम में अन्य एंटीजन और एंटीबॉडी की उपस्थिति पर निर्भर नहीं करती है।

पूरक से जुड़ी प्रतिक्रियाएं, जो ताजा गिनी पिग सीरम के रूप में उपयोग की जाती हैं, Clq पूरक उपघटक की क्षमता पर आधारित होती हैं और फिर प्रतिरक्षा परिसरों से जुड़ने के लिए अन्य पूरक घटक होते हैं।

पूरक निर्धारण प्रतिक्रिया (आरएससी) आपको एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स द्वारा पूरक निर्धारण की डिग्री के अनुसार एंटीजन या एंटीबॉडी का शीर्षक देने की अनुमति देती है। इस प्रतिक्रिया में दो चरण होते हैं: परीक्षण रक्त सीरम (परीक्षण प्रणाली) के साथ एंटीजन की बातचीत और भेड़ एरिथ्रोसाइट्स (संकेतक प्रणाली) के साथ हेमोलिटिक सीरम की बातचीत। सकारात्मक प्रतिक्रिया के साथ, अध्ययन के तहत प्रणाली में पूरक निर्धारण होता है, और फिर, एंटीबॉडी के साथ संवेदी एरिथ्रोसाइट्स के अतिरिक्त, हेमोलिसिस नहीं देखा जाता है। प्रतिक्रिया का उपयोग उपदंश (वासरमैन प्रतिक्रिया), वायरल और जीवाणु संक्रमण के सेरोडायग्नोसिस के लिए किया जाता है।

न्यूट्रलाइजेशन प्रतिक्रिया मैक्रोमोलेक्यूलर या घुलनशील एंटीजन के कुछ विशिष्ट कार्यों को बेअसर करने के लिए एंटीबॉडी की क्षमता पर आधारित है, जैसे एंजाइम गतिविधि, जीवाणु विषाक्त पदार्थ, और वायरस की रोगजनकता। विषाक्त पदार्थों के बेअसर होने की प्रतिक्रिया का आकलन जैविक प्रभाव से किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, एंटी-टेटनस और एंटी-बोटुलिनम सेरा का शीर्षक दिया जाता है। जानवरों को दिए जाने वाले विष और एंटीसेरम के मिश्रण से उनकी मृत्यु नहीं होती है। विषाणु विज्ञान में न्यूट्रलाइजेशन रिएक्शन के विभिन्न रूपों का उपयोग किया जाता है। जब वायरस को एक उपयुक्त एंटीसेरम के साथ मिलाया जाता है और यह मिश्रण जानवरों या सेल संस्कृतियों को दिया जाता है, तो वायरस की रोगजनकता बेअसर हो जाती है और जानवर बीमार नहीं पड़ते हैं, और संस्कृतियों की कोशिकाएं नष्ट नहीं होती हैं।

रासायनिक और भौतिक लेबल का उपयोग करके प्रतिक्रियाएं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस में फ्लोरोक्रोम-लेबल एंटीबॉडी का उपयोग होता है, अधिक सटीक रूप से, आईजीजी एंटीबॉडी का इम्युनोग्लोबुलिन अंश। फ्लोरोक्रोम-लेबल एंटीबॉडी एंटीजन के साथ एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स बनाता है, जो यूवी किरणों में एक माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन के लिए उपलब्ध हो जाता है जो फ्लोरोक्रोम के ल्यूमिनेसिसेंस को उत्तेजित करता है। प्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया का उपयोग सेलुलर एंटीजन का अध्ययन करने, संक्रमित कोशिकाओं में वायरस का पता लगाने और स्मीयर में बैक्टीरिया और रिकेट्सिया का पता लगाने के लिए किया जाता है।

अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विधि अधिक व्यापक रूप से उपयोग की जाती है। एक ल्यूमिनसेंट एंटी-एलजीजी एंटीबॉडी सेरा का उपयोग करके एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के आधार पर और न केवल एंटीजन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, बल्कि एंटीबॉडी को भी टाइट्रेट किया जाता है।

इम्यूनोएंजाइम, या एंजाइम इम्यूनोलॉजिकल, विधियां एंजाइमों के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित होती हैं, मुख्य रूप से हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज या क्षारीय फॉस्फेट। इम्यूनोफ्लोरेसेंस की तरह, एंजाइम इम्यूनोएसे का उपयोग कोशिकाओं में एंटीजन का पता लगाने के लिए या एंटीजन युक्त कोशिकाओं पर एंटीबॉडी को टाइट्रेट करने के लिए किया जाता है।

रेडियोइम्यूनोलॉजिकल विधि एंटीजन या एंटीबॉडी के रेडियो आइसोटोप लेबल के उपयोग पर आधारित है। यह एंटीजन और एंटीबॉडी का निर्धारण करने के लिए सबसे संवेदनशील तरीका है, जिसका उपयोग हार्मोन, दवाओं और एंटीबायोटिक दवाओं को निर्धारित करने के लिए, बैक्टीरिया, वायरल, रिकेट्सियल, प्रोटोजोअल रोगों के निदान के लिए, रक्त प्रोटीन, ऊतक एंटीजन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग व्यक्तिगत एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने या ज्ञात सीरा से एंटीजन को "पहचानने" के लिए किया जाता है। विधि में 3 चरण होते हैं: पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स (उदाहरण के लिए, एक वायरस) को अलग-अलग प्रोटीन में अलग करना; सक्रिय कागज या नाइट्रोसेल्यूलोज (इलेक्ट्रोब्लॉटिंग) में पॉलीएक्रिलामाइड जेल प्लेट लगाकर जेल से अलग किए गए प्रोटीन को एक ठोस समर्थन (धब्बा) पर स्थानांतरित करना; प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे का उपयोग करके सब्सट्रेट पर वांछित प्रोटीन का पता लगाना। निदान पद्धति के रूप में, एचआईवी संक्रमण के लिए इम्युनोब्लॉटिंग का उपयोग किया जाता है। नैदानिक ​​​​मूल्य वायरस के बाहरी आवरण के प्रोटीन में से एक के लिए एंटीबॉडी का पता लगाना है।

22) सममिति प्रकार के वायरस (घन, पेचदार, मिश्रित)। वायरस जीनोम की पैकेजिंग में प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की परस्पर क्रिया।

न्यूक्लिक एसिड के साथ कैप्सिड की बातचीत के आधार पर, वायरस के कणों को कई प्रकार की समरूपता में विभाजित किया जा सकता है:

1). घन समरूपता प्रकार.

क्यूबिक कैप्सिड लगभग 20 त्रिकोणीय सतहों और 12 शीर्षों के साथ आइकोसाइडर होते हैं। वे एक गोलाकार संरचना जैसी संरचना बनाते हैं, लेकिन वास्तव में यह एक बहुफलक है। कुछ मामलों में, स्पाइक्स नामक विशेष लिपोप्रोटीन संरचनाएं ऐसे आईकोसाहेड्रल पॉलीहेड्रा के शिखर से जुड़ी होती हैं। इन स्पाइक्स की भूमिका संभवतः मेजबान कोशिकाओं के संबंधित क्षेत्रों के साथ वायरियन या वायरल कणों की बातचीत के लिए कम हो जाती है जो उनके प्रति संवेदनशील होते हैं। क्यूबिक समरूपता के साथ, वायरल न्यूक्लिक एसिड को कसकर (एक गेंद में घुमाया जाता है) पैक किया जाता है, और प्रोटीन अणु इसे घेर लेते हैं, जिससे एक पॉलीहेड्रॉन (आइकोसाहेड्रोन) बनता है। एक icosahedron बीस त्रिकोणीय चेहरों वाला एक पॉलीहेड्रॉन है जिसमें घन समरूपता और लगभग गोलाकार आकार होता है। इकोसाहेड्रल वायरस में हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस, रियोवायरस आदि शामिल हैं।

2). सर्पिल समरूपता प्रकार. सर्पिल कैप्सिड कुछ सरल होते हैं। वे। कैप्सिड बनाने वाले कैप्सोमेरेस पेचदार एनके को कवर करते हैं और इन वायरस के काफी स्थिर प्रोटीन शेल भी बनाते हैं। और उच्च-रिज़ॉल्यूशन इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी और उपयुक्त तैयारी विधियों का उपयोग करते समय, आप वायरस पर सर्पिल संरचनाएं देख सकते हैं। कैप्सिड की पेचदार समरूपता के साथ, वायरल न्यूक्लिक एसिड एक पेचदार (या पेचदार) आकृति बनाता है, अंदर खोखला होता है, और प्रोटीन सबयूनिट्स (कैप्सोमेरेस) भी इसके चारों ओर एक सर्पिल (ट्यूबलर कैप्सिड) में ढेर हो जाते हैं। कैप्सिड की पेचदार समरूपता वाले वायरस का एक उदाहरण तंबाकू मोज़ेक वायरस है, जो रॉड के आकार का होता है, और इसकी लंबाई 300 एनएम और व्यास 15 एनएम है। एक वायरस कण में आकार में लगभग 6000 न्यूक्लियोटाइड का एक आरएनए अणु होता है। कैप्सिड एक हेलिक्स में व्यवस्थित 2000 समान प्रोटीन सबयूनिट से बना है।

3) मिश्रित या जटिल प्रकार की समरूपता. एक नियम के रूप में, इस प्रकार की समरूपता मुख्य रूप से जीवाणु विषाणुओं में पाई जाती है। और क्लासिक उदाहरण वे चरण हैं, ई कोलाई या समशीतोष्ण चरण। ये जटिल संरचनाएं हैं जिनमें आंतरिक न्यूक्लिक सामग्री के साथ एक सिर होता है, विभिन्न प्रकार के उपांग, एक पूंछ प्रक्रिया और जटिलता की अलग-अलग डिग्री का एक उपकरण होता है। और ऐसे कणों का प्रत्येक घटक एक निश्चित कार्य के साथ संपन्न होता है, जिसे वायरस और कोशिका के बीच बातचीत की प्रक्रिया में महसूस किया जाता है। दूसरे शब्दों में, एक जटिल प्रकार की समरूपता घन समरूपता का एक संयोजन है, सिर एक आइकोसाइडर पॉलीहेड्रॉन है, और रॉड के आकार की संरचनाएं दुम प्रक्रियाएं हैं। यद्यपि जीवाणु विषाणुओं में काफी सरल रूप से संगठित विषाणु भी होते हैं, जो आदिम न्यूक्लियोकैप्सिड, गोलाकार या घन आकार के होते हैं। जीवाणु विषाणु पादप और जंतु विषाणुओं की तुलना में अधिक जटिल होते हैं।

24) एक कोशिका के साथ एक फेज की बातचीत। वायरल और समशीतोष्ण चरणों।

सोखना।

कोशिका की सतह पर वायरल कणों के जुड़ाव के साथ बातचीत शुरू होती है। कोशिका की सतह पर उपयुक्त रिसेप्टर्स और वायरल कण की सतह पर एंटी-रिसेप्टर्स की उपस्थिति में प्रक्रिया संभव हो जाती है।

वायरस आवश्यक पदार्थों के परिवहन के लिए डिज़ाइन किए गए सेल रिसेप्टर्स का उपयोग करते हैं: पोषक कण, हार्मोन, वृद्धि कारक, आदि।

रिसेप्टर्स: प्रोटीन, प्रोटीन और लिपिड के कार्बोहाइड्रेट घटक, लिपिड। विशिष्ट रिसेप्टर्स वायरल कण (परिवहन, साइटोप्लाज्म या नाभिक के क्षेत्रों में वितरण) के आगे के भाग्य का निर्धारण करते हैं। वायरस गैर-विशिष्ट रिसेप्टर्स से जुड़ सकता है और यहां तक ​​कि कोशिका में प्रवेश भी कर सकता है। हालांकि, इस प्रक्रिया से संक्रमण नहीं होता है।

प्रारंभ में, एंटीरिसेप्टर और रिसेप्टर के बीच एक एकल बंधन बनता है। यह बंधन नाजुक है और टूट सकता है। अपरिवर्तनीय अधिशोषण के निर्माण के लिए बहुसंयोजी लगाव आवश्यक है। झिल्ली में ग्राही अणुओं के मुक्त संचलन के कारण स्थिर बंधन होता है। कोशिका के साथ वायरस की बातचीत के दौरान, लिपिड की तरलता में वृद्धि देखी जाती है, और वायरस और कोशिका के बीच बातचीत के क्षेत्र में रिसेप्टर क्षेत्रों का निर्माण होता है। कई विषाणुओं के ग्राही मेजबान कोशिकाओं के सीमित समूह में ही मौजूद हो सकते हैं। यह इस वायरस के प्रति जीव की संवेदनशीलता को निर्धारित करता है। इस प्रकार, वायरल डीएनए और आरएनए में मेजबान कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करने की क्षमता है।

एंटीरिसेप्टर्स अद्वितीय वायरल ऑर्गेनेल में पाए जा सकते हैं: टी-बैक्टीरियोफेज में आउटग्रोथ संरचनाएं, एडेनोवायरस में फाइबर, वायरल झिल्ली की सतह पर स्पाइक्स, कोरोनवीरस में कोरोना।

प्रवेश।

2 तंत्र - रिसेप्टर एंडोसाइटोसिस और झिल्ली संलयन।

रिसेप्टर एंडोसाइटोसिस:

कोशिका में पोषक तत्वों और नियामक पदार्थों के प्रवेश के लिए सामान्य तंत्र। विशिष्ट क्षेत्रों में होता है - जहां क्लैथ्रिन से ढके विशेष गड्ढे होते हैं, विशिष्ट रिसेप्टर्स गड्ढे के नीचे स्थित होते हैं। गड्ढे तेजी से आक्रमण प्रदान करते हैं और क्लैथ्रिन से ढके रिक्तिका का निर्माण करते हैं (सोखने के क्षण से 10 मिनट से अधिक नहीं गुजरते हैं, एक मिनट में 2000 रिक्तिकाएं बन सकती हैं)। रिक्तिकाएं बड़े साइटोप्लाज्मिक रिक्तिका के साथ मिलकर रिसेप्टरोसोम (अब क्लैथ्रिन युक्त नहीं) बनाती हैं, जो बदले में लाइसोसोम के साथ फ्यूज हो जाती हैं।

वायरल और कोशिका झिल्ली का संलयन:

लिपटे हुए विषाणुओं में, कोशिका झिल्ली लिपिड के साथ वायरल प्रोटीन के बिंदु अंतःक्रिया द्वारा संलयन की मध्यस्थता की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली के साथ वायरल लिपोप्रोटीन लिफाफा का एकीकरण होता है। गैर-लिफाफा वायरस में, सतह प्रोटीन में से एक कोशिका झिल्ली लिपिड के साथ भी संपर्क करता है और आंतरिक घटक झिल्ली से गुजरता है (पैरामाइक्सोवायरस में, एफ-प्रोटीन; ऑर्थोमेक्सोवायरस में, एचए 2 हेमाग्लगुटिनेटिंग सबयूनिट)। सतही प्रोटीन की संरचना पीएच से प्रभावित होती है।

पट्टी।

इस प्रक्रिया में, संक्रामक गतिविधि गायब हो जाती है, न्यूक्लियस के प्रति संवेदनशीलता अक्सर प्रकट होती है, और एंटीबॉडी का प्रतिरोध उत्पन्न होता है। अनड्रेसिंग का अंतिम उत्पाद न्यूक्लिक एसिड होता है जो एक आंतरिक वायरल प्रोटीन से बंधा होता है। कपड़े उतारने का चरण संक्रमण की संभावना को भी सीमित करता है (वायरस हर कोशिका में कपड़े उतारने में सक्षम नहीं होते हैं)। सेल के विशेष क्षेत्रों में कपड़े उतारना होता है: लाइसोसोम, गोल्गी तंत्र और पेरिन्यूक्लियर स्पेस।

प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के परिणामस्वरूप कपड़े उतारना होता है। उदाहरण के लिए, पिकोर्नवायरस में, 156 से 12 एस के आकार के साथ मध्यवर्ती सबवायरल कणों के गठन के साथ अनड्रेसिंग आय। साइटोप्लाज्म और परमाणु छिद्रों में एडेनोवायरस में और कम से कम 3 चरण होते हैं:

विषाणुओं की तुलना में अधिक घनत्व वाले सबवायरल कणों का निर्माण;

कोर का निर्माण जिसमें 3 वायरल प्रोटीन गायब हैं;

डीएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का निर्माण जिसमें डीएनए सहसंयोजक रूप से एक टर्मिनल प्रोटीन से जुड़ा होता है।

विषाणुजनित और समशीतोष्ण चरणों की विशेषता।

जब एक जीवाणु एक फेज से संक्रमित होता है, तो तथाकथित लाइटिक संक्रमण होता है, अर्थात, संक्रमण मेजबान कोशिका के लसीका के साथ समाप्त होता है, लेकिन यह केवल तथाकथित विषाणुजनित चरणों की विशेषता है, जिसकी कोशिका के साथ बातचीत होती है। कोशिका मृत्यु और फेज संतति के निर्माण की ओर जाता है।

साथ ही, सेल के साथ फेज की बातचीत के अनुसार निम्नलिखित चरणों को प्रतिष्ठित किया जाता है: सेल संस्कृति के साथ फेज को मिलाकर (संक्रमण की बहुलता प्रति 10 कोशिकाओं में 1 फेज है), और एकाग्रता काफी अधिक होनी चाहिए ताकि फेज कोशिकाओं से संपर्क कर सकते हैं। पुन: संक्रमण से बचने के लिए - संक्रमण के बाद अधिकतम 5 मिनट तक, जब फेज को सोख लिया जाता है - फेज के साथ कोशिकाओं का यह मिश्रण पतला होता है। एक अव्यक्त अवधि होती है जिसके दौरान फेज की संख्या में वृद्धि नहीं होती है, फिर एक बहुत ही कम निकास अवधि होती है, जब फेज कणों की संख्या तेजी से बढ़ जाती है, जब सेल लाइसिस और फेज संतान जारी होती है, और फिर फेज की संख्या बनी रहती है समान स्तर, क्योंकि पुन: संक्रमण नहीं होता है। इस वक्र के आधार पर, इन चरणों को प्रतिष्ठित किया जा सकता है: "विकास" (अव्यक्त अवधि) की वनस्पति अवधि, बाहर निकलने की अवधि और प्रति 1 संक्रमित कोशिका में फेज उपज की गणना करें। अव्यक्त अवधि के दौरान, बैक्टीरिया में फेज कणों जैसा कुछ भी नहीं पाया जा सकता है, और अव्यक्त अवधि में ऐसी कोशिकाओं से संक्रामक सिद्धांत को अलग करना संभव नहीं है। केवल परिपक्व फेज कण ही ​​बैक्टीरिया को संक्रमित कर सकते हैं। इस प्रकार, विषाणुजनित फेज हमेशा बैक्टीरिया की मृत्यु का कारण बनते हैं और संक्रमण पैदा करते हैं, जो अगले और अन्य संवेदनशील कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम नए वायरल कणों के उत्पादन में प्रकट होता है।

विषाणुओं के विपरीत, समशीतोष्ण चरणों के संक्रमण से जीवाणु कोशिकाओं का लसीका नहीं होता है, लेकिन एक जीवाणु कोशिका के साथ एक फेज के सह-अस्तित्व की एक विशेष स्थिति का एहसास होता है। यह सह-अस्तित्व इस तथ्य में व्यक्त किया जाता है कि फेज की एक निश्चित शुरुआत बैक्टीरिया कोशिका में बिना किसी प्रतिकूल परिस्थितियों के मौजूद होती है और पीढ़ी से पीढ़ी तक संरक्षित होती है। इस तरह के सह-अस्तित्व के कुछ चरणों में, कोशिका में फेज सक्रिय हो जाता है और विकास के लिटिक चक्र की स्थिति में प्रवेश करता है, जिससे कोशिका लसीका और फेज संतान की रिहाई होती है। इस तरह के फेज को लाइसोजेनिक या समशीतोष्ण फेज कहा जाता है, और फेज के साथ मध्यम अस्तित्व की स्थिति लाइसोजनी होती है, और ऐसे बैक्टीरिया जिनमें इस तरह के गुप्त फेज होते हैं उन्हें लाइसोजेनिक बैक्टीरिया कहा जाता है। लाइसोजेनिक बैक्टीरिया शब्द इस तथ्य से आया है कि संस्कृतियों की एक बार खोज की गई थी जिसमें एक फेज अनायास प्रकट हो गया था, और इस बैक्टीरियोफेज को संस्कृति के संदूषण के रूप में माना जाने लगा, यानी एक जीवाणु वायरस संस्कृति में प्रवेश करता है, और ऐसी संस्कृतियों को लाइसोजेनिक कहा जाता है, अर्थात्, वे लसीका उत्पन्न करते हैं।

बैक्टीरिया के विपरीत, वायरस केवल जीवित कोशिकाओं में ही प्रजनन करते हैं। इस संबंध में, वायरस की खेती एक प्रायोगिक जानवर के शरीर के स्तर पर की जा सकती है (एक विकासशील जीव के रूप में चिकन भ्रूण को प्रायोगिक जानवरों के रूप में संदर्भित किया जाता है) या शरीर के बाहर विकसित एक जीवित कोशिका, अर्थात। सेल संस्कृति स्तर पर।

प्रयोगशाला पशुओं का उपयोग। वायरस को अलग करने और विकसित करने के तरीकों में से एक प्रयोगशाला जानवरों को संक्रमित करना है। उनका उपयोग वायरस को अलग करने के लिए किया जाता है जो सेल संस्कृतियों में साइटोपैथिक परिवर्तनों के विकास का कारण नहीं बनते हैं और चिकन भ्रूण में गुणा नहीं करते हैं। प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग से नैदानिक ​​लक्षण परिसर द्वारा वायरल संक्रमण की प्रकृति की पहचान करना भी संभव हो जाता है। काम के उद्देश्य और अध्ययन किए जा रहे वायरस के प्रकार के आधार पर सफेद चूहों, हम्सटर, गिनी सूअरों और खरगोशों को अक्सर प्रयोगशाला जानवरों के रूप में उपयोग किया जाता है। बड़े जानवरों में से, विभिन्न प्रजातियों के बंदरों और कुछ अन्य जानवरों का उपयोग किया जाता है। पक्षियों से मुर्गियों, गीज़, बत्तखों का उपयोग किया जाता है। हाल के वर्षों में, नवजात जानवरों (वायरस के प्रति अधिक संवेदनशील), "बाँझ जानवर" (गर्भाशय से निकाले गए और बाँझ हवा और निष्फल भोजन का उपयोग करके बाँझ परिस्थितियों में रखे गए) और ज्ञात आनुवंशिकता वाले शुद्ध वंश के जानवर (अंतर्निहित या रैखिक जानवर) अधिक बार उपयोग किया जाता है।

केवल स्वस्थ जानवरों को ही प्रयोग में लिया जाता है, अधिमानतः एक नर्सरी और एक बैच से। शरीर के तापमान को उसी समय मापा जाता है, क्योंकि इसमें दैनिक उतार-चढ़ाव होता है। परीक्षण सामग्री को कुछ ऊतकों में वायरस के ट्रॉपिज्म को ध्यान में रखते हुए प्रशासित किया जाता है। तो, न्यूट्रोट्रोपिक वायरस के अलगाव के लिए, सामग्री को मस्तिष्क में इंजेक्ट किया जाता है, न्यूमोट्रोपिक वायरस के अलगाव के लिए - नाक के माध्यम से (हल्के ईथर एनेस्थेसिया के तहत)।

प्रयोगशाला जानवरों में, वायरस युक्त सामग्री के संक्रमण के बाद, सामग्री को आगे के शोध के लिए समय पर और सही तरीके से और असंगत रूप से लेना महत्वपूर्ण है। यदि उपयुक्त ऊष्मायन अवधि के बाद जानवर में संक्रमण के लक्षण विकसित होते हैं तो वायरस अलगाव के परिणाम सकारात्मक माने जाते हैं।

चूजे के भ्रूण का उपयोग। भ्रूण के ऊतकों में, इसकी झिल्ली, जर्दी थैली, कई रोगजनक मानव और पशु वायरस गुणा करने में सक्षम होते हैं। इस मामले में, एक या दूसरे ऊतक के लिए वायरस की चयनात्मकता महत्वपूर्ण है: चेचक के वायरस अच्छी तरह से प्रजनन करते हैं और कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली की कोशिकाओं में जमा होते हैं, कण्ठमाला वायरस - एमनियन में, इन्फ्लूएंजा वायरस - एमनियन और एलांटोइस में, रेबीज वायरस। - जर्दी थैली में।

विकासशील भ्रूणों में वायरस की खेती के अन्य तरीकों की तुलना में कई फायदे हैं: एक घना खोल काफी मज़बूती से रोगाणुओं से आंतरिक सामग्री की रक्षा करता है; मुर्गी के भ्रूण को संक्रमित करते समय, खेती के अन्य तरीकों की तुलना में वायरस युक्त सामग्री की अधिक उपज प्राप्त होती है; चिकन भ्रूण के संक्रमण की विधि सरल और किसी भी वायरोलॉजिकल प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ है; भ्रूण में बाहरी कारकों के रोगजनकों के लिए पर्याप्त व्यवहार्यता और प्रतिरोध होता है। हालांकि, चिकन भ्रूण हमेशा गुप्त वायरल और जीवाणु संक्रमण से मुक्त नहीं होते हैं। वायरस से संक्रमण के बाद भ्रूण में होने वाले रोग परिवर्तनों की गतिशीलता का निरीक्षण करना मुश्किल है। संक्रमित भ्रूण की ऑटोप्सी में अक्सर दिखाई देने वाले परिवर्तन नहीं दिखते हैं और एक रक्तगुल्म परीक्षण और अन्य तरीकों का उपयोग करके वायरस का पता लगाता है। संक्रमित भ्रूण में, एंटीबॉडी टिटर में वृद्धि का पालन करना असंभव है। विधि सभी वायरस के लिए उपयुक्त नहीं है।

वायरोलॉजिकल अध्ययन के लिए 7-12 दिन की उम्र के भ्रूणों का उपयोग किया जाता है, जो पोल्ट्री फार्म से प्राप्त किए जाते हैं। आप एक पारंपरिक थर्मोस्टेट में भ्रूण विकसित कर सकते हैं, जिसके नीचे हवा को नम करने के लिए पानी के साथ ट्रे रखी जाती हैं। थर्मोस्टेट में तापमान 37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए, और आर्द्रता 60-65% होनी चाहिए। सफेद मुर्गियों से बड़े, साफ (लेकिन बिना धुले), निषेचित अंडे का चयन करें, 5-10 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 10 दिनों से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाता है। निषेचित अंडे को एक जर्मिनल डिस्क की उपस्थिति से पहचाना जाता है, जो एक ओवोस्कोप के साथ पारभासी होने पर एक काले धब्बे की तरह दिखता है।

वायरस के साथ काम करते समय, भ्रूण को संक्रमित करने के विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन सबसे व्यावहारिक अनुप्रयोग कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली के लिए वायरस का अनुप्रयोग है, एलांटोइक, एमनियोटिक गुहा और जर्दी थैली में परिचय

(चित्र 10.5)। विधि का चुनाव अध्ययन के तहत वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करता है।

चावल। 10.5.

संक्रमण से पहले, भ्रूण की व्यवहार्यता एक ओवोस्कोप पर निर्धारित की जाती है। जीवित भ्रूण मोबाइल होते हैं, झिल्लियों के जहाजों का स्पंदन स्पष्ट रूप से दिखाई देता है। मोमबत्ती जलाते समय, खोल पर एक साधारण पेंसिल से हवा की थैली की सीमाओं या भ्रूण के स्थान को चिह्नित करें, जो कि खोल पर इसकी छाया से निर्धारित होता है।

चिकन भ्रूणों को उबालने वाले उपकरणों का उपयोग करके सख्ती से सड़न रोकने वाली परिस्थितियों में एक बॉक्स में संक्रमित किया जाता है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली पर संक्रमित होने पर, 12-दिन के भ्रूण सबसे उपयुक्त होते हैं। एलैंटोइक कैविटी में संक्रमण के लिए, 10-11 दिनों के भ्रूण का उपयोग किया जाता है, एमनियोटिक गुहा में - 7-11 दिनों के भ्रूण, जर्दी थैली में - 7 दिन की उम्र के भ्रूण।

संक्रमित भ्रूण वाले अंडों को ब्लंट एंड अप के साथ स्टैंड पर रखा जाता है। तापमान शासन और ऊष्मायन अवधि टीका वायरस के जैविक गुणों पर निर्भर करती है। ओवोस्कोप के तहत प्रतिदिन भ्रूण की व्यवहार्यता की निगरानी की जाती है। चोट के कारण संक्रमण के बाद पहले दिन मरने वाले भ्रूण की जांच नहीं की जाती है।

सामग्री एकत्र करने से पहले, भ्रूण को जहाजों को संकुचित करने और शव परीक्षा में रक्तस्राव को रोकने के लिए 18-20 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा किया जाता है। सड़न रोकनेवाला के नियमों के अनुपालन में बॉक्स में भ्रूण खोले जाते हैं।

Allantoic द्रव को एक पिपेट के साथ चूसा जाता है, बाँझपन को चीनी या मांस-पेप्टोन शोरबा में टीका द्वारा नियंत्रित किया जाता है, रक्तगुल्म प्रतिक्रिया में एक वायरस की उपस्थिति के लिए जाँच की जाती है और एक जमे हुए अवस्था में 4 ° C पर संग्रहीत किया जाता है।

एमनियोटिक द्रव प्राप्त करने के लिए, ऐलांटोइक द्रव को पहले एस्पिरेटेड किया जाता है, फिर एमनियोटिक झिल्ली को चिमटी से पकड़ लिया जाता है, थोड़ा ऊपर उठाया जाता है, और एमनियोटिक द्रव को पाश्चर पिपेट के साथ चूसा जाता है।

कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली में परिवर्तन का अध्ययन करते समय, इसे कैंची से काटा जाता है और सभी सामग्री को छेद के माध्यम से पेट्री डिश में डाला जाता है। कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली खोल के अंदर रहती है और चिमटी के साथ खारा के साथ पेट्री डिश में हटा दी जाती है। यहां इसे धोया जाता है, सीधा किया जाता है और एक गहरे रंग की पृष्ठभूमि के खिलाफ फोकल घावों की प्रकृति का अध्ययन किया जाता है।

एमनियोटिक झिल्ली प्राप्त करने के लिए, एम्नियोटिक थैली जिसमें भ्रूण संलग्न होता है, उसे काट दिया जाता है और भ्रूण से मुक्त कर दिया जाता है, जिसे घावों के लिए देखा जाता है।

जर्दी झिल्ली प्राप्त करने के लिए, कोरियोन-एलांटोइस को काट दिया जाता है, एलांटोइक और एमनियोटिक तरल पदार्थ चूस जाते हैं, भ्रूण को चिमटी से हटा दिया जाता है, गर्भनाल द्वारा अलग किया जाता है, जर्दी थैली को पकड़ लिया जाता है और पेट्री डिश में रखा जाता है। बाँझपन के लिए नियंत्रण, घावों की उपस्थिति के लिए देखें। जर्दी, यदि आवश्यक हो, जर्दी थैली को हटाए बिना एक सिरिंज के साथ हटाया जा सकता है।

संक्रमित भ्रूण के एलैंटोइक और एमनियोटिक द्रव में वायरस की उपस्थिति रक्तगुल्म परीक्षण में निर्धारित की जाती है। बाँझपन के परीक्षण के बाद हेमाग्लगुटिनेशन-पॉजिटिव भ्रूण से तरल पदार्थ को एक विस्तारित रक्तगुल्म परीक्षण में जमा और शीर्षक दिया जाता है।

थोड़ी मात्रा में वायरस की उपस्थिति या परीक्षण सामग्री में इसका पता लगाने की असंभवता में, चिकन भ्रूण पर क्रमिक मार्ग किए जाते हैं। यदि, भ्रूण पर तीन बाद के मार्ग के बाद, परीक्षण सामग्री में वायरस का पता नहीं चलता है, तो परिणाम को नकारात्मक माना जाता है।

सेल संस्कृतियों का उपयोग। शरीर के बाहर कोशिकाओं की खेती के लिए कई शर्तों की पूर्ति की आवश्यकता होती है। उनमें से एक काम के दौरान बाँझपन का सख्त पालन है, क्योंकि उपयोग किए जाने वाले पोषक तत्व बैक्टीरिया और कवक के लिए भी एक उत्कृष्ट पोषक तत्व हैं। ऊतक कोशिकाएं भारी धातुओं के लवणों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील होती हैं। इसलिए, नमकीन घोल और पोषक माध्यम बनाने वाले विभिन्न अवयवों की गुणवत्ता के साथ-साथ सेल कल्चर में उपयोग किए जाने वाले बर्तनों और रबर स्टॉपर्स के प्रसंस्करण के तरीकों को असाधारण महत्व दिया जाना चाहिए।

कोशिकाओं के साथ सफल कार्य के लिए आवश्यक शर्तों में से एक आसुत जल की उच्च गुणवत्ता है (सप्ताह में दो बार जाँच की जाती है)। कोशिकाओं के साथ काम करने के लिए, बिडिस्टिल या विआयनीकृत पानी का उपयोग किया जाता है। सबसे अच्छा डिस्टिलर कांच या मिश्र धातु से बने उपकरण होते हैं: भारी धातु आयन, जो कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं, ऐसे उपकरणों से नहीं धोए जाते हैं। विआयनीकृत पानी विशेष प्रतिष्ठानों पर प्राप्त किया जाता है, जहां आयनों एक्सचेंजर और कटियन एक्सचेंजर के साथ स्तंभों के माध्यम से इसके क्रमिक मार्ग के दौरान लवण से पानी को शुद्ध किया जाता है।

कोशिकाओं की खेती करते समय, व्यंजन और स्टॉपर्स की तैयारी और नसबंदी पर विशेष रूप से उच्च आवश्यकताओं को रखा जाता है। कई मामलों में, यह उनकी अनुचित धुलाई और नसबंदी है जो कोशिकाओं को कांच से नहीं जोड़ने या सेल मोनोलेयर के तेजी से अध: पतन का कारण बनता है।

शरीर के बाहर कोशिकाओं के विकास और प्रजनन के लिए, भौतिक-रासायनिक कारकों के एक जटिल सेट की आवश्यकता होती है: एक निश्चित तापमान, हाइड्रोजन आयनों, अकार्बनिक यौगिकों, कार्बोहाइड्रेट, अमीनो एसिड, प्रोटीन, विटामिन, ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड की एकाग्रता, इसलिए कोशिका संवर्धन में विषाणुओं की खेती के लिए जटिल पोषक माध्यमों का उपयोग किया जाता है। उनकी रचना करने वाले घटकों की प्रकृति के अनुसार, इन मीडिया को दो समूहों में विभाजित किया गया है।

• 1. मीडिया, जो खारा समाधान (हैंक्स, अर्ल, आदि) और प्राकृतिक घटकों (पशु और मानव रक्त सीरम, एल्ब्यूमिन हाइड्रोलाइज़ेट) के मिश्रण हैं। मीडिया के विभिन्न फॉर्मूलेशन में इन घटकों में से प्रत्येक की मात्रा अलग-अलग होती है।
• 2. सिंथेटिक और अर्ध-सिंथेटिक मीडिया जिसमें अमीनो एसिड, विटामिन, कोएंजाइम और न्यूक्लियोटाइड (ईगल मीडिया, 199 आदि) के साथ खारा समाधान (अर्ल, हैंक्स, आदि) शामिल हैं। सिंथेटिक मीडिया में, कोशिकाएं व्यवहार्य अवस्था में थोड़े समय (7 दिनों तक) के लिए मौजूद रह सकती हैं। उन्हें लंबे समय तक व्यवहार्य स्थिति में बनाए रखने के लिए, साथ ही कोशिकाओं के विकास और प्रजनन के लिए बेहतर स्थिति बनाने के लिए, पशु रक्त सीरम (गायों, बछड़ों, आदि) को सिंथेटिक मीडिया में जोड़ा जाता है।

शरीर के बाहर कोशिकाओं के संवर्धन के विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल वायरस को अलग करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड और प्रतिरोपित सेल लाइनों की एकल-परत संस्कृतियों को वर्तमान में सबसे बड़ा व्यावहारिक उपयोग प्राप्त हुआ है। सिंगल-लेयर सेल संस्कृतियों को 1 लीटर, 250 और 100 मिलीलीटर की क्षमता वाले कांच के फ्लैट-दीवार वाले जहाजों-गद्दों में या उचित तरीके से इलाज किए गए पारंपरिक बैक्टीरियोलॉजिकल टेस्ट ट्यूब में उगाया जाता है।

प्राथमिक ट्रिप्सिनाइज्ड सेल संस्कृतियों का उपयोग करते समय, विधि का सार प्रोटीयोलाइटिक एंजाइमों द्वारा ऊतकों में अंतरकोशिकीय बंधनों के विनाश और कांच की सतह पर एक मोनोलेयर विकसित करने के लिए कोशिकाओं को अलग करने में निहित है। मानव और पशु भ्रूण, वध किए गए जानवरों और पक्षियों के ऊतक और अंग, साथ ही सर्जरी के दौरान मनुष्यों से निकाले गए, कोशिकाओं को प्राप्त करने के स्रोत के रूप में काम कर सकते हैं। सामान्य और घातक अपक्षयी ऊतकों, उपकला, फाइब्रोब्लास्टिक प्रकार और मिश्रित का प्रयोग करें। शरीर से निकाली गई कोशिकाओं को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता ऊतक भेदभाव की डिग्री से निकटता से संबंधित है। ऊतक जितना कम विभेदित होता है, उसकी कोशिकाओं की इन विट्रो में प्रसार करने की क्षमता उतनी ही तीव्र होती है। इसलिए, वयस्क जानवरों की सामान्य कोशिकाओं की तुलना में भ्रूण और ट्यूमर के ऊतकों की कोशिकाएं शरीर के बाहर संस्कृति के लिए बहुत आसान होती हैं।

उनकी वृद्धि की प्रकृति को निर्धारित करने के लिए दैनिक संस्कृतियों को कम आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत देखा जाता है। यदि कोशिकाओं का प्रसार नहीं होता है, तो कांच के गोल, दानेदार, काले और परतदार दिखते हैं, कांच के बने पदार्थ खराब तरीके से संसाधित होते हैं या संस्कृति माध्यम में सामग्री विषाक्त होती है।

प्राथमिक trypsinized ऊतकों के साथ, प्रत्यारोपित कोशिका संवर्धन व्यापक रूप से वायरस की खेती के लिए उपयोग किया जाता है; कोशिका संवर्धन शरीर के बाहर अनिश्चित काल तक प्रजनन करने में सक्षम है। सामान्य और कैंसरग्रस्त मानव ऊतकों से प्राप्त सेल संस्कृतियों का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। गर्भाशय के गर्भाशय ग्रीवा के ट्यूमर से प्राप्त सेल लाइन हेला, हेप -2 - स्वरयंत्र के एक कार्सिनोमा से, केवी - मौखिक गुहा के कैंसर के ऊतक से, व्यापक रूप से ज्ञात हो गया है। इस तरह के सेल कल्चर को सामान्य जानवरों के ऊतकों से भी तैयार किया जाता है - एक बंदर के गुर्दे, एक खरगोश और एक सुअर के भ्रूण (तालिका 10.1)।

प्रतिरोपित कोशिकाओं को फिर से बोने के लिए पोषक माध्यम को पिपेट से चूसा जाता है और बाहर निकाल दिया जाता है। कोशिकाओं की गठित पतली परत को ट्रिप्सिन घोल से नष्ट कर दिया जाता है, और इस तरह से निकलने वाली कोशिकाओं को ताजा पोषक घोल के साथ एक नए बर्तन में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जहाँ कोशिकाओं का एक मोनोलेयर फिर से बनता है।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में वायरस की उपस्थिति का एक संकेतक हो सकता है:

• क) विशिष्ट कोशिका अध: पतन का विकास;
• बी) इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाना;
• ग) इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एक विशिष्ट प्रतिजन का पता लगाना;
• डी) सकारात्मक रक्तशोधन प्रतिक्रिया;
• ई) सकारात्मक रक्तगुल्म प्रतिक्रिया;
• ई) सजीले टुकड़े का गठन।

तालिका 10.1

सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली सेल संस्कृतियों की सूची

संक्रमित संस्कृतियों में विशिष्ट अध: पतन का पता लगाने के लिए, कम आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदिन कोशिकाओं की जांच की जाती है। कई वायरस, कोशिकाओं में गुणा करते समय, उनके अध: पतन का कारण बनते हैं, अर्थात। एक साइटोपैथोजेनिक प्रभाव (सीपीए) (चित्र। 10.6) है।

चावल। 10.6

संक्रमित सेल संस्कृतियों में विकास का समय और साइटोपैथिक परिवर्तनों की प्रकृति इनोक्यूलेटेड वायरस के गुणों और खुराक के साथ-साथ सेल की खेती के गुणों और स्थितियों से निर्धारित होती है। कुछ वायरस संक्रमण के बाद पहले सप्ताह के भीतर सीपीपी का कारण बनते हैं (पॉक्स, पोलियो, कॉक्ससेकी बी, आदि), अन्य - 1-2 सप्ताह के बाद। संक्रमण के बाद (एडेनोवायरस, पैरेन्फ्लुएंजा वायरस, ईसीएचओ, आदि)।

वायरस तीन मुख्य प्रकार के साइटोपैथिक परिवर्तनों का कारण बनते हैं: बहुकेंद्रीय विशाल कोशिकाओं और सिम्प्लास्ट का निर्माण, जो कई कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के संलयन का परिणाम हैं; इंटरसेलुलर कनेक्शन के नुकसान और कोशिकाओं के गोलाकार होने के परिणामस्वरूप गोल कोशिका अध: पतन; कोशिकाओं की कई परतों से मिलकर कोशिका प्रसार के foci का विकास।

कोशिका संवर्धन में कुछ विषाणुओं के प्रजनन के दौरान, प्रभावित कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य या केंद्रक में अंतःकोशिकीय समावेशन बनते हैं। समावेशन का पता लगाने के लिए सेल संस्कृतियों को वायरस से संक्रमित टेस्ट ट्यूब में कांच की प्लेटों पर उगाया जाता है, और कुछ ऊष्मायन अवधि के बाद, पारंपरिक रंगों के साथ धुंधला करके तैयारी तैयार की जाती है।

संक्रमित सेल संस्कृतियों में एक विशिष्ट प्रतिजन का पता लगाने के लिए, तैयारी उसी तरह तैयार की जाती है जैसे एमएफए का उपयोग करके समावेशन का पता लगाने के लिए।

प्लाक विधि विकृत (मृत) कोशिकाओं से युक्त फीके पड़े क्षेत्रों के एक अग्र कोटिंग के तहत वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के एक मोनोलेयर में गठन पर आधारित है। ये क्षेत्र, जिन्हें प्लाक कहा जाता है, वायरस कॉलोनियां हैं, जो आमतौर पर एक ही वायरल कण से बनती हैं।

साइटोपैथिक परिवर्तनों की अनुपस्थिति में, परीक्षण सामग्री से संक्रमित सेल संस्कृतियों में इंट्रासेल्युलर समावेशन, पट्टिका गठन, हेमडॉरप्शन की नकारात्मक प्रतिक्रियाएं और हेमाग्लगुटिनेशन, दो बाद के मार्ग किए जाते हैं। अंतिम मार्ग में इन परिवर्तनों की अनुपस्थिति में, वायरस अलगाव का परिणाम नकारात्मक माना जाता है।

संक्रामक सामग्री में वायरस का पता लगाने के लिए निम्नलिखित विधियों का उपयोग किया जा सकता है।

सूक्ष्म:

• ए) वायरोस्कोपी;
• बी) इंट्रासेल्युलर समावेशन का पता लगाना।

प्रतिरक्षाविज्ञानी:

• ए) प्रतिरक्षा इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी;
• बी) इम्यूनोफ्लोरेसेंस;
• ग) रक्तगुल्म;
• घ) रक्तशोषण।

निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं सहित, प्रतिरक्षाविज्ञानी विधियों का उपयोग करके वायरस की पहचान की जाती है:

• ए) रक्तगुल्म का निषेध;
• बी) hemadsorption देरी;
• ग) पूरक बंधन;
• डी) तटस्थता;
• ई) अगर जेल में वर्षा।

सूक्ष्म तरीके। प्रकाश सूक्ष्मदर्शी से केवल 150 एनएम से बड़े बड़े विषाणुओं का ही पता लगाया जा सकता है। छोटे विषाणुओं की पहचान केवल इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी से ही संभव है। बड़े वायरस का पता लगाने के लिए प्रकाश, चरण विपरीत और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है।

वायरल संक्रमण के दौरान, संक्रमित कोशिकाओं में अजीबोगरीब समावेशन विकसित होते हैं। कुछ संक्रमण प्रभावित कोशिकाओं (रेबीज, चेचक के टीके) के साइटोप्लाज्म में समावेशन के साथ होते हैं, अन्य - साइटोप्लाज्म और न्यूक्लियस (खसरा, प्राकृतिक और चिकन पॉक्स, एडेनोवायरस रोग) में। समावेशन की प्रकृति, संरचना, आकार और आकार 0.25 से 25 माइक्रोन तक भिन्न होता है। आधुनिक आंकड़ों के अनुसार, कुछ संक्रमणों में, समावेशन वायरस के प्रजनन का स्थल होता है और कोशिका पदार्थों से घिरे इसके संचय का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि अन्य में, वे कोशिका अध: पतन का एक उत्पाद हैं।

अंगों और ऊतकों के दाग वाले प्रिंट, सेल स्क्रैपिंग, प्रभावित ऊतक से ऊतकीय वर्गों और वायरस से संक्रमित सेल संस्कृति की तैयारी में समावेशन का पता लगाया जा सकता है। रंग अक्सर रोमानोव्स्की-गिमेसा पद्धति के अनुसार किया जाता है। इस विधि द्वारा धुंधला करने के लिए, पिक्रिक एसिड, फॉर्मेलिन, अल्कोहल, एसिटिक एसिड से युक्त डबोस्क - ब्राजील - बोइन के मिश्रण में तैयारी तय की जाती है। अधिकांश वायरल संक्रमणों में इंट्रासेल्युलर समावेशन रोमानोव्स्की-गिमेसा विधि के अनुसार ऑक्सीफिलिक और दाग गुलाबी या बकाइन होते हैं।

वायरल संक्रमण के निदान के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीके। हाल के वर्षों में, वायरल संक्रमण के प्रयोगशाला निदान में ये विधियां अग्रणी हो गई हैं। यह काफी हद तक आर्थिक कारणों से है, क्योंकि वायरोलॉजिकल विश्लेषण के शास्त्रीय तरीके काफी महंगे हैं। इसके अलावा, वायरोलॉजिकल विधियों (सप्ताह) का उपयोग करके अध्ययन की अवधि, भले ही वे काफी प्रभावी साबित हों, उन्हें पूर्वव्यापी बनाते हैं।

विभिन्न बायोसबस्ट्रेट्स और पर्यावरणीय वस्तुओं में वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए इम्यूनोलॉजिकल तरीकों का उपयोग किया जाता है, और सेरोडायग्नोसिस के लिए - बीमार लोगों और प्रयोगशाला जानवरों के रक्त सीरा में वायरल एंटीजन के एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए। इसके अलावा, विषाणुओं की पहचान के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी अनुसंधान विधियां अपरिहार्य हैं।

शरीर के साथ बातचीत करते हुए, वायरस एंटीबॉडी के गठन का कारण बनते हैं, जो कि विषाणुओं पर अधिशोषित होते हैं, कोशिकाओं में विषाणुओं के प्रवेश को रोकते हैं और साइटोपैथिक क्रिया (सीपीई) के विकास को रोकते हैं; चिकन भ्रूण और जानवरों में उनके प्रजनन के दौरान वायरस के घातक प्रभाव को बेअसर करना; विषाणु हेमाग्लगुटिनिन और न्यूरामिनिडेस को निष्क्रिय कर देता है, जिससे विषाणु-प्रभावित कोशिकाओं पर रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (आरजीए) और रक्तशोधन प्रतिक्रिया (आरजीएडी) को रोका जा सकता है। ये वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी भी वायरल कणों के एकत्रीकरण और वर्षा का कारण बनते हैं, और परिणामी प्रतिरक्षा परिसरों को पूरक बनाते हैं। इसलिए, विषाणुओं की पहचान के लिए, सेल संस्कृतियों, चिकन भ्रूणों और जानवरों और इसके संशोधनों पर शास्त्रीय तटस्थता प्रतिक्रिया (पीएच) का उपयोग किया जाता है: हेमाग्लगुटिनेशन अवरोध प्रतिक्रिया (एचआईटीए); रक्त-अवशोषण अवरोधन प्रतिक्रिया (RTGads)। एक ज्ञात वायरल एंटीजन (डायग्नोस्टिकम) के अनुसार रोगियों के सीरम में वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए वायरल संक्रमण के सेरोडायग्नोसिस में समान प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जाता है।

इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम) की विधि। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी वर्तमान में वायरस के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का डेटा है जो वायरस के आधुनिक वर्गीकरण के आधार के रूप में कार्य करता है।

वायरस के इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययन के विकास में एक नया चरण इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग है। इस पद्धति का उपयोग करके, न केवल वायरस का प्रत्यक्ष पता लगाया जा सकता है, बल्कि उनकी पहचान भी की जा सकती है, साथ ही वायरल उपभेदों का तेजी से सीरोटाइपिंग और उनके लिए एंटीबॉडी का अनुमापन संभव हो गया है। एक मैक्रोऑर्गेनिज्म की कोशिकाओं के अंदर वायरल एंटीजन के स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए आईईएम ने बहुत महत्व प्राप्त किया।

आईईएम का निस्संदेह लाभ पारंपरिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विधियों की तुलना में इसकी उच्च संवेदनशीलता है।

जब एक विषाणु प्रतिजन या विषाणु घटक एक समजात प्रतिसेरम के संपर्क में आता है, तो एक प्रतिरक्षी-प्रतिजन संकुल का निर्माण होता है। यह घटना वायरल एंटीजन या एंटीबॉडी का पता लगाने और उनकी पहचान करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक का आधार है। यह नकारात्मक धुंधलापन के बाद एंटीबॉडी वाले एंटीजन के कॉम्प्लेक्स हैं जिन्हें इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखा जा सकता है। नैदानिक ​​​​निदान में, एंटीजेनिक सामग्री को पूरी तरह से शुद्धिकरण की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, यदि एक इन्फ्लूएंजा वायरस का पता चला है, तो अशुद्ध एलैंटोइक तरल पदार्थ की जांच की जा सकती है। वर्तमान में, यह माना जाता है कि लगभग किसी भी प्रकार की नैदानिक ​​सामग्री आईईएम के लिए उपयुक्त है। नैदानिक ​​​​उद्देश्यों के लिए, साधारण अव्यवस्थित सीरा, साथ ही साथ दीक्षांत समारोह के सीरा का उपयोग किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एंटीजन और एंटीबॉडी की मात्रा के अनुपात का अंतिम परिणामों पर बहुत प्रभाव पड़ता है। प्रतिजन की अधिकता के साथ, कणों की एक बहुतायत देखी जाती है; इस मामले में ढेर कम होंगे। एंटीबॉडी की अधिकता के साथ, वायरल कण अपनी मोटी परत से घिरे होते हैं, विषाणु के छोटे संरचनात्मक विवरणों को प्रकट करना लगभग असंभव है; समुच्चय भी कम हैं। प्रतिजन और एंटीबॉडी के इष्टतम अनुपात के साथ, समुच्चय विषाणुओं के विवरण की एक अच्छी छवि के साथ बढ़े हुए हैं। उपरोक्त विचारों से, कई कमजोर पड़ने में प्रतिरक्षा सीरम का उपयोग करना वांछनीय है।

पैलेडियम से बनी एक सपोर्ट फिल्म को सपोर्ट ग्रिड पर लगाया जाता है। पैलेडियम की कम सांद्रता का उपयोग करते समय और सब्सट्रेट के सोखने के गुणों में सुधार करने के लिए, इसे कार्बन के साथ प्रबलित किया जाता है। ऐसा करने के लिए, वैक्यूम में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक ग्रिड पर तैयार सूखी फिल्म-सब्सट्रेट पर कोयले का छिड़काव किया जाता है। फिल्म-सब्सट्रेट की मोटाई और मजबूत कार्बन परत का वस्तु के बारीक विवरण के विपरीत और छवि पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। प्रत्येक शोधकर्ता सब्सट्रेट फिल्मों की विशिष्ट मोटाई और कार्बन परत को अलग-अलग निर्धारित करता है, इस तथ्य के आधार पर कि कार्बन पैलेडियम की तुलना में अधिक इलेक्ट्रॉनिक रूप से पारदर्शी है।

उनके लिए वायरस और एंटीबॉडी में इलेक्ट्रॉन घनत्व कम होता है। इसलिए, पूर्व-उपचार के बिना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जैविक वस्तुओं का पता नहीं लगाया जा सकता है। एक नकारात्मक कंट्रास्ट (या नकारात्मक दाग) तकनीक का उपयोग करके वायरस की कल्पना की जाती है। भारी धातुओं के विभिन्न लवणों का उपयोग वायरस और वायरस-एंटीबॉडी परिसरों के नकारात्मक धुंधलापन के लिए किया जाता है। कंट्रास्टिंग एजेंट (भारी धातु परमाणु) वस्तुओं के हाइड्रोफिलिक क्षेत्रों में प्रवेश करते हैं और उनमें पानी की जगह लेते हैं। नतीजतन, वस्तु का इलेक्ट्रॉन घनत्व बढ़ जाता है, और इसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में देखना संभव हो जाता है।

प्रत्यक्ष IEM पद्धति ने व्यवहार में सबसे बड़ा अनुप्रयोग पाया है। वाइरस सस्पेंशन को undiluted एंटीसेरम के साथ मिलाया जाता है। जोरदार सरगर्मी के बाद, मिश्रण 1 घंटे के लिए ऊष्मायन किया जाता है

37 डिग्री सेल्सियस, फिर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर। अगले दिन, प्रतिरक्षा परिसरों को उपजी करने के लिए मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। अवक्षेप को आसुत जल की एक बूंद में फिर से निलंबित कर दिया जाता है और नकारात्मक विपरीतता के अधीन किया जाता है।

IEM के परिणामों का मूल्यांकन करते समय, एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में एक एंटीजन और एक एंटीबॉडी के बीच बातचीत के उत्पादों का एक अलग रूप हो सकता है (एक व्यक्तिगत वायरल कण पूरे या आंशिक रूप से एंटीबॉडी के साथ कवर किया जाता है; वायरल कणों के समूह)। एग्लोमेरेट्स एक अलग क्षेत्र पर कब्जा कर सकते हैं, एक अलग उपस्थिति हो सकती है, और इसमें अलग-अलग कण होते हैं। इसलिए, प्रयोगात्मक लोगों के साथ, नियंत्रण तैयारी (एक बफर समाधान या विषम एंटीसेरम के साथ) का अध्ययन करना आवश्यक है।

आईईएम का उपयोग करके प्राप्त परिणामों के मूल्यांकन के लिए मानदंड तैयारी में प्रतिरक्षा सीरम द्वारा एकत्रित वायरल कणों के समूहों की उपस्थिति या अनुपस्थिति है। एंटीजन एग्लोमेरेट्स और विशिष्ट एंटीसेरम एंटीबॉडी की उपस्थिति एक सकारात्मक प्रतिक्रिया का संकेत है। फिर भी, हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन के प्रभाव में एंटीजन कणों के गैर-विशिष्ट एकत्रीकरण की संभावना को ध्यान में रखा जाना चाहिए। इस कारण से, कई लेखक 0 से 4+ के सशर्त पैमाने पर परिणामों पर विचार करने की सलाह देते हैं। यह सीरम एंटीबॉडी के साथ एकत्रित कणों के कवरेज की डिग्री के आकलन पर आधारित है।

रक्तगुल्म और रक्तशोषण के तरीके। कई वायरस में स्तनधारियों और पक्षियों की कड़ाई से परिभाषित प्रजातियों के एरिथ्रोसाइट्स को एकत्रित करने की क्षमता होती है। इस प्रकार, इन्फ्लूएंजा और कण्ठमाला के वायरस मुर्गियों, गिनी सूअरों और मनुष्यों के एरिथ्रोसाइट्स को बढ़ाते हैं; टिक-जनित एन्सेफलाइटिस वायरस - भेड़ एरिथ्रोसाइट्स; जापानी एन्सेफलाइटिस वायरस - एक दिवसीय मुर्गियों और गीज़ के एरिथ्रोसाइट्स; एडेनोवायरस - चूहों, चूहों, बंदरों के एरिथ्रोसाइट्स। एलांटोइक और एमनियोटिक तरल पदार्थ, चिकन भ्रूण के कोरियोन-एलांटोइक झिल्ली का निलंबन, वायरस से संक्रमित जानवरों की कोशिकाओं या अंगों की संस्कृतियों से निलंबन और अर्क का उपयोग रक्तगुल्म प्रतिक्रिया (एचए) में परीक्षण सामग्री के रूप में किया जाता है। हीमाग्लगुटिनेशन प्रतिक्रिया को कांच पर ड्रिप विधि द्वारा और टेस्ट ट्यूब या पॉलीस्टाइन प्लेटों के कुओं में एक विस्तारित पंक्ति में सेट किया जा सकता है। पहली विधि सांकेतिक है।

समूह-विशिष्ट होने के कारण, RGA वायरस की प्रजातियों को निर्धारित करना संभव नहीं बनाता है। हेमग्लूटीनेशन इनहिबिटेशन टेस्ट (HITA) का उपयोग करके उनकी पहचान की जाती है। इसके निर्माण के लिए ज्ञात प्रतिरक्षा एंटीवायरल सेरा का उपयोग किया जाता है। प्रत्येक कमजोर पड़ने पर समान मात्रा में वायरस युक्त तरल मिलाया जाता है। नियंत्रण वायरस का निलंबन है।

मिश्रण को थर्मोस्टेट में रखा जाता है, फिर एरिथ्रोसाइट्स का निलंबन जोड़ा जाता है। कुछ मिनट बाद, न्यूट्रलाइज़िंग सीरम का अनुमापांक निर्धारित किया जाता है, अर्थात। इसका अधिकतम कमजोर पड़ना, जिससे एरिथ्रोसाइट एग्लूटिनेशन में देरी हुई।

वायरल रोगों के सीरोलॉजिकल निदान में, आरटीजीए को युग्मित सीरा के साथ करने की सिफारिश की जाती है, जिनमें से एक रोग की शुरुआत में प्राप्त होता है, और दूसरा 1-2 सप्ताह या उससे अधिक के बाद। दूसरे सीरम में एंटीबॉडी टिटर में चार गुना वृद्धि प्रस्तावित निदान की पुष्टि करती है।

हेमडॉरप्शन रिएक्शन (आरजीएडी) का उपयोग संक्रमित सेल संस्कृतियों में हेमाग्लगुटिनेटिंग गतिविधि वाले वायरस को इंगित करने के लिए किया जाता है। प्रतिक्रिया का सार इस तथ्य में निहित है कि वायरस से संक्रमित कोशिकाओं की सतह पर वायरस के हेमाग्लगुटिनेटिंग क्रिया के प्रति संवेदनशील एरिथ्रोसाइट्स को adsorbed किया जाता है। उदाहरण के लिए, चिकन एरिथ्रोसाइट्स वेरियोला वायरस से संक्रमित कोशिकाओं पर अधिशोषित होते हैं; खसरा वायरस - बंदरों के एरिथ्रोसाइट्स; एडेनोवायरस - बंदर और चूहे, आदि।

न्यूट्रलाइजेशन रिएक्शन (PH)। कोशिका संवर्धन में पुनरुत्पादन, वायरस विभिन्न प्रकार के सीपीडी का कारण बनते हैं, जो गोलाई, झुर्रीदार, कमी या, इसके विपरीत, कोशिका के आकार में वृद्धि, उनके संलयन और सिम्प्लास्ट के गठन, साइटोप्लाज्म और नाभिक के विनाश में व्यक्त होते हैं। अंत में, वायरस से संक्रमित कोशिकाओं के एक मोनोलेयर में, कोशिका परत के कुछ वर्गों के विनाश के परिणामस्वरूप, "बाँझ धब्बे" या सजीले टुकड़े दिखाई दे सकते हैं, जो वायरल कण का एक क्लोन हैं, जो न केवल संभव बनाता है वायरस को अलग करें, लेकिन इसके टिटर को भी निर्धारित करें।

प्लेक की प्रकृति से वायरस की पहचान करना बहुत मुश्किल है, और इसलिए वे ज्ञात वायरस-बेअसर करने वाले सीरा के साथ पृथक वायरस के पीएच को सेट करने का सहारा लेते हैं। इस प्रयोजन के लिए, रोगी से प्राप्त वायरस सेल कल्चर में जमा हो जाता है और इसके विभिन्न तनुकरणों को बिना पतला एंटीवायरल सीरम के साथ मिलाया जाता है।

वायरस और सीरा का मिश्रण चूजे के भ्रूण या संवेदनशील जानवरों को संक्रमित कर सकता है। ऐसे मामलों में, एंटीबॉडी की बेअसर करने वाली गतिविधि अक्सर भ्रूण के तरल पदार्थ में वायरल हेमाग्लगुटिनिन के बेअसर होने और भ्रूण और जानवरों पर वायरस के घातक प्रभाव को समाप्त करने से निर्धारित होती है। उसी समय, न्यूट्रलाइज़ेशन इंडेक्स की गणना की जाती है, जो इस सीरम द्वारा निष्प्रभावी होने वाले वायरस की घातक खुराक की अधिकतम संख्या को एक के रूप में लिए गए नियंत्रण प्रयोग के परिणामों की तुलना में व्यक्त करता है।

इसी तरह, पीएच का उपयोग करके, रोगियों की सामग्री से पृथक वायरस की पहचान की जाती है जब वे चिकन भ्रूण और जानवरों को संक्रमित करते हैं। ऐसा करने के लिए, भ्रूण के वायरस युक्त तरल पदार्थ और जानवरों के प्रभावित अंगों के निलंबन को वायरस-बेअसर करने वाले सीरा में जोड़ा जाता है। एक निश्चित ऊष्मायन समय के बाद, कोशिका संवर्धन, चूजे के भ्रूण और जानवर मिश्रण से संक्रमित हो जाते हैं।

वायरल संक्रमण के सेरोडायग्नोसिस में, एक ज्ञात वायरस के लिए वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी के अनुमापांक में वृद्धि की गतिशीलता निर्धारित की जाती है। साथ ही, रोग की शुरुआत और अंत में रोगियों से लिए गए युग्मित सीरा के साथ PH सेट किया जाता है। निदान उनमें से दूसरे में इम्युनोग्लोबुलिन के अनुमापांक में 4 गुना वृद्धि होगी।

PH विशिष्ट एंटीबॉडी की क्षमता पर आधारित है जो एक वायरल कण को ​​पर्याप्त रूप से बांधता है। वायरस और एंटीबॉडी के बीच बातचीत के परिणामस्वरूप, संवेदनशील कोशिकाओं के साथ वायरल कण के कनेक्शन के लिए जिम्मेदार एंटीजेनिक निर्धारकों की नाकाबंदी के कारण वायरस की संक्रामक गतिविधि बेअसर हो जाती है। नतीजतन, वायरस इन विट्रो या विवो में एक संवेदनशील जैविक प्रणाली में गुणा करने की क्षमता खो देता है।

PH के परिणाम वायरस और उसके समजात एंटीबॉडी के मिश्रण के बाद स्पष्ट हो जाते हैं, एक समयबद्ध एक्सपोजर के बाद, एक संवेदनशील जैविक प्रणाली (टिशू सेल कल्चर, चिक भ्रूण, अतिसंवेदनशील पशु शरीर) में पेश किया जाता है, जहां वायरस गुणा कर सकता है और औसत दर्जे का कारण बन सकता है। परिवर्तन जो एंटीबॉडी की उपस्थिति में आंशिक रूप से या पूरी तरह से दब जाएंगे।

PH में तीन घटक शामिल होते हैं:

• 1) वायरस;
• 2) एंटीबॉडी युक्त सीरम;
• 3) एक जैविक वस्तु (प्रयोगशाला जानवर, चिकन भ्रूण विकसित करना, ऊतक संस्कृतियों), जिसकी पसंद वायरस के प्रकार पर निर्भर करती है जिसके साथ इसे अनुसंधान करना है।

PH का उपयोग या तो एक पृथक रोगज़नक़ की पहचान करने के लिए या सीरा में एंटीबॉडी का पता लगाने और अनुमापन करने के लिए किया जाता है। पहले मामले में, विशेष रूप से प्रतिरक्षित प्रयोगशाला जानवरों या बरामद लोगों के सीरा का उपयोग किया जाता है। दूसरे मामले में, रोग के प्रारंभिक चरण में और आरोग्य अवधि के दौरान लिए गए सीरा का उपयोग किया जाता है।

एंटीहेमग्लगुटिनिन या पूरक-फिक्सिंग एंटीबॉडी के विपरीत, बरामद लोगों के सीरा में वायरस-बेअसर करने वाले एंटीबॉडी कई वर्षों तक बने रहते हैं, और कुछ वायरल संक्रमणों (उदाहरण के लिए, खसरा) में भी जीवन के लिए बने रहते हैं। यह कुछ मामलों में एक संदर्भ दवा के रूप में कई दीक्षांत समारोह के सीरा के पूल का उपयोग करना संभव बनाता है, जो कि ampoules और lyophilization में भरने के बाद, लंबे समय तक नैदानिक ​​​​कार्य के लिए उपयुक्त है।

पृथक रोगजनकों की पहचान करते समय, विभिन्न जानवरों के पूर्व-तैयार हाइपरिम्यून सीरा का उपयोग किया जाता है: खरगोश, सफेद चूहे और चूहे, गिनी सूअर, बंदर, भेड़, घोड़े, आदि। PH के लिए हाइपरइम्यून सीरा की गतिविधि पशुओं के प्रतिरक्षण की विधि पर निर्भर करती है।

प्रत्येक न्यूट्रलाइजेशन प्रयोग को स्थापित करने से पहले, वायरस का पूर्व-अनुमापन किया जाता है, जो अंतिम कमजोर पड़ने का निर्धारण करता है जो ऊतक संस्कृति को नुकसान पहुंचाता है या प्रयोगशाला जानवरों (या चिकन भ्रूण) के संक्रमण का कारण बनता है। वायरस टिटर को 50% खुराक (TCID50 - टिशू कल्चर के लिए 50% संक्रामक खुराक) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

वायरोलॉजिकल प्रैक्टिस में आणविक आनुवंशिक निदान के तरीके। आणविक जीव विज्ञान के तरीके 50 के दशक में विकसित किए गए थे। XX सदी। वे इस तथ्य के कारण संभव हो गए कि प्रत्येक वायरस के जीनोम में अद्वितीय प्रजाति-विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम होते हैं, जिनका पता लगाकर किसी भी संक्रामक एजेंट की पहचान की जा सकती है। ये विधियां उन सूक्ष्मजीवों की पहचान करने में सबसे महत्वपूर्ण हैं जो पारंपरिक तरीकों से लंबे समय तक या मुश्किल से खेती करते हैं। 1970 के दशक में, डीएनए जांच का पता लगाने के लिए एक संक्रामक एजेंट या उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो एक पृथक डीएनए नमूने के साथ रेडियोधर्मी आइसोटोप (या फ्लोरोक्रोम) के साथ लेबल किए गए विशिष्ट ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के संकरण पर आधारित था। संकरण विश्लेषण कुछ शर्तों के तहत न्यूक्लिक एसिड की क्षमता का उपयोग न्यूक्लिक एसिड के साथ विशिष्ट परिसरों को बनाने के लिए करता है जिनके अनुक्रम उनके पूरक होते हैं। डीएनए संकरण द्वारा संक्रामक रोगजनकों का पता लगाने की विधि अत्यंत श्रमसाध्य, समय लेने वाली और महंगी निकली। इसके अलावा, नैदानिक ​​सामग्री जैसे मल और मूत्र में सूक्ष्मजीवों की पहचान के लिए इसकी संवेदनशीलता अपर्याप्त है।

डीएनए संकरण को एक ऐसे तरीके से बदल दिया गया है जो डीएनए की प्राकृतिक प्रतिकृति की नकल करता है और आपको थर्मोफिलिक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके एक निश्चित डीएनए टुकड़े का पता लगाने और बार-बार कॉपी करने की अनुमति देता है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक सुंदर तकनीक है जो प्राकृतिक डीएनए प्रतिकृति की नकल करती है और थर्मोफिलिक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करके डीएनए के एक विशिष्ट टुकड़े का पता लगाने और बार-बार कॉपी करने की अनुमति देती है।

अपने उच्च नैदानिक ​​गुणों के कारण, पीसीआर वायरोलॉजी में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक तरीकों के लिए आम तौर पर मान्यता प्राप्त अतिरिक्त है: सेल संस्कृति में वायरस का प्रसार, वायरल एंटीजन का प्रतिरक्षाविज्ञानी पता लगाना, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। इस पद्धति का एक महत्वपूर्ण लाभ अव्यक्त संक्रमणों (साइटोमेगालोवायरस, हर्पीज वायरस) और ऐसे विषाणुओं का पता लगाने की क्षमता है, जिन्हें विकसित करना मुश्किल है या अभी तक संभव नहीं है (मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस, एपस्टीन-बार वायरस, मानव पेपिलोमावायरस, विदर हेपेटाइटिस वायरस)। Creutzfeldt-Jakob रोग, अल्जाइमर रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस जैसी बीमारियों के अध्ययन की संभावनाएं पीसीआर पद्धति से जुड़ी हैं।

वायरल रोगों का ईटियोलॉजिकल निदान वायरोलॉजिकल, वायरोलॉजिकल, सीरोलॉजिकल और आणविक आनुवंशिक विधियों द्वारा किया जाता है। अंतिम तीन विधियों का उपयोग एक्सप्रेस डायग्नोस्टिक विधियों के रूप में किया जा सकता है।

वायरोलॉजिकल डायग्नोस्टिक विधि।

इस पद्धति का अंतिम लक्ष्य किसी प्रजाति या सीरोलॉजिकल वेरिएंट में वायरस की पहचान करना है।वायरोलॉजिकल विधि में कई चरण शामिल हैं:

1) अनुसंधान के लिए सामग्री का चयन;

2) वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण;

3) सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संदूषण;

4) जीवित प्रणालियों में वायरस का संकेत;

5) पृथक विषाणुओं का अनुमापन;

6) प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में वायरस की पहचान।

1. शोध के लिए सामग्री का चयन .

यह रोग के प्रारंभिक चरणों में किया जाता है, नियमों के अधीन जो विदेशी माइक्रोफ्लोरा के साथ सामग्री के संदूषण और चिकित्सा कर्मियों के संक्रमण को रोकते हैं। परिवहन के दौरान वायरस की निष्क्रियता को रोकने के लिए, सामग्री को एक वायरल ट्रांसपोर्ट माध्यम (वीटीएस) में रखा जाता है जिसमें संतुलित नमक समाधान, एंटीबायोटिक्स और सीरम एल्ब्यूमिन होता है। सामग्री को एक विशेष कंटेनर में थर्मल इन्सुलेशन और बर्फ युक्त बंद प्लास्टिक बैग के साथ ले जाया जाता है। यदि आवश्यक हो, तो सामग्री को -20˚C पर संग्रहित किया जाता है। अनुसंधान के लिए सामग्री के प्रत्येक नमूने को रोगी के नाम, सामग्री के प्रकार, नमूने की तिथि, विस्तृत नैदानिक ​​निदान और अन्य जानकारी के साथ लेबल और लेबल किया जाना चाहिए।

रोग की प्रकृति के आधार पर, अध्ययन के लिए सामग्री हो सकती है:

1) ग्रसनी के नाक भाग से और ग्रसनी से एक स्वाब;

2) मस्तिष्कमेरु द्रव;

3) मल और मलाशय की सूजन;

6) सीरस गुहाओं से तरल पदार्थ;

7) कंजाक्तिवा से धब्बा;

8) पुटिकाओं की सामग्री;

8) अनुभागीय सामग्री।

ऑरोफरीनक्स से निस्तब्धता प्राप्त करने के लिए 15-20 मिलीलीटर वीटीएस का उपयोग किया जाता है। रोगी 1 मिनट के लिए वीटीएस गले को ध्यान से धोता है और एक बाँझ शीशी में फ्लश एकत्र करता है।

ग्रसनी के पीछे से एक धब्बा एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ लिया जाता है, जीभ की जड़ पर एक स्पैटुला के साथ दबाया जाता है। स्वाब को 2-3 मिलीलीटर वीटीएस में रखा जाता है, धोया जाता है और निचोड़ा जाता है।

मस्तिष्कमेरु द्रव काठ का पंचर द्वारा प्राप्त किया जाता है। मस्तिष्कमेरु द्रव के 1-2 मिलीलीटर को एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है और प्रयोगशाला में पहुंचाया जाता है।

बाँझ शीशियों में 2-3 दिनों के भीतर मल के नमूने लिए जाते हैं। हांक के घोल का उपयोग करके प्राप्त सामग्री से 10% निलंबन तैयार किया जाता है। निलंबन को 3000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है, सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है, इसमें एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं और एक बाँझ कंटेनर में रखा जाता है।

5-10 मिलीलीटर की मात्रा में वेनिपंक्चर द्वारा प्राप्त रक्त को हेपरिन जोड़कर डिफिब्रिनेट किया जाता है। पूरा रक्त जमता नहीं है और एंटीबायोटिक्स नहीं जोड़े जाते हैं। सीरम प्राप्त करने के लिए, रक्त के नमूनों को 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जाता है।

सीरस गुहाओं से द्रव 1-2 मिलीलीटर की मात्रा में पंचर द्वारा प्राप्त किया जाता है। तरल का तुरंत उपयोग किया जाता है या जमे हुए रखा जाता है।

कंजंक्टिवा से एक स्मीयर एक बाँझ झाड़ू के साथ लिया जाता है और वीटीएस में रखा जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज और फ्रीज किया जाता है।

पुटिकाओं की सामग्री को एक पतली सुई के साथ एक सिरिंज से एस्पिरेटेड किया जाता है और वीटीएस में रखा जाता है। सामग्री को कांच की स्लाइड्स पर या सीलबंद बाँझ केशिकाओं या ampoules में सूखे स्मीयरों के रूप में प्रयोगशाला में भेजा जाता है।

सड़न रोकनेवाला के नियमों का पालन करते हुए, जितनी जल्दी हो सके अनुभागीय सामग्री ली जाती है। प्रत्येक नमूना एकत्र करने के लिए बाँझ उपकरणों के अलग-अलग सेट का उपयोग किया जाता है। चयनित ऊतकों की मात्रा 1-3 ग्राम है, जिन्हें बाँझ शीशियों में रखा जाता है। सबसे पहले, अतिरिक्त गुहा अंगों (मस्तिष्क, लिम्फ नोड्स, आदि) के नमूने लिए जाते हैं। उदर गुहा को खोलने से पहले छाती गुहा के ऊतकों को लिया जाता है। परिणामी ऊतक के नमूनों को एक मोर्टार में बाँझ रेत और बाँझ सोडियम क्लोराइड समाधान के साथ मिलाया जाता है, जिसके बाद सामग्री को सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला शीशियों में एकत्र किया जाता है, एंटीबायोटिक्स जोड़े जाते हैं। वायरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए सामग्री का तुरंत उपयोग किया जाता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

2. वायरस युक्त सामग्री का प्रसंस्करण।

यह सामग्री को बैक्टीरिया के माइक्रोफ्लोरा से मुक्त करने के लिए किया जाता है। इसके लिए भौतिक और रासायनिक विधियों का उपयोग किया जाता है।

शारीरिक तरीके:

1) विभिन्न जीवाणु फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन;

2) सेंट्रीफ्यूजेशन।

रासायनिक तरीके:

1) वायरस के अलगाव के मामलों में ईथर के साथ सामग्री का उपचार जिसमें सुपरकैप्सिड नहीं होता है;

2) सामग्री में हेप्टेन और फ़्रीऑन का मिश्रण मिलाना;

3) एंटीबायोटिक दवाओं की शुरूआत (पेनिसिलिन - 200-300 यू / एमएल; स्ट्रेप्टोमाइसिन - 200-500 माइक्रोग्राम / एमएल; निस्टैटिन - 100-1000 यू / एमएल)।

3. सामग्री के साथ संवेदनशील जीवित प्रणालियों का संक्रमण।

1) प्रयोगशाला जानवर;

2) चिकन भ्रूण;

3) अंग संस्कृतियों;

4) ऊतक संवर्धन।

प्रयोगशाला पशु. सफेद चूहे, गिनी सूअर, हम्सटर, खरगोश आदि का उपयोग किया जाता है। सफेद चूहे बड़ी संख्या में प्रकार के वायरस के प्रति सबसे अधिक संवेदनशील होते हैं। जानवरों के संक्रमण का तरीका वायरस के ऊतकों में ट्रॉपिज्म द्वारा निर्धारित किया जाता है। मस्तिष्क में संक्रमण का उपयोग न्यूरोट्रोपिक वायरस (रेबीज वायरस, पोलियोवायरस, आदि) के अलगाव में किया जाता है। इंट्रानैसल संक्रमण तब किया जाता है जब श्वसन संक्रमण के रोगजनकों को अलग किया जाता है। व्यापक रूप से इंट्रामस्क्युलर, अंतःशिरा, इंट्रापेरिटोनियल, चमड़े के नीचे और संक्रमण के अन्य तरीकों का उपयोग किया जाता है। बीमार जानवरों को ईथर के साथ euthanized किया जाता है, खोला जाता है और अंगों और ऊतकों से सामग्री ली जाती है।

चिकन भ्रूण. व्यापक रूप से उपलब्ध और उपयोग में आसान। 5 से 14 दिनों की उम्र के चिकन भ्रूण लगाएं। संक्रमण से पहले, चिकन भ्रूण को ओवोस्कोप किया जाता है: उनकी व्यवहार्यता निर्धारित की जाती है, हवा की थैली की सीमा और भ्रूण के स्थान (भ्रूण की "अंधेरे आंख") को खोल पर चिह्नित किया जाता है। चिकन भ्रूण के साथ काम एक बाँझ बॉक्स में बाँझ उपकरणों (चिमटी, सीरिंज, कैंची, भाले, आदि) के साथ किया जाता है। काम के एक टुकड़े को पूरा करने के बाद, उपकरणों को 70% एथिल अल्कोहल में डुबोया जाता है और अगले हेरफेर से पहले जला दिया जाता है। संक्रमण से पहले, एक चिकन भ्रूण के खोल को एक जलती हुई शराब झाड़ू और आयोडीन के शराब के घोल से मिटा दिया जाता है। भ्रूण में इंजेक्ट की गई परीक्षण सामग्री की मात्रा 0.1-0.2 मिली है। एक सामग्री से वायरस को अलग करने के लिए कम से कम 4 चूजे के भ्रूण का उपयोग किया जाता है।