Определяне на показанията за бактериологични, вирусологични, серологични изследвания за дешифриране на етиологията на оки и оценка на резултатите. Вирусологично изследване Какъв е смисълът на изследването

Архив на сайтове Интернет архив Wayback Machine Много често атаката на черните пиари идва неочаквано за вас. В този случай за първи път се сблъсквате с необходимостта да изучавате отблизо врага. Ако дори предположихте такова развитие на събитията (например в

4.9. Архивиране с Time Machine

4.9. Архивиране с Time Machine Mac OS X Leopard ви позволява редовно да архивирате компютъра си с помощта на приложението Time Machine. След подходящите настройки приложението автоматично ще

4.9.2. Създайте първото си архивиране с Time Machine

4.9.2. Създайте първото си архивиране с помощта на Time Machine Преди да започнете да създавате първото си архивиране, трябва или да поставите външно устройство, или да имате свободен дял на твърдия диск, отделен само за архивиране.

4.9.4. Използване на Time Machine

4.9.4. Използване на Time Machine След като сте направили необходимите настройки на Time Machine и сте създали редица резервни копия, можете да започнете да търсите и възстановявате по-ранни версии на вашите файлове. За това: 1. Отворете прозорец на Finder и изберете файла, който трябва да възстановите.2. Ако

методи за изследване на биологията на вирусите и тяхната идентификация. Във вирусологията се използват широко методи на молекулярна биология, с помощта на които е възможно да се установи молекулярната структура на вирусните частици, как те проникват в клетката и характеристиките на възпроизвеждането на вируси, първичната структура на вирусните нуклеинови киселини и протеини. Разработват се методи за определяне на последователността на съставните елементи на вирусните нуклеинови киселини и протеиновите аминокиселини. Става възможно да се свържат функциите на нуклеиновите киселини и кодираните от тях протеини с нуклеотидната последователност и да се установят причините за вътреклетъчните процеси, които играят важна роля в патогенезата на вирусна инфекция.

Методите за вирусологично изследване също се основават на имунологични процеси (взаимодействие на антиген с антитела), биологични свойства на вируса (способност за хемаглутинация, хемолиза, ензимна активност), характеристики на взаимодействието на вируса с клетката гостоприемник ( природата на цитопатичния ефект, образуването на вътреклетъчни включвания и др.).

При диагностицирането на вирусни инфекции, при култивирането, изолирането и идентифицирането на вируси, както и при приготвянето на ваксинални препарати, широко се използва методът на тъканната и клетъчната култура. Използват се първични, вторични, стабилни непрекъснати и диплоидни клетъчни култури. Първичните култури се получават чрез диспергиране на тъкани с протеолитични ензими (трипсин, колагеназа). Източник на клетки могат да бъдат тъкани и органи (по-често бъбреци) на човешки и животински ембриони. Суспензия от клетки в хранителна среда се поставя в т. нар. матраци, бутилки или петриеви панички, където след закрепване към повърхността на съда клетките започват да се размножават. За вирусна инфекция обикновено се използва клетъчен монослой. Хранителната течност се отцежда, вирусната суспензия се въвежда в определени разреждания и след контакт с клетките се добавя свежа хранителна среда, обикновено без серум.

Клетките от повечето първични култури могат да бъдат субкултивирани и се наричат ​​вторични култури. При по-нататъшно преминаване на клетките се образува популация от фибробластоподобни клетки, способни на бързо възпроизвеждане, повечето от които запазват оригиналния набор от хромозоми. Това са така наречените диплоидни клетки. При серийно култивиране на клетки се получават стабилни непрекъснати клетъчни култури. По време на пасажи се появяват бързо делящи се хомогенни клетки с хетерплоиден набор от хромозоми. Стабилните клетъчни линии могат да бъдат монослойни и суспензионни. Еднослойните култури растат под формата на непрекъснат слой върху стъклената повърхност, суспензионните култури растат под формата на суспензии в различни съдове с помощта на бъркалки. Има над 400 клетъчни линии, получени от 40 различни животински вида (включително примати, птици, влечуги, земноводни, риби, насекоми) и хора.

Части от отделни органи и тъкани (органни култури) могат да се култивират в изкуствени хранителни среди. Тези видове култури запазват тъканната структура, което е особено важно за изолирането и преминаването на вируси, които не се възпроизвеждат в недиференцирани тъканни култури (например коронавируси).

В заразени клетъчни култури вирусите могат да бъдат открити чрез промяна в клетъчната морфология, цитопатично действие, което може да бъде специфично, поява на включвания, чрез определяне на вирусни антигени в клетката и в културалната течност; определяне на биологичните свойства на вирусно потомство в културална течност и титруване на вируси в тъканна култура, пилешки ембриони или чувствителни животни; чрез откриване на отделни вирусни нуклеинови киселини в клетки чрез молекулярна хибридизация или клъстери от нуклеинови киселини чрез цитохимичен метод с помощта на флуоресцентна микроскопия.

Изолирането на вируси е трудоемък и продължителен процес. Провежда се, за да се определи вида или варианта на вируса, циркулиращ сред населението (например за идентифициране на сероварианта на грипния вирус, дивия или ваксиналния щам на полиомиелитния вирус и др.); в случаите, когато е необходимо провеждането на спешни епидемиологични мерки; когато се появят нови видове или варианти на вируси; ако е необходимо, потвърдете предварителната диагноза; за индикация на вируси в обекти на околната среда. При изолиране на вируси се взема предвид възможността за тяхното персистиране в човешкия организъм, както и възникването на смесена инфекция, причинена от два или повече вируса. Генетично хомогенна популация на вирус, получена от един вирион, се нарича вирусен клонинг, а процесът на получаването му се нарича клониране.

За изолиране на вируси се използва инфекция на податливи лабораторни животни, пилешки ембриони, но най-често се използва тъканна култура. Наличието на вирус обикновено се определя от специфична клетъчна дегенерация (цитопатичен ефект), образуване на симпласти и синцитии, откриване на вътреклетъчни включвания, както и специфичен антиген, открит чрез имунофлуоресценция, хемадсорбция, хемаглутинация (при хемаглутиниращи вируси) и др. . Тези признаци могат да бъдат открити само след 2-3 пасажа на вируса.

За изолирането на редица вируси, като например грипните вируси, се използват пилешки ембриони, за изолирането на някои вируси Coxsackie и редица арбовируси се използват новородени мишки. Идентифицирането на изолирани вируси се извършва с помощта на серологични тестове и други методи.

При работа с вируси се определя техният титър. Титруването на вируси обикновено се извършва в тъканна култура, като се определя най-високото разреждане на течността, съдържаща вируса, при която настъпва тъканна дегенерация, образуват се включвания и вирус-специфични антигени. Методът на плаката може да се използва за титруване на редица вируси. Плаките или отрицателните колонии от вируси са огнища на унищожени от вируса клетки на еднослойна тъканна култура под агарово покритие. Преброяването на колониите позволява количествен анализ на инфекциозната активност на вирусите въз основа на това, че една инфекциозна вирусна частица образува една плака. Плаките се идентифицират чрез оцветяване на културата с витални багрила, обикновено неутрално червено; плаките не адсорбират боята и затова се виждат като светли петна на фона на оцветени живи клетки. Титърът на вируса се изразява като брой образуващи плака единици в 1 мл.

Пречистването и концентрирането на вирусите обикновено се извършва чрез диференциално ултрацентрофугиране, последвано от центрофугиране в градиенти на концентрация или плътност. За пречистване на вируси се използват имунологични методи, йонообменна хроматография, имуносорбенти и др.

Лабораторната диагностика на вирусни инфекции включва откриване на патогена или неговите компоненти в клиничен материал; изолиране на вируса от този материал; серодиагностика. Изборът на лабораторен диагностичен метод във всеки отделен случай зависи от естеството на заболяването, периода на заболяването и възможностите на лабораторията. Съвременната диагностика на вирусни инфекции се основава на експресни методи, които ви позволяват да получите отговор няколко часа след вземане на клиничен материал в ранните етапи след заболяването.Те включват електронна и имунна електронна микроскопия, както и имунофлуоресценция, метод на молекулярна хибридизация. , откриване на антитела от клас IgM и др.

Електронната микроскопия на отрицателно оцветените вируси позволява диференциране на вирусите и определяне на тяхната концентрация. Използването на електронна микроскопия при диагностицирането на вирусни инфекции е ограничено до случаите, когато концентрацията на вирусни частици в клиничния материал е достатъчно висока (10 5 в 1 мли по-високи). Недостатъкът на метода е невъзможността да се прави разлика между вируси, принадлежащи към една и съща таксономична група. Този недостатък се елиминира чрез използване на имунна електронна микроскопия. Методът се основава на образуването на имунни комплекси, когато специфичен серум се добавя към вирусни частици, докато се получава едновременна концентрация на вирусни частици, което прави възможно тяхното идентифициране. Методът се използва и за откриване на антитела. За целите на експресната диагностика се извършва електронно микроскопско изследване на тъканни екстракти, изпражнения, течност от везикули и секрети от назофаринкса. Електронната микроскопия се използва широко за изследване на морфогенезата на вируса, нейните възможности се разширяват с използването на белязани антитела.

Методът на молекулярната хибридизация, базиран на откриването на специфични за вируса нуклеинови киселини, дава възможност за откриване на единични копия на гени и няма равен по отношение на чувствителността. Реакцията се основава на хибридизацията на комплементарни вериги на ДНК или РНК (сонди) и образуването на двойноверижни структури. Най-евтината сонда е клонирана рекомбинантна ДНК. Сондата е белязана с радиоактивни прекурсори (обикновено радиоактивен фосфор). Използването на колориметрични реакции е обещаващо. Има няколко варианта на молекулярна хибридизация: точкова хибридизация, блот хибридизация, сандвич хибридизация, in situ хибридизация и др.

Антителата от клас lgM се появяват по-рано от антителата от клас G (на 3-5-ия ден от заболяването) и изчезват след няколко седмици, така че тяхното откриване показва скорошна инфекция. Антитела от клас IgM се откриват чрез имунофлуоресценция или ензимен имуноанализ, като се използват анти-μ антисеруми (анти-IgM тежковерижни серуми).

Серологичните методи във вирусологията се основават на класически имунологични реакции (виж Имунологични методи на изследване) : реакции на свързване на комплемента, инхибиране на хемаглутинацията, биологична неутрализация, имунодифузия, индиректна хемаглутинация, радиална хемолиза, имунофлуоресценция, ензимен имуноанализ, радиоимуноанализ. Разработени са микрометоди за много реакции и техните техники непрекъснато се подобряват. Тези методи се използват за идентифициране на вируси с помощта на набор от известни серуми и за серодиагностика, за да се определи увеличението на антителата във втория серум в сравнение с първия (първият серум се взема в първите дни след заболяването, вторият - след 2-3 седмици). Диагностичната стойност е не по-малко от четирикратно увеличение на антителата във втория серум. Ако откриването на антитела от клас lgM показва скорошна инфекция, тогава антителата от клас lgC персистират няколко години, а понякога и цял живот.

За идентифициране на отделни антигени на вируси и антитела към тях в сложни смеси без предварително пречистване на протеини се използва имуноблотинг. Методът съчетава протеиново фракциониране чрез електрофореза в полиакриламиден гел с последващ имуноанализ на протеини чрез ензимен имуноанализ. Разделянето на протеини намалява изискванията за химическа чистота на антигена и дава възможност за идентифициране на отделни двойки антиген-антитяло. Тази задача е от значение, например, при серодиагностиката на HIV инфекцията, където фалшиво положителни реакции на ензимен имуноанализ се дължат на наличието на антитела срещу клетъчни антигени, които присъстват в резултат на недостатъчно пречистване на вирусни протеини. Идентифицирането на антитела в серума на пациенти срещу вътрешни и външни вирусни антигени позволява да се определи стадият на заболяването, а при анализа на популациите - променливостта на вирусните протеини. Имуноблотингът при HIV инфекция се използва като потвърдителен тест за откриване на отделни вирусни антигени и антитела към тях. При анализиране на популациите методът се използва за определяне на вариабилността на вирусните протеини. Голямата стойност на метода е във възможността за анализиране на антигени, синтезирани чрез рекомбинантна ДНК технология, установяване на техния размер и наличие на антигенни детерминанти.

20) Основният структурен компонент на вирионите (пълни вирусни частици) е нуклеокапсид, т.е. протеиновата обвивка (капсид), която обхваща вирусния геном (ДНК или РНК). Нуклеокапсидът на повечето вирусни семейства е заобиколен от липопротеинова обвивка. Между обвивката и нуклеокапсида при някои вируси (орто-, парамиксо-, рабдо-, фило- и ретровируси) има негликозилиран матричен протеин, който придава допълнителна твърдост на вирионите. Вирусите на повечето семейства имат обвивка, която играе важна роля в инфекциозността. Вирионите придобиват външния слой на обвивката, когато нуклеокапсидът проникне през клетъчната мембрана чрез пъпкуване. Протеините на обвивката се кодират от вируса, а липидите се заемат от клетъчната мембрана. Гликопротеините обикновено под формата на димери и тримери образуват пепломери (издатини) на повърхността на вирионите (орто-, парамиксовируси, рабдо-, фило-, корона-, буня-, арена-, ретровируси). Гликозилираните слети протеини са свързани с пепломери и играят ключова роля при навлизането на вируса в клетката. Капсидите и обвивките на вирионите се образуват от много копия на един или повече видове протеинови субединици в резултат на процес на самосглобяване. Взаимодействието в системата протеин-протеин, поради слаби химични връзки, води до обединяване на симетрични капсиди. Разликите във вирусите във формата и размера на вирионите зависят от формата, размера и броя на структурните протеинови субединици и естеството на взаимодействието между тях. Капсидът се състои от много морфологично изразени субединици (капсомери), събрани от вирусни полипептиди по строго определен начин, в съответствие с относително прости геометрични принципи. Протеиновите субединици, свързващи се помежду си, образуват капсиди от два вида симетрия: изометрична и спирална. Структурата на нуклеокапсида на вирусите с обвивка е подобна на структурата на нуклеокапсида на вирусите без обвивка. На повърхността на обвивката на вирусите се разграничават морфологично изразени гликопротеинови структури - пепломери. Съставът на суперкапсидната мембрана включва липиди (до 20-35%) и въглехидрати (до 7-8%), които имат клетъчен произход. Състои се от двоен слой от клетъчни липиди и специфични за вируса протеини, разположени извън и вътре в липидния биослой. Външният слой на суперкапсидната мембрана е представен от един или повече видове пеплометри (издатини), състоящи се от една или повече гликопротеинови молекули. Нуклеокапсидът на вирусите с обвивка често се нарича ядро, докато централната част на вирионите, съдържаща нуклеиновата киселина, се нарича нуклеоид. Капсомерите (пепломери) се състоят от структурни единици, изградени от една или няколко хомоложни или хетероложни полипептидни вериги (протеинови субединици). класификация на вирусите Изометричните капсиди не са сфери, а правилни полиедри (икозаедри). Техните линейни размери са еднакви по осите на симетрия. Според Каспар и Клуг (1962), капсомерите в капсидите са подредени според икосаедрична симетрия. Такива капсиди се състоят от идентични субединици, образуващи икосаедър. Те имат 12 върха (ъгли), 30 лица и 20 повърхности под формата на равнобедрени триъгълници. В съответствие с това правило капсидът на вируса на полиомиелита и вируса на шап се образува от 60 протеинови структурни единици, всяка от които се състои от четири полипептидни вериги. Икосаедърът оптимално решава проблема с опаковането на повтарящи се субединици в строга компактна структура с минимален обем. Само някои конфигурации на структурни субединици могат да образуват повърхностите, върховете и лицата на вирусния икосаедър. Например, структурните субединици на аденовируса образуват хексагонални капсомери (хексони) по повърхностите и лицата и петоъгълни капсомери (пептони) по върховете. При някои вируси и двата типа капсомери се образуват от едни и същи полипептиди, при други от различни полипептиди. Тъй като структурните субединици на различните вируси се различават една от друга, някои вируси изглеждат по-шестоъгълни, други по-сферични. Всички известни ДНК-съдържащи вируси на гръбначни животни, с изключение на вирусите на едра шарка, както и много РНК-съдържащи вируси (7 семейства) имат тип симетрия на кубичен капсид. Реовирусите, за разлика от другите гръбначни вируси, имат двоен капсид (външен и вътрешен), всеки от които се състои от морфологични единици. Вирусите със спирален тип на симетрия имат формата на цилиндрична нишковидна структура, тяхната геномна РНК има формата на спирала и е разположена вътре в капсида. Всички животински вируси със спирална симетрия са заобиколени от липопротеинова обвивка. Спиралните нуклеокапсиди се характеризират с дължина, диаметър, стъпка на спиралата и брой капсомери на завъртане на спиралата. И така, при вируса Сендай (парамиксовирус) нуклеокапсидът е спирала с дължина около 1 μm, диаметър 20 nm и стъпка на спиралата 5 nm. Капсидът се състои от приблизително 2400 структурни единици, всяка от които е протеин с молекулно тегло 60 kD. Има 11-13 субединици на завъртане на спиралата. При вируси със спирален тип нуклеокапсидна симетрия, нагъването на протеиновите молекули в спирала осигурява максимално взаимодействие между нуклеиновата киселина и протеиновите субединици. При икосаедричните вируси нуклеиновата киселина е навита вътре във вирионите и взаимодейства с един или повече полипептиди, разположени вътре в капсида.

Антирецептори (рецептори) Вирусни- повърхностни вирионни протеини, например хемаглутинин, които се свързват по комплементарен начин със съответния рецептор на чувствителна клетка.

21) Имунологични методи във вирусологичните изследвания.

Серологичните тестове се различават по способността си да откриват отделни класове антитела. Тестът за аглутинация, например, е добър за откриване на IgM антитела, но е по-малко чувствителен за откриване на IgG антитела. Тестовете за фиксиране на комплемента и хемолизата, които изискват участието на комплемента, не откриват антитела, които не добавят комплемент, като IgA антитела и IgE антитела. Само антитела, насочени срещу антигенни детерминанти на повърхността на вириона, свързани с патогенността, участват в реакцията на неутрализация на вируса. Чувствителност I. m. и. превъзхожда всички други методи за изследване на антигени и антитела, по-специално радиоимуноанализът и ензимният имуноанализ могат да уловят наличието на протеин в количества, измерени в нанограми и дори в пикограми. С помощта на И. м. и. определяне на групата и проверка на безопасността на кръвта (хепатит В и HIV инфекция). При трансплантация на тъкани и органи на И. m. позволяват определяне на тъканна съвместимост и тестване на методи за потискане на несъвместимостта. В съдебната медицина реакцията на Кастелани се използва за определяне на видовата специфичност на протеина и реакцията на аглутинация за определяне на кръвната група.

Имунологичните методи се използват широко в лабораторната диагностика на инфекциозни заболявания. Етиологията на заболяването също се установява въз основа на увеличаването на антителата срещу патогена в кръвния серум на реконвалесцента в сравнение с пробата, взета в първите дни на заболяването. Въз основа на I. m. и. проучване на имунитета на населението по отношение на масови инфекции, като грип, и също така оценка на ефективността на превантивните ваксинации.

В зависимост от техния механизъм и отчитането на резултатите I. m. и. могат да бъдат разделени на реакции, основани на феномена на аглутинация; реакции, базирани на явлението утаяване; реакции, включващи комплемент; реакция на неутрализация; реакции, използващи химични и физични методи.

Реакции, основани на явлението аглутинация. Аглутинацията е залепването на клетки или отделни частици - носители на антиген с помощта на имунен серум към този антиген.

Тестът за бактериална аглутинация с помощта на подходящ антибактериален серум е един от най-простите серологични тестове. Към различни разреждания на тествания кръвен серум се добавя суспензия от бактерии и след определено време на контакт при t ° 37 ° се записва при кое най-високо разреждане на кръвния серум се получава аглутинация. Реакцията на аглутинация на бактериите се използва за диагностициране на много инфекциозни заболявания: бруцелоза, туларемия, коремен тиф и паратиф, бациларна дизентерия и тиф.

Реакцията на пасивна или индиректна хемаглутинация (RPGA, RNGA). Използва еритроцити или неутрални синтетични материали (например латексови частици), върху повърхността на които са адсорбирани антигени (бактериални, вирусни, тъканни) или антитела. Тяхната аглутинация възниква, когато се добавят съответните серуми или антигени.

Реакцията на пасивна хемаглутинация се използва за диагностициране на заболявания, причинени от бактерии (тиф и паратиф, дизентерия, бруцелоза, чума, холера и др.), протозои (малария) и вируси (грип, аденовирусни инфекции, вирусен хепатит В, морбили, кърлежи). енцефалит, кримска хеморагична треска и др.), както и за определяне на определени хормони, за идентифициране на свръхчувствителност на пациента към лекарства и хормони, като пеницилин и инсулин.

Тестът за инхибиране на хемаглутинацията (HITA) се основава на феномена на предотвратяване (инхибиране) на имунния серум на хемаглутинация на еритроцити от вируси и се използва за откриване и титриране на антивирусни антитела. Той служи като основен метод за серодиагностика на грип, морбили, рубеола, паротит, кърлежов енцефалит и други вирусни инфекции, чиито причинители имат хемаглутиниращи свойства. например, за серодиагностика на енцефалит, пренасян от кърлежи, двукратни разреждания на серума на пациента в алкален боратен буферен разтвор се изсипват в ямките на панела. След това се добавя определено количество, обикновено 8 AU (аглутиниращи единици), антиген на енцефалит, пренасян от кърлежи, и след 18 часа експозиция при t ° 4 ° се добавя суспензия от гъши еритроцити, приготвена в кисел разтвор на фосфатен буфер. Ако в кръвния серум на пациента има антитела срещу вируса на енцефалит, пренасян от кърлежи, тогава антигенът се неутрализира и аглутинацията на еритроцитите не настъпва.

Реакции, базирани на явлението утаяване. Преципитацията възниква в резултат на взаимодействието на антитела с разтворими антигени. Най-простият пример за реакция на утаяване е образуването на непрозрачна ивица на утаяване в епруветка на границата на наслояване на антиген върху антитяло. Широко използвани са различни видове реакции на утаяване в полутечни агарови или агарозни гелове (метод на двойна имунодифузия на Ouchterlon, метод на радиална имунодифузия, имуноелектрофореза), които са както качествени, така и количествени. В резултат на свободна дифузия в гела на антигени и антитела в зоната на тяхното оптимално съотношение се образуват специфични комплекси - преципитационни ленти, които се откриват визуално или чрез оцветяване. Характеристика на метода е, че всяка двойка антиген-антитяло образува индивидуална преципитационна лента и реакцията не зависи от наличието на други антигени и антитела в изследваната система.

Реакциите, включващи комплемент, който е свеж серум от морско свинче, се основават на способността на субкомпонента на Clq комплемента и след това на други компоненти на комплемента да се прикрепят към имунните комплекси.

Реакцията на свързване на комплемента (CFR) позволява титруване на антигени или антитела според степента на фиксиране на комплемента от комплекса антиген-антитяло. Тази реакция се състои от две фази: взаимодействието на антигена с тестовия кръвен серум (тестова система) и взаимодействието на хемолитичния серум с овчи еритроцити (индикаторна система). При положителна реакция възниква фиксиране на комплемента в изследваната система и след това, при добавяне на чувствителни към антитела еритроцити, не се наблюдава хемолиза. Реакцията се използва за серодиагностика на сифилис (реакция на Васерман), вирусни и бактериални инфекции.

Реакцията на неутрализация се основава на способността на антителата да неутрализират определени специфични функции на макромолекулни или разтворими антигени, като ензимна активност, бактериални токсини и патогенността на вирусите. Реакцията на неутрализация на токсините може да се оцени чрез биологичния ефект, например се титруват антитетанични и антиботулинови серуми. Смес от токсин и антисерум, приложена на животни, не причинява тяхната смърт. Във вирусологията се използват различни варианти на реакцията на неутрализация. Когато вирусите се смесят с подходящ антисерум и тази смес се приложи на животни или клетъчни култури, патогенността на вирусите се неутрализира и животните не се разболяват и клетките на културите не претърпяват разрушаване.

Реакции, използващи химични и физични етикети. Имунофлуоресценцията се състои в използването на белязани с флуорохром антитела, по-точно имуноглобулиновата фракция на IgG антителата. Антитяло, белязано с флуорохром, образува комплекс антиген-антитяло с антигена, който става достъпен за наблюдение под микроскоп в UV лъчи, които възбуждат луминесценцията на флуорохрома. Реакцията на директна имунофлуоресценция се използва за изследване на клетъчни антигени, откриване на вирус в заразени клетки и откриване на бактерии и рикетсии в цитонамазки.

По-широко се използва методът на индиректната имунофлуоресценция. се основава на откриването на комплекс антиген-антитяло с помощта на луминесцентни анти-lgG антитяло серуми и се използва за откриване не само на антигени, но и за титруване на антитела.

Имуноензимните или ензимните имунологични методи се основават на използването на антитела, конюгирани с ензими, главно пероксидаза от хрян или алкална фосфатаза. Подобно на имунофлуоресценцията, ензимният имуноанализ се използва за откриване на антигени в клетки или за титриране на антитела върху клетки, съдържащи антиген.

Радиоимунологичният метод се основава на използването на радиоизотопно маркиране на антигени или антитела. Това е най-чувствителният метод за определяне на антигени и антитела, използва се за определяне на хормони, лекарства и антибиотици, за диагностика на бактериални, вирусни, рикетсиозни, протозойни заболявания, изследване на кръвни протеини, тъканни антигени.

Имуноблотингът се използва за откриване на антитела срещу отделни антигени или за "разпознаване" на антигени от известни серуми. Методът се състои от 3 етапа: разделяне на биологични макромолекули (например вирус) на отделни протеини чрез електрофореза в полиакриламиден гел; прехвърляне на отделените протеини от гела върху твърда подложка (блот) чрез нанасяне на полиакриламидна гелна плоча върху активирана хартия или нитроцелулоза (електроблот); откриване на желаните протеини върху субстрата чрез директен или индиректен ензимен имуноанализ. Като диагностичен метод, имуноблотингът се използва за HIV инфекция. Диагностичната стойност е откриването на антитела към един от протеините на външната обвивка на вируса.

22) Видове симетрия на вируси (кубични, спирални, смесени). Взаимодействие на протеини и нуклеинови киселини в опаковката на вирусни геноми.

В зависимост от взаимодействието на капсида с нуклеиновата киселина, вирусните частици могат да бъдат разделени на няколко вида симетрия:

1). Тип кубична симетрия.

Кубичните капсиди са икосидери с приблизително 20 триъгълни повърхности и 12 върха. Те образуват структура, наподобяваща сферична формация, но всъщност това е полиедър. В някои случаи към върховете на такива икосаедрични полиедри са прикрепени специални липопротеинови образувания, наречени шипове. Ролята на тези шипове вероятно се свежда до взаимодействието на вириони или вирусни частици със съответните области на клетките гостоприемници, които са чувствителни към тях. С кубична симетрия, вирусната нуклеинова киселина е опакована плътно (навита на топка), а протеиновите молекули я обграждат, образувайки полиедър (икозаедър). Икосаедърът е многостен с двадесет триъгълни лица, който има кубична симетрия и приблизително сферична форма. Икосаедричните вируси включват херпес симплекс вирус, реовируси и др.

2). Тип спирала на симетрия. Спиралните капсиди са малко по-прости. Тези. Капсомерите, които изграждат капсида, покриват спиралната NK и също така образуват доста стабилна протеинова обвивка на тези вируси. И когато се използват електронни микроскопи с висока разделителна способност и подходящи методи за подготовка, могат да се видят спирални структури върху вирусите. При спирална симетрия на капсида, вирусната нуклеинова киселина образува спирална (или спирална) фигура, куха отвътре, а протеиновите субединици (капсомери) също са подредени около нея в спирала (тръбен капсид). Пример за вирус със спирална симетрия на капсида е вирусът на тютюневата мозайка, който има пръчковидна форма и дължината му е 300 nm с диаметър 15 nm. Съставът на вирусна частица включва една РНК молекула с размер около 6000 нуклеотида. Капсидът е изграден от 2000 идентични протеинови субединици, подредени в спирала.

3). Смесен или сложен тип симетрия. По правило този тип симетрия се среща главно сред бактериалните вируси. И класически примери са тези фаги, E. coli или умерените фаги. Това са сложни образувания, които имат глава с вътрешно нуклеиново съдържание, различни видове придатъци, опашен процес и устройство с различна степен на сложност. И всеки компонент на такива частици е надарен със специфична функция, която се реализира в процеса на взаимодействие между вируса и клетката. С други думи, сложен тип симетрия е комбинация от кубична симетрия, главата е икозиден полиедър и пръчковидни образувания са опашните процеси. Въпреки че сред бактериалните вируси има и доста просто организирани вириони, които са примитивни нуклеокапсиди, сферични или кубични. Бактериалните вируси са по-сложни от растителните и животинските вируси.

24) Взаимодействие на фаг с клетка. Вирулентни и умерени фаги.

Адсорбция.

Взаимодействието започва с прикрепването на вирусните частици към клетъчната повърхност. Процесът става възможен при наличие на подходящи рецептори на повърхността на клетката и антирецептори на повърхността на вирусната частица.

Вирусите използват клетъчни рецептори, предназначени да транспортират основни вещества: хранителни частици, хормони, растежни фактори и др.

Рецептори: протеини, въглехидратен компонент на протеини и липиди, липиди. Специфични рецептори определят по-нататъшната съдба на вирусната частица (транспорт, доставка до области на цитоплазмата или ядрото). Вирусът може да се прикрепи към неспецифични рецептори и дори да проникне в клетката. Този процес обаче не причинява инфекция.

Първоначално се образува единична връзка между антирецептора и рецептора. Тази връзка е крехка и може да се скъса. За образуването на необратима адсорбция е необходимо многовалентно прикрепване. Стабилното свързване възниква поради свободното движение на рецепторните молекули в мембраната. По време на взаимодействието на вируса с клетката се наблюдава повишаване на течливостта на липидите и образуването на рецепторни полета в зоната на взаимодействие между вируса и клетката. Рецепторите на редица вируси могат да присъстват само в ограничен набор от клетки гостоприемници. Това определя чувствителността на организма към този вирус. По този начин вирусната ДНК и РНК имат способността да инфектират по-широк кръг от клетки гостоприемници.

Антирецепторите могат да бъдат намерени в уникални вирусни органели: израстъчни структури в Т-бактериофагите, влакна в аденовирусите, шипове на повърхността на вирусните мембрани, корона в коронавирусите.

Проникване.

2 механизма - рецепторна ендоцитоза и мембранно сливане.

Рецепторна ендоцитоза:

Обичайният механизъм за навлизане на хранителни и регулаторни вещества в клетката. Среща се в специализирани зони - там, където има специални ями, покрити с клатрин, специфични рецептори са разположени на дъното на ямата. Ямките осигуряват бърза инвагинация и образуване на вакуоли, покрити с клатрин (от момента на адсорбция не минават повече от 10 минути, за една минута могат да се образуват до 2000 вакуоли). Вакуолите се сливат с по-големи цитоплазмени вакуоли, за да образуват рецепторозоми (вече не съдържащи клатрин), които на свой ред се сливат с лизозоми.

Сливане на вирусни и клетъчни мембрани:

При вируси с обвивка сливането се медиира от точкови взаимодействия на вирусния протеин с липидите на клетъчната мембрана, което води до интегриране на вирусната липопротеинова обвивка с клетъчната мембрана. При вирусите без обвивка един от повърхностните протеини също взаимодейства с липидите на клетъчната мембрана и вътрешният компонент преминава през мембраната (при парамиксовирусите F-протеинът; при ортомиксовирусите хемаглутиниращата субединица НА2). Конформацията на повърхностните протеини се влияе от pH.

Лента.

В този процес инфекциозната активност изчезва, често се появява чувствителност към нуклеази и възниква резистентност към антитела. Крайният продукт от събличането са нуклеинови киселини, свързани с вътрешен вирусен протеин. Етапът на събличане също ограничава възможността за инфекция (вирусите не могат да се съблекат във всяка клетка). Събличането се извършва в специализирани области на клетката: лизозоми, апарат на Голджи и перинуклеарно пространство.

Събличането става в резултат на поредица от реакции. Например при пикорнавирусите събличането протича с образуването на междинни субвирусни частици с размери от 156 до 12S. В аденовирусите в цитоплазмата и ядрените пори има най-малко 3 етапа:

Образуване на субвирусни частици с по-висока плътност от вирионите;

Образуване на ядра, в които липсват 3 вирусни протеина;

Образуване на ДНК-протеинов комплекс, в който ДНК е ковалентно свързана с краен протеин.

Характеризиране на вирулентни и умерени фаги.

Когато една бактерия е заразена с фаг, възниква така наречената литична инфекция, т.е. инфекция, която завършва с лизиране на клетката гостоприемник, но това е характерно само за така наречените вирулентни фаги, чието взаимодействие с клетката води до клетъчна смърт и образуване на фагово потомство.

В този случай се разграничават следните етапи според взаимодействията на фага с клетката: смесване на фага с клетъчната култура (множествеността на инфекцията е 1 фаг на 10 клетки), като концентрацията трябва да бъде достатъчно висока, така че фагите могат да контактуват с клетките. За да се избегне повторна инфекция - след заразяване за максимум 5 минути, когато фагите се адсорбират - тази смес от клетки с фаг се разрежда. Има латентен период, през който броят на фагите не се увеличава, след това много кратък период на излизане, когато броят на фаговите частици се увеличава рязко, когато клетката лизира и фаговото потомство се освобождава и след това броят на фагите остава на нивото същото ниво, тъй като не се случва повторно заразяване. Въз основа на тази крива могат да се разграничат тези фази: вегетативният период на "растеж" (латентен период), изходният период и да се изчисли добивът на фаг на 1 заразена клетка. По време на латентния период в бактериите не може да се намери нищо подобно на фагови частици и не е възможно да се изолира инфекциозният принцип от такива клетки в латентния период. Само зрели фагови частици могат да заразят бактериите. По този начин вирулентните фаги винаги причиняват смъртта на бактериите и предизвикват инфекция, която се разкрива в производството на нови вирусни частици, способни да заразят следващите и други чувствителни клетки.

За разлика от вирулентните, инфекцията с умерени фаги не води до лизиране на бактериални клетки, но се осъществява образуването на специално състояние на съвместно съществуване на фаг с бактериална клетка. Това съвместно съществуване се изразява в това, че определено начало на фага присъства в бактериалната клетка без неблагоприятни условия за това и се запазва от поколение на поколение. На определени етапи от такова съвместно съществуване фагът се активира в клетката и влиза в състояние на литичен цикъл на развитие, причинявайки клетъчен лизис и освобождаване на фагово потомство. Такива фаги се наричат ​​лизогенни или умерени фаги, а състоянието на умерено съществуване с фага е лизогения, а бактериите, които съдържат такъв латентен фаг, се наричат ​​лизогенни бактерии. Терминът лизогенни бактерии идва от факта, че веднъж са открити култури, в които спонтанно се появява фаг, и този бактериофаг започва да се счита за замърсяване на културата, тоест бактериален вирус навлиза в културата и такива култури се наричат ​​лизогенни, тоест, те генерират лизис.

Вирусите, за разлика от бактериите, се възпроизвеждат само в живи клетки. В тази връзка култивирането на вируси може да се извърши на ниво организъм на опитно животно (пилешкият ембрион като развиващ се организъм се означава като опитни животни) или жива клетка, отгледана извън тялото, т.е. на ниво клетъчна култура.

Използване на лабораторни животни. Един от методите за изолиране и култивиране на вируси е заразяването на лабораторни животни. Те се използват за изолиране на вируси, които не предизвикват развитие на цитопатични промени в клетъчните култури и не се размножават в пилешки ембриони. Използването на лабораторни животни също дава възможност да се идентифицира естеството на вирусната инфекция чрез комплекса от клинични симптоми. Като лабораторни животни най-често се използват бели мишки, хамстери, морски свинчета и зайци в зависимост от целта на работата и вида на изследваните вируси. От по-големите животни се използват маймуни от различни видове и някои други животни. От птици използвайте пилета, гъски, патици. През последните години новородени животни (по-податливи на вируси), „стерилни животни“ (извлечени от матката и държани при стерилни условия, като се използва стерилен въздух и стерилизирана храна) и животни от чисти линии с известна наследственост (инбридни или линейни животни) по-често използвани.

В експеримента се вземат само здрави животни, за предпочитане от един разсадник и една партида. Телесната температура се измерва по едно и също време, тъй като в нея има дневни колебания. Тестовият материал се прилага, като се вземе предвид тропизма на вирусите към определени тъкани. И така, за изолиране на неутротропни вируси материалът се инжектира в мозъка, за изолиране на пневмотропни вируси - през носа (под лека етерна анестезия).

При лабораторни животни, след заразяване с вируссъдържащ материал, е важно да се вземе материал за по-нататъшно изследване своевременно и правилно и асептично. Резултатите от изолирането на вируса се считат за положителни, ако животното развие симптоми на инфекция след подходящ инкубационен период.

Използване на пилешки ембриони. В тъканите на ембриона, неговите мембрани, жълтъчната торбичка, много патогенни човешки и животински вируси могат да се размножават. В този случай селективността на вирусите към определена тъкан е важна: вирусите на едра шарка се възпроизвеждат добре и се натрупват в клетките на хорион-алантоисната мембрана, вирусът на паротит - в амниона, вирусите на грипа - в амниона и алантоиса, вирусът на бяс - в жълтъчната торбичка.

Култивирането на вируси в развиващите се ембриони има редица предимства пред други методи: плътна обвивка доста надеждно защитава вътрешното съдържание от микроби; при заразяване на пилешки ембриони се получава по-голям добив на вируссъдържащ материал, отколкото при други методи на култивиране; методът за заразяване на пилешки ембриони е прост и достъпен за всяка вирусологична лаборатория; ембрионите имат достатъчна жизнеспособност и устойчивост на патогени на външни фактори. Въпреки това, пилешките ембриони не винаги са свободни от латентни вирусни и бактериални инфекции. Трудно е да се наблюдава динамиката на патологичните промени, настъпващи в ембриона след заразяване с вирус. Аутопсията на заразени ембриони често не разкрива видими промени и открива вируса с помощта на хемаглутинационен тест и други методи. При заразени ембриони е невъзможно да се проследи нарастването на титъра на антителата. Методът не е подходящ за всички вируси.

За вирусологични изследвания се използват ембриони на възраст 7-12 дни, които са получени от птицеферми. Можете да отглеждате ембриони в конвенционален термостат, на дъното на който се поставят тави с вода за овлажняване на въздуха. Температурата в термостата трябва да бъде 37 ° C, а влажността трябва да бъде 60-65%. Изберете едри, чисти (но немити) оплодени яйца от бели пилета, съхранявани не повече от 10 дни при температура 5-10°C. Оплодените яйца се разпознават по наличието на зародишен диск, който при прозиране с овоскоп изглежда като тъмно петно.

При работа с вируси могат да се използват различни методи за заразяване на ембриони, но най-практичното приложение е прилагането на вируса върху хорион-алантоисната мембрана, въвеждането в алантоисната, амниотичната кухина и жълтъчната торбичка

(фиг. 10.5). Изборът на метод зависи от биологичните свойства на изследвания вирус.

Ориз. 10.5.

Преди заразяването жизнеспособността на ембриона се определя на овоскоп. Живите ембриони са подвижни, пулсацията на съдовете на мембраните е ясно видима. При свещене маркирайте с обикновен молив върху черупката границите на въздушния мехур или мястото на зародиша, което се определя от сянката му върху черупката.

Пилешките ембриони се заразяват в кутия при строго асептични условия с помощта на инструменти, стерилизирани чрез кипене.

При заразяване върху хорион-алантоисната мембрана най-подходящи са 12-дневни ембриони. За инфекция в алантоисната кухина се използват ембриони на възраст 10-11 дни, в амниотичната кухина - ембриони на възраст 7-11 дни, в жълтъчната торбичка - ембриони на възраст 7 дни.

Яйцата със заразени ембриони се поставят на поставки с тъпия край нагоре. Температурният режим и инкубационният период зависят от биологичните свойства на инокулирания вирус. Жизнеспособността на ембрионите се следи ежедневно под овоскоп. Не се изследват ембриони, умрели в първия ден след заразяването поради нараняване.

Преди събирането на материала ембрионите се охлаждат при 4 °C в продължение на 18-20 часа, за да се свият съдовете и да се предотврати кървене при аутопсия. Ембрионите се отварят в кутията при спазване на правилата за асептика.

Алантоичната течност се изсмуква с пипета, стерилността се контролира чрез инокулация в захарен или месно-пептонен бульон, проверява се за наличие на вирус в реакцията на хемаглутинация и се съхранява при 4 ° C в замразено състояние.

За получаване на околоплодна течност първо се аспирира алантоичната течност, след това околоплодната мембрана се улавя с пинсета, леко се повдига и околоплодната течност се изсмуква с пастьорска пипета.

При изследване на промените в хорион-алантоисната мембрана, тя се нарязва с ножица и цялото съдържание се излива през отвора в петриево блюдо. Хорион-алантоисната мембрана остава вътре в черупката и се отстранява с пинсети в петриево блюдо с физиологичен разтвор. Тук се измива, изправя и естеството на фокалните лезии се изучава на тъмен фон.

За да се получи амниотичната мембрана, амниотичният сак, в който е затворен ембрионът, се отрязва и освобождава от ембриона, като се изследва за лезии.

За получаване на жълтъчната ципа се разрязва хорион-алантоисът, изсмукват се алантоисната и околоплодната течност, плодът се изважда с пинсета, отделя се от пъпната връв, хваща се жълтъчната торбичка и се поставя в петриево блюдо. Контрол за стерилност, оглед за наличие на лезии. Жълтъкът, ако е необходимо, може да се извади със спринцовка, без да се отстранява жълтъчната торбичка.

Наличието на вируса в алантоисната и амниотичната течност на заразения ембрион се определя чрез хемаглутинационен тест. Течности от хемаглутинационни положителни ембриони след изследване за стерилност се събират и титруват в разширен хемаглутинационен тест.

При наличие на малко количество вирус или невъзможност за откриването му в тестовия материал се извършват последователни пасажи върху пилешки ембриони. Ако след три последователни пасажа върху ембриони вирусът не се открие в тестовия материал, резултатът се счита за отрицателен.

Използване на клетъчни култури. Култивирането на клетки извън тялото изисква изпълнението на редица условия. Едно от тях е стриктното спазване на стерилността по време на работа, тъй като използваните хранителни среди са отличен хранителен субстрат и за бактерии и гъбички. Тъканните клетки са силно чувствителни към соли на тежки метали. Следователно качеството на различните съставки, които съставляват физиологичните разтвори и хранителните среди, както и методите за обработка на съдовете и гумените запушалки, използвани в клетъчните култури, трябва да бъдат изключително важни.

Една от предпоставките за успешна работа с клетките е високото качество на дестилираната вода (проверява се два пъти седмично). За работа с клетки се използва бидестилирана или дейонизирана вода. Най-добрите дестилатори са устройства, изработени от стъкло или легирана стомана: йони на тежки метали, които са токсични за клетките, не се измиват от такова оборудване. Дейонизираната вода се получава в специални инсталации, където водата се пречиства от соли при последователното й преминаване през колони с анионен и катионен обменник.

При култивирането на клетките се поставят особено високи изисквания към подготовката и стерилизацията на съдове и запушалки. В много случаи неправилното им измиване и стерилизация е причината клетките да не се прикрепят към стъклото или бързата дегенерация на клетъчния монослой.

За растежа и възпроизводството на клетките извън тялото е необходим сложен набор от физико-химични фактори: определена температура, концентрация на водородни йони, неорганични съединения, въглехидрати, аминокиселини, протеини, витамини, кислород и въглероден диоксид, следователно , за култивиране на вируси в клетъчни култури се използват сложни хранителни среди. Според характера на компонентите, влизащи в състава им, тези среди се разделят на две групи.

• 1. Среди, които са смеси от физиологични разтвори (Ханкс, Ърл и др.) И естествени компоненти (животински и човешки кръвен серум, албуминов хидролизат). Количеството на всеки от тези компоненти в различните състави на средата е различно.
• 2. Синтетични и полусинтетични среди, състоящи се от физиологични разтвори (Earl, Hanks и др.) с добавяне на аминокиселини, витамини, коензими и нуклеотиди (Eagle media, 199 и др.). В синтетични среди клетките могат да съществуват в жизнеспособно състояние за кратко време (до 7 дни). За поддържането им в жизнеспособно състояние за по-дълго време, както и за създаване на по-добри условия за растеж и възпроизводство на клетките, към синтетичните среди се добавя животински кръвен серум (крави, телета и др.).

За изолиране на вируси могат да се използват различни методи за култивиране на клетки извън тялото. Понастоящем обаче еднослойните култури от първично трипсинизирани и трансплантирани клетъчни линии са получили най-голямо практическо приложение. Еднослойните клетъчни култури се отглеждат в стъклени плоскостенни съдове-матраци с вместимост 1 l, 250 и 100 ml или в конвенционални бактериологични епруветки, обработени по подходящ начин.

Когато се използват първично трипсинизирани клетъчни култури, същността на метода се състои в разрушаването на междуклетъчните връзки в тъканите чрез протеолитични ензими и отделянето на клетките за отглеждане на монослой върху стъклената повърхност. Като източник за получаване на клетки могат да служат тъкани и органи на човешки и животински ембриони, заклани животни и птици, както и тези, извлечени от хора по време на операция. Използвайте нормални и злокачествени дегенерирани тъкани, епителни, фибробластен тип и смесени. Способността за възпроизвеждане на клетки, извлечени от тялото, е тясно свързана със степента на тъканна диференциация. Колкото по-малко диференцирана е тъканта, толкова по-интензивна е способността на нейните клетки да пролиферират in vitro. Следователно, клетки от ембрионални и туморни тъкани се култивират много по-лесно извън тялото, отколкото нормалните клетки на възрастни животни.

Ежедневните култури се разглеждат под микроскоп с ниско увеличение, за да се определи естеството на техния растеж. Ако клетките не се размножават, изглеждат кръгли, зърнести, тъмни и се отлепват от стъклото, стъкленият съд е лошо обработен или съставките в хранителната среда са токсични.

Наред с първичните трипсинизирани тъкани, трансплантираните клетъчни култури се използват широко за култивиране на вируси; клетъчни култури, способни да се възпроизвеждат извън тялото неограничено време. Най-често се използват клетъчни култури, получени от нормални и ракови човешки тъкани. Клетъчната линия HeLa, получена от цервикален тумор, Hep-2 от карцином на ларинкса, KV от рак на устната кухина стана широко известна. Такива клетъчни култури се приготвят и от нормални животински тъкани - бъбреци на маймуна, заек и ембрион на прасе (Таблица 10.1).

За повторно засяване на трансплантирани клетки хранителната среда се изсмуква с пипета и се излива. Образуваният тънък слой клетки се разрушава с разтвор на трипсин, а така освободените клетки се прехвърлят в нов съд със свеж хранителен разтвор, където отново се образува монослой от клетки.

Индикатор за наличието на вируса в заразени клетъчни култури може да бъде:

• а) развитие на специфична клетъчна дегенерация;
• б) откриване на вътреклетъчни включвания;
• в) откриване на специфичен антиген чрез имунофлуоресценция;
• г) положителна хемадсорбционна реакция;
• д) положителна реакция на хемаглутинация;
• д) образуване на плаки.

Таблица 10.1

Списък на най-често използваните клетъчни култури

За да се открие специфична дегенерация в заразени култури, клетките се изследват ежедневно под микроскоп с ниско увеличение. Много вируси, когато се размножават в клетките, причиняват тяхното израждане, т.е. имат цитопатогенен ефект (CPA) (фиг. 10.6).

Ориз. 10.6.

Времето на развитие и естеството на цитопатичните промени в заразените клетъчни култури се определят от свойствата и дозата на инокулирания вирус, както и от свойствата и условията на култивиране на клетките. Някои вируси причиняват CPP в рамките на първата седмица след заразяването (шарка, полиомиелит, Coxsackie B и др.), Други - след 1-2 седмици. след инфекция (аденовируси, параинфлуенца вируси, ECHO и др.).

Вирусите причиняват цитопатични промени от три основни типа: образуване на многоядрени гигантски клетки и симпласти, които са резултат от сливането на цитоплазмата на много клетки; кръгла клетъчна дегенерация в резултат на загуба на междуклетъчни връзки и закръгляване на клетките; развитие на огнища на клетъчна пролиферация, състоящи се от няколко слоя клетки.

По време на възпроизвеждането на някои вируси в клетъчни култури се образуват вътреклетъчни включвания в цитоплазмата или ядрото на засегнатите клетки. Клетъчните култури за откриване на включвания се отглеждат върху стъклени плочи в епруветки, заразени с вирус, и след определени инкубационни периоди се приготвят препарати чрез оцветяването им с конвенционални багрила.

За откриване на специфичен антиген в заразени клетъчни култури препаратите се приготвят по същия начин, както за откриване на включвания с помощта на MFA.

Методът на плаката се основава на образуването в монослой от заразени с вирус клетки под агарово покритие на обезцветени области, състоящи се от дегенерирали (мъртви) клетки. Тези области, наречени плаки, са вирусни колонии, обикновено образувани от една вирусна частица.

При липса на цитопатични промени, вътреклетъчни включвания, образуване на плаки, отрицателни реакции на хемадсорбция и хемаглутинация в клетъчни култури, заразени с тестовия материал, се извършват два последователни пасажа. При липса на тези промени в крайния пасаж, резултатът от изолирането на вируса се счита за отрицателен.

Следните методи могат да се използват за откриване на вируси в инфекциозен материал.

Микроскопски:

• а) вирусоскопия;
• б) откриване на вътреклетъчни включвания.

Имунологични:

• а) имунна електронна микроскопия;
• б) имунофлуоресценция;
• в) хемаглутинация;
• г) хемадсорбция.

Идентифицирането на вируси се извършва с помощта на имунологични методи, включително следните реакции:

• а) инхибиране на хемаглутинацията;
• б) забавяне на хемадсорбцията;
• в) свързване на комплемента;
• г) неутрализиране;
• д) утаяване в агар гел.

микроскопски методи. Със светлинен микроскоп могат да бъдат открити само големи вируси, по-големи от 150 nm. Разпознаването на по-малки вируси е възможно само с електронен микроскоп. За откриване на големи вируси може да се използва светлина, фазов контраст и флуоресцентна микроскопия.

По време на вирусни инфекции в заразените клетки се развиват специфични включвания. Някои инфекции са придружени от образуване на включвания в цитоплазмата на засегнатите клетки (бяс, ваксина срещу едра шарка), други - в цитоплазмата и ядрото (морбили, естествена и варицела, аденовирусни заболявания). Включванията имат различна природа, структура, форма и размер от 0,25 до 25 микрона. Според съвременните данни при някои инфекции включванията са мястото на възпроизвеждане на вируса и представляват неговите натрупвания, заобиколени от клетъчни вещества, докато при други те са продукт на клетъчна дегенерация.

Включвания могат да бъдат открити в оцветени отпечатъци от органи и тъкани, клетъчни изстъргвания, хистологични срезове от засегнатата тъкан и препарати от инфектирана с вирус клетъчна култура. Оцветяването често се извършва по метода на Романовски-Гимза. За оцветяване по този метод препаратите се фиксират в смес от Dubosque - Brazil - Bouin, състояща се от пикринова киселина, формалин, алкохол, оцетна киселина. Вътреклетъчните включвания при повечето вирусни инфекции са оксифилни и оцветяват в розово или лилаво според метода на Романовски-Гимза.

Имунологични методи за диагностика на вирусни инфекции. През последните години тези методи са водещи в лабораторната диагностика на вирусни инфекции. Това до голяма степен се дължи на икономически причини, тъй като класическите методи за вирусологичен анализ са доста скъпи. В допълнение, продължителността на изследванията с вирусологични методи (седмици), дори и да са доста ефективни, ги прави ретроспективни.

Имунологичните методи се използват както за откриване на вирусни антигени в различни биосубстрати и обекти на околната среда, така и за серодиагностика - откриване на антитела срещу вирусни антигени в кръвните серуми на болни хора и лабораторни животни. В допълнение, имунологичните методи на изследване са незаменими за идентифициране на вириони.

Взаимодействайки с тялото, вирусите предизвикват образуването на антитела, които, адсорбирани върху вириони, предотвратяват проникването на вириони в клетките и развитието на цитопатично действие (CPE); неутрализират смъртоносния ефект на вирусите по време на тяхното размножаване в пилешки ембриони и животни; инактивират вирионните хемаглутинини и невраминидаза, предотвратявайки реакцията на хемаглутинация (RHA) и реакцията на хемадсорбция (RGAds) върху засегнатите от вируса клетки. Тези вирус-неутрализиращи антитела също причиняват аглутинация и утаяване на вирусни частици и получените имунни комплекси свързват комплемента. Следователно, за идентифициране на вириони се използва класическата реакция на неутрализация (PH) върху клетъчни култури, пилешки ембриони и животни и нейните модификации: реакцията на инхибиране на хемаглутинацията (HITA); реакция на инхибиране на хемадсорбцията (RTGads). Същите реакции се използват при серодиагностиката на вирусни инфекции за откриване на вирус-неутрализиращи антитела в серума на пациенти според известен вирусен антиген (diagnosticum).

Метод на имуноелектронна микроскопия (IEM). Електронната микроскопия понастоящем играе важна роля в изследването на вирусите. Това са данните от електронната микроскопия, които служат като основа за съвременната класификация на вирусите.

Нов етап в развитието на електронномикроскопското изследване на вируси е използването на техники за имуноелектронна микроскопия. С помощта на този метод стана възможно не само директното откриване на вируси, но и тяхната идентификация, както и бързото серотипиране на вирусни щамове и титруване на антитела към тях. IEM придоби голямо значение за определяне на локализацията на вирусни антигени в клетките на макроорганизма.

Безспорното предимство на IEM е неговата висока чувствителност в сравнение с конвенционалните методи на електронна микроскопия.

Когато вирусен антиген или вирусен компонент влезе в контакт с хомоложен антисерум, се образува комплекс антитяло-антиген. Това явление е в основата на техниката, използвана за откриване и идентифициране на вирусни антигени или антитела към тях. Именно тези комплекси от антигени с антитела след отрицателно оцветяване могат да се наблюдават в електронен микроскоп. В клиничната диагностика антигенният материал не изисква цялостно пречистване. Така че, ако се открие грипен вирус, може да се изследва непречистената алантоична течност. Понастоящем се смята, че почти всеки вид клиничен материал е подходящ за IEM. За диагностични цели могат да се използват обикновени нефракционирани серуми, както и серуми на реконвалесценти. Трябва да се отбележи, че голямо влияние върху крайните резултати оказва съотношението на количествата антиген и антитела. При излишък на антиген се наблюдава изобилие от частици; агломератите в този случай ще бъдат малко. При излишък от антитела, вирусните частици са заобиколени от техния дебел слой, почти невъзможно е да се разкрият малките структурни детайли на вириона; агрегатите също са малко. При оптимално съотношение на антиген и антитела, агрегатите се уголемяват с добро изображение на детайлите на вирионите. От горните съображения е желателно да се използва имунен серум в няколко разреждания.

Поддържащо фолио, изработено от паладий, се нанася върху носещата решетка. При използване на ниски концентрации на паладий и за подобряване на адсорбционните свойства на субстрата, той се подсилва с въглерод. За да направите това, въглищата се напръскват върху готовия сух филм-субстрат върху електронномикроскопична решетка във вакуум. Дебелината на филма-субстрат и подсилващия въглероден слой има значително влияние върху контраста и образа на фините детайли на обекта. Всеки изследовател определя специфичната дебелина на субстратните филми и въглеродния слой индивидуално въз основа на факта, че въглеродът е по-електронно прозрачен от паладия.

Вирусите и антителата към тях имат ниска електронна плътност. Следователно биологичните обекти не могат да бъдат открити с помощта на електронен микроскоп без предварителна обработка. Вирусите се визуализират с помощта на техника с отрицателен контраст (или отрицателно оцветяване). За отрицателно оцветяване на вируси и комплекси вирус-антитяло се използват различни соли на тежки метали. Контрастните вещества (атоми на тежки метали) проникват в хидрофилните зони на предметите и заместват водата в тях. В резултат на това електронната плътност на обекта се увеличава и става възможно да се наблюдава в електронен микроскоп.

Най-голямо приложение в практиката е намерил директният IEM метод. Вирусната суспензия се смесва с неразреден антисерум. След енергично разбъркване, сместа се инкубира в продължение на 1 час при

37°C, след това една нощ при 4°C. На следващия ден сместа се центрофугира за утаяване на имунните комплекси. Утайката се ресуспендира в капка дестилирана вода и се подлага на отрицателен контраст.

При оценка на резултатите от IEM продуктите на взаимодействие между антиген и антитяло в електронен микроскоп могат да имат различен външен вид (индивидуална вирусна частица, изцяло или частично покрита с антитела; агломерати от вирусни частици). Агломератите могат да заемат различна площ, да имат различен външен вид и да съдържат различен брой частици. Следователно, наред с експерименталните, е необходимо да се изследват контролни препарати (с буферен разтвор или хетероложен антисерум).

Критерият за оценка на резултатите, получени с помощта на IEM, е наличието или отсъствието на клъстери от вирусни частици, агрегирани от имунен серум в препаратите. Наличието на антигенни агломерати и специфични антисерумни антитела е знак за положителна реакция. Въпреки това трябва да се вземе предвид възможността за неспецифична агрегация на антигенни частици под въздействието на високоскоростно центрофугиране. Поради тази причина много автори препоръчват разглеждане на резултатите по условна скала от 0 до 4+. Базира се на оценка на степента на покритие на агрегираните частици със серумни антитела.

Методи за хемаглутинация и хемадсорбция. Много вируси имат способността да аглутинират еритроцитите на строго определени видове бозайници и птици. Така вирусите на грипа и паротита аглутинират еритроцитите на пилета, морски свинчета и хора; вирус на кърлежов енцефалит - овчи еритроцити; Вируси на японския енцефалит - еритроцити на еднодневни пилета и гъски; аденовируси - еритроцити на плъхове, мишки, маймуни. Алантоисна и околоплодна течност, суспензия от хорион-алантоисна мембрана на пилешки ембриони, суспензии и екстракти от култури от клетки или органи на животни, заразени с вируси, се използват като тестов материал в реакцията на хемаглутинация (HA). Реакцията на хемаглутинация може да се настрои чрез капков метод върху стъкло и в разширен ред в епруветки или ямки от полистиренови плочи. Първият метод е показателен.

Тъй като е групово специфичен, RGA не дава възможност да се определи вида на вирусите. Те се идентифицират с помощта на теста за инхибиране на хемаглутинацията (HITA). За формулирането му се използват известни имунни антивирусни серуми. Към всяко разреждане се добавя равно количество течност, съдържаща вирус. Контролът е суспендиране на вируса.

Сместа се държи в термостат, след което се добавя суспензия от еритроцити. Няколко минути по-късно се определя титърът на неутрализиращия серум, т.е. максималното му разреждане, което предизвика забавяне на аглутинацията на еритроцитите.

При серологична диагностика на вирусни заболявания се препоръчва RTGA да се извършва със сдвоени серуми, единият от които се получава в началото на заболяването, а другият след 1-2 седмици или повече. Четирикратното увеличение на титъра на антителата във втория серум потвърждава предложената диагноза.

Реакцията на хемадсорбция (RGads) се използва за указване на вирус с хемаглутинираща активност в инфектирани клетъчни култури. Същността на реакцията се състои в това, че еритроцитите, чувствителни към хемаглутиниращото действие на вирусите, се адсорбират върху повърхността на клетките, заразени с вируси. Например, пилешки еритроцити се адсорбират върху клетки, заразени с вируса на вариола; вирус на морбили - еритроцити на маймуни; аденовируси - маймуни и плъхове и др.

Реакция на неутрализация (PH). Възпроизвеждайки се в клетъчни култури, вирусите причиняват различни видове CPD, което се изразява в закръгляване, набръчкване, намаляване или, обратно, увеличаване на размера на клетките, сливането им и образуването на симпласти, разрушаване на цитоплазмата и ядрото. И накрая, в монослой от клетки, заразени с вируси, в резултат на тяхното разрушаване на определени участъци от клетъчния слой могат да се появят „стерилни петна“ или плаки, които са клонинг на вирусната частица, което позволява не само изолиране на вируса, но и за определяне на неговия титър.

Много е трудно да се идентифицира вирусът по естеството на плаките и затова те прибягват до определяне на PH на изолирания вирус с известни вируснеутрализиращи серуми. За тази цел вирусът, получен от пациента, се натрупва в клетъчна култура и различните му разреждания се смесват с неразреден антивирусен серум.

Смес от вируси и серуми може да зарази пилешки ембриони или чувствителни животни. В такива случаи неутрализиращата активност на антителата най-често се определя от неутрализирането на вирусните хемаглутинини в течностите на ембриона и елиминирането на леталния ефект на вируса върху ембриони и животни. В същото време се изчислява индексът на неутрализация, който изразява максималния брой смъртоносни дози от вируса, които се неутрализират от този серум, в сравнение с резултатите от контролния експеримент, взети за единица.

По същия начин, използвайки PH, вирусите, изолирани от материала на пациентите, се идентифицират, когато заразяват пилешки ембриони и животни. За да направите това, съдържащи вируси течности от ембриони и суспензии от засегнатите органи на животни се добавят към вирус-неутрализиращите серуми. След определено време на инкубация клетъчните култури, пилешките ембриони и животните се заразяват със смеси.

При серодиагностиката на вирусни инфекции се определя динамиката на повишаване на титъра на вирус-неутрализиращи антитела за известен вирус. В същото време PH се определя със сдвоени серуми, взети от пациенти в началото и в края на заболяването. 4-кратно увеличение на титъра на имуноглобулините във втория от тях ще бъде диагностично.

PH се основава на способността на специфични антитела да се свързват достатъчно силно с вирусна частица. В резултат на взаимодействието между вируса и антитялото, инфекциозната активност на вируса се неутрализира поради блокирането на антигенни детерминанти, отговорни за връзката на вирусната частица с чувствителните клетки. В резултат на това вирусът губи способността си да се размножава в чувствителна биологична система in vitro или in vivo.

Резултатите от PH стават очевидни, след като смес от вируса и неговите хомоложни антитела, след определена експозиция, се въвежда в чувствителна биологична система (тъканна клетъчна култура, пилешки ембрион, податливо животинско тяло), където вирусът може да се размножава и да причинява измерими промени, които ще бъдат потиснати частично или напълно в присъствието на антитела.

Има три компонента, включени в PH:

• 1) вирус;
• 2) серум, съдържащ антитела;
• 3) биологичен обект (лабораторни животни, развиващи се пилешки ембриони, тъканни култури), чийто избор зависи от вида на вируса, с който се предполага, че се провеждат изследвания.

PH се използва или за идентифициране на изолиран патоген, или за откриване и титриране на антитела в серума. В първия случай се използват серуми от специално имунизирани лабораторни животни или възстановени хора. Във втория случай се използват серуми, взети в началния стадий на заболяването и по време на периода на възстановяване.

Вирус-неутрализиращите антитела в серума на възстановени хора, за разлика от антихемаглутинините или комплемент-фиксиращите антитела, се запазват в продължение на много години, а при някои вирусни инфекции (например морбили) дори за цял живот. Това дава възможност в някои случаи да се използва пулът от серуми на много реконвалесценти като референтно лекарство, което след пълнене в ампули и лиофилизация е подходящо за диагностична работа за дълго време.

При идентифициране на изолирани патогени се използват предварително приготвени хиперимунни серуми от различни животни: зайци, бели плъхове и мишки, морски свинчета, маймуни, овце, коне и др. Активността на хиперимунните серуми за PH зависи от метода на имунизация на животните.

Преди провеждане на всеки експеримент за неутрализация, вирусът се титрира предварително, като се определя крайното разреждане, което причинява увреждане на тъканната култура или инфекция на лабораторни животни (или пилешки ембриони). Вирусният титър се изразява като 50% доза (TCID50 - 50% инфекциозна доза за тъканна култура).

Молекулярно-генетични диагностични методи във вирусологичната практика. Методите на молекулярната биология са разработени през 50-те години. ХХ век. Те станаха възможни благодарение на факта, че в генома на всеки вирус има уникални специфични за вида нуклеотидни последователности, чрез откриването на които може да се идентифицира всеки инфекциозен агент. Тези методи са най-важни за идентифициране на микроорганизми, които са дългосрочни или трудни за култивиране чрез конвенционални методи. През 70-те години на миналия век се използва откриване на ДНК сонда за откриване на инфекциозен агент или мутация на базата на хибридизация на специфични олигонуклеотидни проби, белязани с радиоактивен изотоп (или флуорохром) с изолирана ДНК проба. Хибридизационният анализ използва способността на нуклеиновите киселини, при определени условия, да образуват специфични комплекси с нуклеинови киселини, които имат последователности, комплементарни на тях. Методът за откриване на инфекциозни патогени чрез ДНК хибридизация се оказа изключително трудоемък, времеемък и скъп. В допълнение, неговата чувствителност е недостатъчна за идентифициране на микроорганизми в клинични материали като изпражнения и урина.

ДНК хибридизацията е заменена от метод, който имитира естествената репликация на ДНК и ви позволява да откриете и многократно копирате определен ДНК фрагмент с помощта на термофилна ДНК полимераза. Полимеразна верижна реакция (PCR) е елегантна техника, която имитира естествената репликация на ДНК и позволява специфична част от ДНК да бъде открита и многократно копирана с помощта на термофилна ДНК полимераза.

Поради високите си диагностични качества, PCR е общопризнато допълнение към традиционните методи, използвани във вирусологията: размножаване на вирус в клетъчна култура, имунологично откриване на вирусни антигени и електронна микроскопия. Съществено предимство на този метод е възможността за откриване на вируси при латентни инфекции (цитомегаловирус, херпесен вирус) и вируси, които са трудни или все още невъзможни за култивиране (вирус на човешката имунна недостатъчност, вирус на Epstein-Barr, човешки папиломен вирус, вирус на хепатит Vidr). Перспективите за изучаване на заболявания като болестта на Кройцфелд-Якоб, болестта на Алцхаймер и множествената склероза са свързани с PCR метода.

Етиологичната диагностика на вирусните заболявания се извършва чрез вирусологични, вирусологични, серологични и молекулярно-генетични методи. Последните три метода могат да се използват като експресни диагностични методи.

Вирусологичен диагностичен метод.

Крайната цел на метода е да идентифицира вирусите до вид или серологичен вариант.Вирусологичният метод включва няколко етапа:

1) избор на материал за изследване;

2) обработка на вируссъдържащ материал;

3) замърсяване на чувствителни живи системи с материал;

4) индикация на вируси в живи системи;

5) титруване на изолирани вируси;

6) идентифициране на вируси в имунни реакции.

1. Избор на материал за изследване .

Извършва се в ранните стадии на заболяването, при спазване на правилата, които предотвратяват замърсяването на материала с чужда микрофлора и инфекцията на медицинския персонал. За да се предотврати инактивирането на вируса по време на транспортирането, материалът се поставя във вирусна транспортна среда (VTS), състояща се от балансиран солев разтвор, антибиотици и серумен албумин. Материалът се транспортира в специален контейнер с термоизолация и затворени найлонови торби, съдържащи лед. При необходимост материалът се съхранява при -20˚C. Всяка проба от материал за изследване трябва да бъде етикетирана и етикетирана с името на пациента, вида на материала, датата на вземане на пробата, подробна клинична диагноза и друга информация.

В зависимост от естеството на заболяването материалът за изследването може да бъде:

1) тампони от носната част на фаринкса и тампон от фаринкса;

2) цереброспинална течност;

3) изпражнения и ректални тампони;

6) течност от серозни кухини;

7) намазка от конюнктивата;

8) съдържание на везикули;

8) секционен материал.

За да се получи промиване от орофаринкса, се използват 15-20 ml VTS. Пациентът внимателно изплаква VTS гърлото за 1 минута и събира промиването в стерилен флакон.

Намазка от задната част на фаринкса се взема със стерилен памучен тампон, като се натиска върху корена на езика с шпатула. Тампонът се поставя в 2-3 ml VTS, изплаква се и се изстисква.

Цереброспиналната течност се получава чрез лумбална пункция. 1-2 ml цереброспинална течност се поставя в стерилен контейнер и се доставя в лабораторията.

Фекалните проби се вземат в рамките на 2-3 дни в стерилни флакони. От получения материал се приготвя 10% суспензия с разтвор на Hank. Суспензията се центрофугира при 3000 rpm, супернатантата се събира, към нея се добавят антибиотици и се поставят в стерилен контейнер.

Получената чрез венепункция кръв в обем 5-10 ml се дефибринира чрез добавяне на хепарин. Цялата кръв не се замразява и не се добавят антибиотици. За да се получи серум, кръвните проби се инкубират при 37°C в продължение на 60 минути.

Течност от серозните кухини се получава чрез пункция в количество от 1-2 ml. Течността се използва веднага или се съхранява замразена.

Натривка от конюнктивата се взема със стерилен тампон и се поставя във ВТС, след което материалът се центрофугира и замразява.

Съдържанието на везикулите се аспирира със спринцовка с тънка игла и се поставя във VTS. Материалът се изпраща в лабораторията под формата на изсушени петна върху предметни стъкла или в запечатани стерилни капиляри или ампули.

Секционният материал се взема възможно най-рано, като се спазват правилата на асептиката. За вземане на всяка проба се използват отделни комплекти стерилни инструменти. Количеството на избраните тъкани е 1-3 g, които се поставят в стерилни флакони. Първо се вземат проби от екстракавитарни органи (мозък, лимфни възли и др.). Тъканите от гръдната кухина се вземат преди отваряне на коремната кухина. Получените тъканни проби се смилат в хаван с добавяне на стерилен пясък и стерилен разтвор на натриев хлорид, след което материалът се центрофугира. Супернатантата се събира във флакони, добавят се антибиотици. Материалът за вирусологично изследване се използва веднага или се съхранява при -20°C.

2. Обработка на вируссъдържащ материал.

Провежда се с цел освобождаване на материала от съпътстващата бактериална микрофлора. За това се използват физични и химични методи.

Физически методи:

1) филтриране през различни бактериални филтри;

2) центрофугиране.

Химични методи:

1) третиране на материала с етер в случаи на изолиране на вируси, които нямат суперкапсид;

2) добавяне на смес от хептан и фреон към материала;

3) въвеждането на антибиотици (пеницилин - 200-300 U / ml; стрептомицин - 200-500 μg / ml; нистатин - 100-1000 U / ml).

3. Заразяване на чувствителни живи системи с материал.

1) лабораторни животни;

2) пилешки ембриони;

3) органни култури;

4) тъканна култура.

лабораторни животни. Използват се бели мишки, морски свинчета, хамстери, зайци и др.Белите мишки са най-чувствителни към голям брой видове вируси. Начинът на заразяване на животните се определя от тропизма на вируса към тъканите. Инфекцията в мозъка се използва при изолирането на невротропни вируси (вируси на бяс, полиовируси и др.). Интраназалната инфекция се извършва при изолиране на патогени на респираторни инфекции. Широко използвани интрамускулни, интравенозни, интраперитонеални, подкожни и други методи на инфекция. Болните животни се евтаназират с етер, отварят се и се взема материал от органи и тъкани.

пилешки ембриони. Широко достъпен и лесен за използване. Нанесете пилешки ембриони на възраст от 5 до 14 дни. Преди заразяване пилешките ембриони се овоскопират: определя се тяхната жизнеспособност, границата на въздушния сак и местоположението на ембриона („тъмното око“ на ембриона) се маркират върху черупката. Работата с пилешки ембриони се извършва в стерилна кутия със стерилни инструменти (пинсети, спринцовки, ножици, копия и др.). След завършване на фрагмент от работата, инструментите се потапят в 70% етилов алкохол и се изгарят преди следващата манипулация. Преди заразяване черупката на пилешкия ембрион се избърсва с тампон, напоен със спирт и алкохолен разтвор на йод. Обемът на тестовия материал, инжектиран в ембриона, е 0,1-0,2 ml. Най-малко 4 пилешки ембриона се използват за изолиране на вируси от един материал.