Proučavanje biomaterijala IF metodom. ELISA pretraga krvi - opis metode, prednosti i nedostaci, tumačenje rezultata. Indikacije za analizu

Trenutno se koristi veliki broj različitih vrsta i modifikacija ELISA. Različite varijante enzimskog imunoanalize (ELISA) postale su široko rasprostranjene.

Čvrsta faza ELISA predložena je 1971. Osnovni principi čvrste faze ELISA, bez obzira na modifikaciju, su sljedeći:

• 1. U 1. fazi reakcije, antigeni ili antitijela se adsorbiraju na krutu fazu. U tom slučaju, reagensi koji nisu vezani na čvrstu fazu lako se uklanjaju pranjem.
• 2. Testni uzorak se inkubira u senzibiliziranim jažicama. Jažice pozitivne kontrole sadrže standardne reagense. U tom slučaju na površini krute faze nastaju imunološki kompleksi. Nevezane komponente uklanjaju se pranjem.
• 3. Kada se doda antitijelo-enzim ili konjugat antigen-enzim i veže na imobilizirani imunološki kompleks, aktivno mjesto enzima ostaje dostupno za naknadnu interakciju sa supstratom. Inkubacija supstrata u jažicama s imobiliziranim konjugatom dovodi do razvoja obojene reakcije. Ova reakcija se može zaustaviti u željenoj fazi, ozbiljnost bojenja može se procijeniti vizualno ili optičkom gustoćom. Važan korak u bilo kojoj varijanti analize čvrste faze je postupak ispiranja nevezanih reagensa. Važno je ne samo isprati komponente fiksirane na čvrstoj fazi, već ukloniti reagense iz cijele dubine sloja. Uzorci se mogu ispirati automatski s perilicom ili ručno s višekanalnom pipetom. Za provođenje ELISA testa potrebno vam je:
  • · upotrijebljene polistirenske tablete ili druge krute faze;
  • otopina za pranje;
  • konjugat (enzimom obilježeni antigeni ili antitijela);
  • mješavina korištenih supstrata;
  • stop otopina (Stop reagens - otopina za zaustavljanje reakcije);
  • Uzorci korišteni za pozitivnu i/ili negativnu kontrolu;
  • standardni antigen (za izgradnju kalibracijske krivulje);
  • jednokanalne i višekanalne pipete;
  • · perilica;
  • optički uređaj za određivanje optičke gustoće ispitivane otopine (ELISA čitač, čitač koji sekvencijalno fotometrira sve jažice);
  • · 5-100 µl proučavanog biološkog materijala.

Izravna ELISA

1. Antigeni ili antitijela (testni materijal) su adsorbirani u jažicama ploča. Često u izravnoj ELISA, antigen imobiliziran na čvrstoj fazi su stanice i drugi antigeni u obliku čestica.

Kontrolirati. Kao kontrola koriste se jažice s adsorbiranim uzorkom pozitivne kontrole, koji nužno sadrži željeni antigen, i uzorkom negativne kontrole, koji očito ne sadrži ispitivani antigen. U prisutnosti pročišćenog standardnog antigena, reakcija se provodi u nekoliko razrjeđenja kako bi se mogla konstruirati kalibracijska krivulja.

• 2. “Blokirajte slobodna vezna mjesta koja su ostala na čvrstoj fazi s kazeinom BSA, itd. (kako bi se spriječila nespecifična sorpcija konjugata na čvrstoj fazi).
• 3. Protutijela ili antigeni (konjugati) obilježeni enzimima dodaju se u jažice i inkubiraju. Do vezanja konjugata na čvrstu fazu doći će samo ako su obje komponente sustava komplementarne. Nakon inkubacije s konjugatom, jažice se isperu, čime se ukloni nevezani dio konjugata.

• 4. Supstrat specifičan za korišteni enzim se zatim dodaje u jažice i inkubira. Kada se postigne optimalna razina bojenja u jažicama pozitivne kontrole, enzimska reakcija se zaustavlja.
• 5. Obračunavanje reakcije. Prvo se rezultati reakcije uzimaju u obzir vizualno. Za točniji prikaz rezultata, intenzitet bojenja se procjenjuje na ELISA čitaču s odgovarajućim svjetlosnim filtrom. Na temelju rezultata analize gradi se grafikon ovisnosti optičke gustoće o koncentraciji. ELISA apsorpcijska imobilizacija antitijela
• a) otkriti antigen; b) za otkrivanje antitijela.

Indirektna ELISA.

Ova se varijanta ELISA-e obično koristi za otkrivanje specifičnih protutijela. Standardni antigen adsorbira se u jažice panela i inkubira s uzorcima seruma ili drugog biološkog materijala dobivenog od bolesnika (cerebrospinalna tekućina, slina, itd.). Specifična protutijela vezana za antigen na čvrstoj fazi otkrivaju se pomoću antiglobulinskog konjugata. Ovisno o namjeni analize, koriste se različiti antiglobulinski reagensi koji detektiraju antitijela svih izotipova ili specifičnih za pojedine klase i podklase imunoglobulina. Glavna prednost metode je univerzalnost konjugata. Isti se konjugat može koristiti za otkrivanje ljudskih protutijela na široku lepezu antigena u bilo kojem uzorku. Reakcija je metodički jednostavna.

Glavne faze neizravne ELISA testa za otkrivanje protutijela:

• 1. Antigen se adsorbira na krutu fazu, zatim se ispere s nevezanih komponenti.
• 2. Blokirajte mjesta za besplatno vezivanje. Oprano.

• 3. Ispitivani materijal se dodaje u jažice, inkubira i potom ispere. Paralelno se postavljaju uzorci s pozitivnim i negativnim kontrolama.
• 4. Dodajte antiglobulinski konjugat u radnu otopinu, inkubirajte, isperite nevezane komponente.
• 5. Supstrat se unosi, inkubira. Nakon postizanja optimalne razine bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija se zaustavlja dodavanjem otopine za zaustavljanje.
• 6. Izmjerite količinu produkta reakcije na ELISA čitaču.

Pod optimalnim uvjetima ispitivanja, metoda je vrlo specifična i osjetljiva. Omogućuje otkrivanje nanogramskih količina protutijela u serumima ispitivanih pacijenata. Za dobivanje zadovoljavajućih rezultata potrebna je standardizacija reagensa i metodologija. Ova varijanta ELISA također se može koristiti za testiranje monoklonskih antitijela.

"Sendvič" - varijanta ELISA za otkrivanje antigena.

Antigeni otkriveni ovom ELISA varijantom moraju imati višestruke epitope koji se vežu na antitijela ili imati ponavljajuće, prostorno odvojene epitope iste specifičnosti.

Prilikom provođenja ove varijante ELISA-e, visoko specifična poli- ili monoklonska protutijela adsorbirana na čvrstoj fazi se inkubiraju s testnim uzorkom. Nakon postupka ispiranja, u jažice se dodaju enzimom obilježena antitijela (konjugat) na isti antigen, a zatim se provode svi ostali stupnjevi reakcije. Učinkovitost stvaranja specifičnog kompleksa u svakoj fazi analize ovisi o konstanti vezanja reakcije antigen-antitijelo.

Glavne faze analize:

• 1. Monoklonska protutijela ili afinitetno pročišćena poliklonska protutijela imobiliziraju se na čvrstoj fazi.
• 2. Uzorak za ispitivanje unosi se u jažice ploča, uzorak pozitivne kontrole i uzorak negativne kontrole stavljaju se paralelno u različitim razrjeđenjima. Inkubirana i isprana.
• 3. Enzimom obilježena monoklonska ili poliklonska protutijela (konjugat) se dodaju u jažice. Ispiranje se provodi nakon inkubacije.
• 4. Supstrat se unosi, inkubira. Reakcija se zaustavlja kada se postigne optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.
• 5. Obračun rezultata na ELISA čitaču.

Glavna prednost metode je njezina visoka osjetljivost, koja premašuje mogućnosti drugih ELISA shema.

Kompetitivni ELISA.

Ova se opcija analize temelji na natjecanju obilježenih (konjugat) i neobilježenih (test) protutijela za vezanje na antigen adsorbiran na čvrstoj fazi. Količina enzima vezanog za čvrstu fazu smanjit će se proporcionalno sadržaju slobodnih protutijela u smjesi. Za određivanje antigena koristi se ista opcija, ali u ovom slučaju željeni antigen se natječe s označenim, standardnim antigenom za vezanje na antitijela imobilizirana na površini krute faze.

Natjecateljska metoda zahtijeva minimalan broj operacija, malu potrošnju reagensa i može se lako automatizirati. Kod provođenja kompetitivnog ELISA testa za detekciju antitijela, bolje je koristiti obilježena monoklinska antitijela, tada dolazi do konkurencije konjugata s testnim uzorkom za jedan epitop antigena adsorbiranog na čvrstoj fazi. Ova varijanta ELISA testa koristi se za određivanje raznih spojeva, kao što su humani imunoglobulini, kancero-embrionalni antigen, inzulin itd. Omogućuje detekciju antitijela na dijagnostički značajne epitope uzročnika infekcije.

Glavne faze analize za otkrivanje antigena:

• 1. Monoklonska protutijela specifična za antigen koji se detektira imobiliziraju se na čvrstoj fazi.
• 2. Dodajte antigen obilježen enzimom i testni uzorak u poznatoj koncentraciji u jažice ploča. Provedite inkubaciju i ispiranje. Paralelno se pozitivne i negativne kontrole stavljaju u susjedne jažice. Za izradu kalibracije pomoću standardnog neobilježenog antigena u različitim razrjeđenjima.
• 3. Dodajte supstrat, inkubirajte, zaustavite reakciju kada se razvije optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.
• 4. Računanje reakcije na ELISA čitaču.

U tom je slučaju količina antigena u ispitivanom uzorku obrnuto proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

inhibitorni ELISA.

U ovoj varijanti ELISA-e, antigen prisutan u ispitivanom uzorku veže se na enzimom obilježena monoklonska protutijela i inhibira njihovu interakciju sa standardnim antigenom imobiliziranim na čvrstoj fazi. Prisutnost čak i tragova antigena specifičnog za konjugat u uzorku će inhibirati vezanje obilježenih protutijela na imobilizirani antigen. Stupanj inhibicije izravno je proporcionalan sadržaju antigena u otopini. Za kvantitativnu analizu gradi se kalibracijska krivulja korištenjem serijskih razrjeđenja standardnog antigena. Glavne faze inhibitorne ELISA testa za detekciju antigena (slika 6).

• 1. Adsorbirajte standardni antigen u jažice ploča. Odaberite radno razrjeđenje obilježenih protutijela titracijom.
• 2. Konjugat se prethodno inkubira u radnom razrjeđenju s razrjeđenjima ispitnog uzorka, standardnog antigena i pozitivnih kontrolnih uzoraka.
• 3. Smjesa se prenese u jažice ploča. Da bi se kontroliralo 100% vezanje, samo obilježena antitijela se dodaju u nekoliko jažica, bez inhibitornog antigena. Ploče se inkubiraju i zatim isperu.
• 4. Dodajte supstrat.
• 5. Zabilježite rezultate.

Koncentracija antigena koju treba odrediti u ispitivanom uzorku obrnuto je proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

ELISA se može koristiti ne samo za određivanje topljivog antigena ili protutijela, već i stanica koje proizvode različite proteine.

Metoda enzimskog imunobojenja (ELISPOT).

Godine 1983. ELISA tehnologija prilagođena je za detekciju limfoidnih stanica koje izlučuju antitijela ili antigene (npr. citokine) in vitro. Metoda se zove ELISPOT (enzymatic immunoassay ili spot metoda). Glavni princip metode:

• 1. Na površini polistirenske jažice (koristeći ploče stanične kulture s 24 jažice), adsorbirani su antigeni ili antitijela koja služe kao reagensi za "hvatanje".
• 2. Dodane su proučavane limfoidne stanice, uzgajane nekoliko sati na 37°C, dajući im priliku da zauzmu određeno mjesto i obavljaju sekretornu funkciju. Protutijela ili antigeni koje luče takve stanice hvataju se reagensima adsorbiranim na čvrstoj fazi.
• 3. Stanice se uklanjaju pomoću otopine za pranje s deterdžentom za lizu stanica.
• 4. Mjesta nakupljanja sekretornih produkata prikazuju se dodavanjem protutijela povezanih s enzimom (antiglobulinski reagens).
• 5. Dodaje se smjesa supstrata i agaroze (upotrijebljeni supstrati trebaju se otopiti u agarozi i stvarati netopljive produkte reakcije), na površini krute faze stvaraju se smeđe ili plave mrlje (ovisno o korištenim enzimima i supstratima), otkrivajući područja gdje su stanice nalazili su se.
• * Dobivene mrlje se broje pod mikroskopom, to će biti broj stanica koje luče.

Nitrocelulozna membrana može se koristiti kao čvrsta faza. U ovom slučaju postoji niz prednosti: zbog visokog adsorpcijskog kapaciteta NCM-a, potrebna je značajno manja količina antigena koji se koristi kao "hvatajući" reagens, osim toga, nema potrebe za uključivanjem agaroze u supstrat.

Istodobnim određivanjem broja stanica koje luče i ukupne količine izlučenog antigena ili protutijela u jažici, što je moguće pri uporabi drugog supstrata, moguće je odrediti količinu izlučene tvari po pojedinoj stanici.

Ova metoda je našla široku primjenu za procjenu broja stanica koje izlučuju antigen zarobljen adsorbiranim protutijelima, koristi se za određivanje broja stanica koje izlučuju citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a).

Sustavi za pojačanje signala.

Kada se koriste antitijela visokog afiniteta, osjetljivost pojedinačnih varijanti ELISA testa je vrlo visoka i teoretski omogućuje otkrivanje pojedinačnih molekula antigena, ali u praksi je osjetljivost ograničena nizom čimbenika: aktivnošću enzima, intenzitetom signala i metodama obračuna signala . Sustavi pojačanja signala omogućuju povećanje osjetljivosti različitih varijanti ELISA testa. Razmotrite neke od ovih sustava:

Na temelju interakcije avidin-biotin.

Molekule koenzima biotina (m.m. 244 Da) konjugirane su s antitijelima pomoću biotinil-N-hidroksisukcimida. Malu molekulu biotina lakše je vezati za imunoglobulin ili drugi protein bez narušavanja njegovih imunoloških ili enzimskih svojstava. Enzim je u ovom slučaju vezan za glikoprotein avidin bjelanjka. Afinitet vezanja avidina na biotin je vrlo visok (konstanta disocijacije kompleksa je 10-15 mol), konjugat avidin-enzim je čvrsto fiksiran na kompleks antigen-antitijelo-biotin. Nakon dodavanja odgovarajućeg supstrata produkt reakcije određuje se spektrofotometrijski ili intenzitetom luminiscencije.

Jedna molekula avidina sastoji se od četiri identične podjedinice, sposobna je komunicirati s četiri molekule biotina, što joj omogućuje da se koristi kao povezujuća molekula između dva spoja koji sadrže biotin. U ovom slučaju, enzim je također biotiniliran, a avidin djeluje kao most, povezujući dvije molekule koje sadrže ostatke biotina. Dobivenom kompleksu antigen-antitijelo-biotin dodaje se slobodni avidin, nakon čega slijedi biotinilirani enzim. Snimite reakciju.

Protein avidin može se nespecifično sorbirati na drugim molekulama, stoga se sve više koristi drugi protein koji veže biotin, streptavidin, koji se nalazi u bakteriji Streptomyces avidinii. Streptavidin također tvori jak kompleks s biotinom i sastoji se od četiri identične podjedinice.

Korištenje kompleksa avidin-biotin omogućuje značajno povećanje osjetljivosti ELISA-e, budući da se deseci molekula biotina mogu vezati na jednu molekulu AT tijekom sinteze konjugata. Dobivanje konjugata (protutijela i enzima s biotinom) prilično je jednostavno i popraćeno minimalnim promjenama u njihovoj imunološkoj i enzimskoj aktivnosti. Konjugati enzima s biotinom mogu se koristiti kao univerzalni reagensi.

Primjena kemiluminiscentnih reakcija.

Kemiluminiscentne reakcije mogu se koristiti za dobivanje signala u ELISA testu, uz povećanje osjetljivosti metode i smanjenje vremena analize. Peroksidaza hrena naširoko se koristi kao oznaka u ELISA testu, a za njezino otkrivanje mogu se koristiti i razne kemiluminiscentne reakcije. Kemiluminiscentne reakcije temelje se na sposobnosti luminola da svijetli kada se oksidira vodikovim peroksidom. U izravnoj analizi, enzimatska reakcija proizvodi vodikov peroksid i oksidira luminol; ovu reakciju katalizira peroksidaza hrena. Za pojačavanje signala koriste se različiti spojevi, na primjer, luciferin, fenoli, u ovom slučaju intenzitet luminiscencije se povećava 10-100 puta, u nekim slučajevima 500 puta (pojačana kemiluminiscentna analiza). Luminescentni signal je vrlo stabilan, njegova razina doseže maksimum za 30 s (za usporedbu: reakcija boje s OPD-om kao indikatorom u potpunosti se razvija tek za 30 min).

U neizravnoj analizi s luminolom ili njegovim derivatima, antitijelo se obilježava. Takva oznaka u slobodnom stanju može se oksidirati vodikovim peroksidom uz oslobađanje svjetlosti. Ako je stvorio kompleks, gubi sposobnost oksidacije.

Na temelju kaskadnih sustava.

Kako bi se povećala osjetljivost ELISA-e, mogu se koristiti enzimski kaskadni sustavi. U ovom slučaju, prvi enzim vezan za antitijelo rezultira reduciranim supstratom za drugi enzimski sustav. Drugi enzimski sustav može biti supstrat-ciklički ili redoksiciklički. U ovom slučaju, fosfo-glukoizomeraza, aldolaza, alkalna fosfataza mogu poslužiti kao enzimske oznake. Konačni produkt reakcije određuje se vizualno ili spektrofotometrijski.

ELISA sustavi pojačanja postižu visoku osjetljivost. Takvi ELISA sustavi koriste se za određivanje razine hormona.

Imunoenzimski test (ELISA) provodi se za sveobuhvatnu procjenu zaštitnih funkcija tijela. Tijekom studije utvrđuje se broj i svojstva imunoloških stanica, prisutnost potrebnih antitijela. ELISA test krvi provodi se za dijagnosticiranje zaraznih, hematoloških, autoimunih bolesti, primarnih i sekundarnih imunodeficijencija. Razmotrite što je krvni test pomoću ELISA i koje indikacije postoje za ovu studiju.

Što je

ELISA test krvi je laboratorijska metoda koja otkriva antitijela ili antigene u uzorku krvi. Ova studija se koristi za otkrivanje razine imunoglobulina, imunoloških kompleksa, hormona.

Indikacije za analizu

Za imenovanje ELISA testa krvi postoje sljedeće indikacije:

• dijagnoza spolno prenosivih infekcija - ureaplazma, mikoplazma, klamidija, trihomonas, sifilis;
• dijagnoza virusnih bolesti - citomegalovirus, herpes, hepatitis, Epstein-Barr virus;
• određivanje razine hormona;
• dijagnoza onkoloških bolesti;
• određivanje imunodeficijencije;
• dijagnosticiranje alergija;
• preoperativni sveobuhvatni pregled prije transplantacije organa;
• procjena učinkovitosti terapije.

Princip metode

Princip rada metode enzimskog imunoeseja temelji se na određivanju specifičnih proteina-antitijela u krvi - imunoglobulina. Imunoglobuline proizvodi ljudski imunološki sustav kada antigeni (strani mikroorganizmi) uđu u tijelo. Te se imunološke molekule vežu za razne infektivne agense u tijelu i neutraliziraju ih.

Imunoglobulini imaju važnu karakteristiku – specifičnost. Zbog toga se mogu vezati za određeni antigen, tvoreći kompleks antigen-antitijelo. Tijekom ELISA testa krvi, ovaj kompleks se određuje kvalitativno i kvantitativno.

Postoji pet klasa imunoglobulina. Ali obično se definiraju tri klase - imunoglobulini A, M, G. Ta se antitijela nakupljaju u tijelu u različitim vremenima od trenutka infekcije.

• Imunoglobulini klasa M (IgM) prvi se pojavljuju u krvi petog dana od trenutka infekcije. U tijelu su 5-6 tjedana, a zatim nestaju iz krvotoka. IgM protutijela ukazuju na akutno razdoblje bolesti ili pogoršanje bolesti u kroničnom tijeku.
• Otprilike 3-4 tjedna nakon infekcije, imunoglobulini se pojavljuju u krvi klasa G (IgG). Oni mogu postojati u ljudskoj krvi nekoliko mjeseci ili čak godina. Prema dekodiranju ELISA testa krvi, ako je u dva uzorka krvi uzeta dva tjedna kasnije povećana količina IgG imunoglobulina, govore o trenutnoj infekciji ili reinfekciji - ponovnoj infekciji istom infekcijom.
• Imunoglobulini klasa A (IgA) mogu se otkriti ovom metodom istraživanja 2-4 tjedna nakon infekcije ili pogoršanja zarazne bolesti. Od toga samo 20% cirkulira u krvi, ostatak izlučuju sluznice. IgA protutijela nestaju iz krvotoka 2-8 tjedana nakon uništenja uzročnika infekcije. Nestanak ovih imunoglobulina znači izlječenje infekcije. Ako se nakon završetka bolesti utvrdi prisutnost IgA protutijela u krvi, tada je bolest prešla u kronični stadij.

Priprema za analizu

Za provođenje ELISA testa krvi najčešće se koristi ljudska krv. Ali također možete ispitati sadržaj staklastog tijela, cerebrospinalne tekućine, amnionske tekućine.

Uzorak krvi za istraživanje uzima se od pacijenta iz kubitalne vene. Preporuča se darivanje krvi na prazan želudac (treba proći najmanje 12 sati od trenutka posljednjeg obroka). Potrebno je obavijestiti liječnika ako pacijent uzima lijekove, jer neki od njih mogu promijeniti rezultat analize. Na pouzdanost rezultata studije utječe uporaba alkohola i droga.

Dešifriranje

Obrazac rezultata ove analize pokazuje pozitivan (+) ili negativan (-) rezultat za svaku klasu imunoglobulina.

Razmotrite tumačenje mogućeg dekodiranja ELISA testa krvi.

• Negativan rezultat IgM, IgG, IgA - nedostatak imuniteta na infekciju.
• Negativan IgM, IgA i pozitivan IgG rezultat - postinfekcijski ili postcijepni imunitet.
• Negativni ili pozitivni IgG, IgA i pozitivni IgM je akutna infekcija.
• Pozitivan rezultat IgM, IgG, IgA je egzacerbacija kronične zarazne bolesti.
• Negativan IgM rezultat i negativan ili pozitivan IgG, IgA rezultat je kronična infekcija.
• Negativan IgM nalaz i nema IgG, IgA - oporavak.

Prednosti metode

ELISA test krvi ima mnoge prednosti. Mogu se razlikovati glavni:

• relativno visoka točnost (osjetljivost);
• mogućnost rane dijagnoze;
• sposobnost praćenja dinamike zaraznog procesa;
• visoka razina unifikacije, koja omogućuje masovna istraživanja;
• kratko vrijeme potrebno za dobivanje rezultata analize;
• praktičnost u radu;
• automatizacija svih faza analize;
• relativno niske cijene.

Mane

Nedostatak ELISA metode je što ponekad daje lažno negativne ili lažno pozitivne rezultate. Uz tehničke pogreške tijekom studije, uzrok lažnih rezultata može biti reumatoidni faktor kod pacijenta, prisutnost kroničnih bolesti (kod kojih se proizvode antitijela), metabolički poremećaji i uzimanje određenih lijekova.

• ascariasis;
• trihineloza - analiza se provodi nekoliko puta, maksimalna razina antitijela se određuje 4-12 tjedana nakon infekcije;
• cisticerkoza;
• tenijaza;
• fascioliasis - protutijela se određuju u akutnoj fazi bolesti;
• opisthorchiasis - provesti diferencijalnu dijagnozu između kroničnih i akutnih oblika bolesti;
• giardijaza;
• visceralna i kožna lišmanijaza;
• amebijaza;
• toksoplazmoza.

4.2 4,20 od 5 (5 glasova)

Popis standardnih dijagnostičkih mjera koje se koriste za zarazne bolesti uključuje enzimski imunološki test. Ako je ELISA test za sifilis pozitivan, nemojte odmah paničariti.

Razmotrimo detaljnije značajke ove tehnike istraživanja i načela dešifriranja rezultata dobivenih u različitim kategorijama pacijenata.

Imunoenzimski test jedna je od najčešćih metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti. Spada u kategoriju treponemskih testova, odnosno može se koristiti za određivanje prisutnosti uzročnika sifilisa - blijede treponeme u tijelu pacijenta.

Pomoću ELISA, sifilis se otkriva zbog otkrivanja antitijela na treponemu. Sadrže se u krvi pacijenta, a njihova vrsta i količina ovise o stadiju i obliku bolesti, što vam omogućuje dobivanje važnih informacija o trenutnom stanju ljudskog zdravlja.

Prednosti i nedostatci

ELISA se vrlo često propisuje za sumnju na sifilis ili druge zarazne bolesti. To je zbog činjenice da vam analiza omogućuje prepoznavanje točne vrste i stadija bolesti, a njegova pouzdanost ostaje na visokoj razini - vjerojatnost pogreške na temelju rezultata više studija je samo 1%, primarni ELISA ima točnost od oko 90%.

Korištenje visokokvalitetnih reagensa i suvremene opreme omogućuje nam maksimiziranje točnosti indikatora.

Općenito, prednosti metode su:

1. Visoka točnost rezultata. Vjerojatnost primanja lažnih podataka vrlo je mala.
2. Minimiziranje ljudskog faktora utjecaja. Moderna oprema za provođenje ELISA-e isključuje ljudski utjecaj na rezultate studije zbog automatizacije procesa.
3. Detekcija specifičnih antitijela. Nemoguće je zbuniti antigene jedne vrste s drugima, tako da analiza pokazuje točan rezultat za određenu dijagnozu.
4. Popravljanje i najmanjih odstupanja od norme. Čak i najmanja koncentracija patoloških uzročnika neće proći nezapaženo.

Ne zaboravite na slabosti ove metode. ELISA ima sljedeće nedostatke:

1. Visoka cijena. Visoka cijena je posljedica mnogih čimbenika, posebno potrebe za dobrom opremom, visokokvalitetnim reagensima i stručnjacima s dovoljnom razinom obuke.
2. Potreba za preliminarnom dijagnozom. Morate znati koje antigene tražiti, jer bez dodatnih podataka neće biti moguće postaviti točnu dijagnozu.
3. Vjerojatnost lažno pozitivnog rezultata. Neka tjelesna stanja i drugi čimbenici mogu iskriviti konačne podatke.

Indikacije za provođenje

Liječnik može propisati enzimski imunološki test za dijagnosticiranje ne samo sifilisa, već i niza drugih zaraznih bolesti.

Ako uzmemo u obzir situaciju izravno s infekcijom treponema, razlog za pregled može biti:

• pojava vanjskih simptoma bolesti (šankrovi, sifilični osip, guma, itd.);
• značajno smanjenje imuniteta;
• identifikacija ili sumnja na sifilis kod seksualnog partnera, rodbine i članova obitelji;
• pozitivna reakcija tijekom drugih testova;
• identifikacija drugih bolesti koje mogu biti povezane sa sifilisom;
• osobna želja osobe da bude ispitana.

Metode izvođenja

ELISA se može provesti na različite načine. U svakom slučaju odabire se najprikladnija opcija.

Prije svega, postoji podjela metoda na:

1. Kvalitativno. Otkriva se prisutnost infekcije ili virusa u tijelu pacijenta.
2. Kvantitativno. Određuje koncentraciju protutijela na patogen u ljudskom tijelu, što ukazuje na stupanj i intenzitet razvoja bolesti.

Postoji i klasifikacija metoda za provođenje ELISA-e prema principu reprodukcije potrebne reakcije.

Postoje 3 opcije:

1. Ravno. Označena antitijela ubrizgavaju se u dostavljene uzorke krvi.
2. Indirektan s antigenima. Adsorbirani antigeni se prethodno stavljaju u ćelije polistirenske ploče namijenjene za ELISA. Zatim im se dodaju antitijela virusa, što izaziva stvaranje imunoloških kompleksa potrebnih za daljnju procjenu rezultata.
3. Indirektan s antitijelima. Za spolno prenosive bolesti ova metoda se često koristi. Uključuje preliminarnu sorpciju antitijela, tek tada se antigeni dodaju na ploču.

Pravila uzorkovanja materijala

Kako bi se smanjio rizik od dobivanja lažnih rezultata, potrebno je ispravno donirati krv za analizu.

Prije podvrgavanja ELISA testu potrebno je pridržavati se nekih ograničenja:

• izbjegavati intenzivan fizički i emocionalni stres;
• prestanite pušiti i piti alkohol najmanje 1 do 3 dana unaprijed;
• nekoliko dana morate prijeći na pravilnu prehranu;
• poželjno je da žene kontroliraju fazu menstrualnog ciklusa, jer hormoni mogu iskriviti rezultate;
• posljednji obrok trebao bi biti 8-10 sati prije davanja krvi;
• tijekom 10 dana isključeni su lijekovi koji mogu utjecati na rezultate studije.

Za ELISA, venska krv se uzima iz kubitalne vene, mora se uzeti ujutro na prazan želudac. Općenito, vrijede standardna pravila za pripremu za vađenje venske krvi. Ovisno o prisutnosti bolesti koja se ispituje, mogu se uvesti dodatni zahtjevi za preliminarnu pripremu pacijenta.

Metodologija

Upute za provođenje ELISA testa su vrlo jednostavne:

1. Pacijent uzima krv iz vene.
2. Uzeti materijal se priprema i dijeli na uzorke na posebnoj paleti s finom mrežicom.
3. Antigeni se miješaju s antitijelima prema odabranoj metodi.
4. Reakcija se procjenjuje. Uzorci se uspoređuju s kontrolnim uzorcima, provodi se kvalitativna i kvantitativna procjena rezultata.
5. Podaci se unose u posebnu tablicu uz primjenu kvantitativnih pokazatelja (ukupna antitijela).
6. Nadležni liječnik dešifrira rezultate. Ako je potrebno, propisano je odgovarajuće liječenje.

Nakon pregleda pacijentu se daje dokument s nalazima. Ima oblik tablice s odgovarajućim oznakama nasuprot svake vrste imunoglobulina na raskrižju s nazivima zaraznih bolesti.

Dešifriranje

Samo stručnjak će moći ispravno dešifrirati rezultate analize. Teško je samostalno dokučiti npr. što znači rezultat ELISA testa k = 1 4. Sifilis se također može pojaviti u različitim oblicima, što također utječe na konačne podatke.

Rezultati ukazuju na 3 vrste imunoglobulina:

1. IgM. Omogućuje određivanje razdoblja infekcije sifilisom. Pozitivan rezultat ukazuje na pogoršanje bolesti. Njihova odsutnost može ukazivati ​​na remisiju kroničnih patologija ili latentni oblik bolesti.
2. IgA. Označava bolest koja je stara više od mjesec dana od infekcije. To je također znak akutne faze bolesti, kako s običnim patologijama tako i s naprednim kroničnim.
3. IgG. To je znak vrhunca bolesti, odnosno njenog pogoršanja. Kod sifilisa, pozitivna reakcija pojavljuje se neko vrijeme nakon liječenja. Kod nekih vrsta bolesti to može biti znak razvijenog imuniteta.

Te tvari tijelo proizvodi u određenom slijedu, što je dodatni znak bolesti. Kvalitativnim pretragama utvrđuje se samo prisutnost imunoglobulina u krvi svake vrste.

To se izražava u promjeni boje materijala uključenih u analizu. Kvantitativni pokazatelji su pomoćni, oni točnije opisuju stanje. Odnos antigena i antitijela ukazuje na težinu bolesti i intenzitet odgovora organizma.

Što učiniti

Ako pacijent stvarno ima sifilis, apsolutno se uvijek otkriva pozitivan ELISA, nemoguće je ne primijetiti prisutnost treponema u takvoj studiji. Nemojte očajavati, bolest dobro reagira na liječenje, osobito u početnim fazama.

Što učiniti ako je rezultat testa pozitivan:

• podvrgnuti dodatnim pregledima prema indikacijama liječnika;
• uzeti tijek antibiotske terapije prema odabranoj shemi;
• usmjerenost na jačanje imunološkog sustava;
• obavijestite svog seksualnog partnera o bolesti;
• u budućnosti redovito prolaziti preventivnu dijagnostiku do deregistracije u dispanzeru (nakon 5 godina u nedostatku pozitivnih rezultata testa).

Ne treba odgađati bolovanje i bojati se objave rezultata. Dijagnoza je šifrirana i ostaje tajna, samo ako postoji opasnost od zaraze za druge osobe, potrebno je o problemu obavijestiti rodbinu i spolnog partnera kako bi obavili potrebne pretrage.

Lažno pozitivan rezultat i njegovi uzroci

Ponekad se bilježi rezultat drugih testova i ELISA je lažno pozitivan na sifilis. Zato se preporuča provesti 2-3 pomoćne metode i nakon nekog vremena ponoviti imunoenzimski test.

Takve su netočnosti rijetke, uglavnom su posljedica sljedećih čimbenika:

• trudnoća;
• kronična bolest;
• nedavno cijepljenje;
• ozljeda.

Lažno pozitivni rezultati dijele se na akutne i kronične, ovisno o prirodi čimbenika koji ih je izazvao.

Glavni su prikazani u tablici:

U prisutnosti takvih zdravstvenih problema, test na sifilis može pokazati pozitivan rezultat, ali to je samo posljedica proizvodnje proteina u tijelu za borbu protiv bolesti. Međutim, ELISA ih prepoznaje kao antigene.

Zdravo dijete do jedne i pol godine može doživjeti lažno pozitivne rezultate ELISA ako je žena bila zaražena sifilisom tijekom trudnoće. Prije ove dobi krv još nema vremena da se potpuno obnovi, pa u njoj mogu biti prisutna majčina antitijela. Iznimka je situacija s otkrivanjem IgM imunoglobulina.

Možete saznati više o značajkama enzimskog imunološkog testa i njegovoj metodologiji gledajući video u ovom članku.

ELISA ili enzimski imunološki test je moderan način određivanja mnogih patologija, uključujući i one zarazne prirode. Studija se provodi u laboratoriju. Glavni cilj tehnike je otkrivanje antitijela, njihova prisutnost ukazuje na prodiranje patogenih agenasa u tijelo. Moderna medicina koristi ELISA analizu za dijagnosticiranje mnogih bolesti i prepoznavanje spojeva trećih strana.

ELISA analiza: kada i kako se provodi

Pomoću ELISA metode stručnjaci mogu otkriti prisutnost specifičnih protutijela (imunoglobulina) u krvnom serumu i odrediti antigene. Imunoglobulini nastaju kao rezultat složenih neuralnih procesa koje provode zaštitne funkcije tijela. One su prirodna reakcija imunološkog sustava na prodor stranih agenasa. Za svaku vrstu patogena stvaraju se specifična protutijela.

Važno: prisutnošću određenih kompleksa, metoda enzimske imunološke analize omogućuje vam prepoznavanje vrste patogena u ljudskom tijelu.

Dijagnostika ELISA testom provodi se za otkrivanje sljedećih bolesti:

• herpes;
• hepatitis virusnog tipa;
• Epstein-Barr virus (herpes tip 4);
• citomegalovirus.

Krvni test otkriva glavne patogene bakterije koje izazivaju razvoj sifilisa, ureaplazmoze i trihomonijaze. Analizom stručnjaci utvrđuju antitijela na 600 vrsta alergena. Provođenje enzimskog imunološkog testa prikladno je u pripremi za transplantaciju organa.

Važno: u nekim slučajevima ELISA je dodatna metoda za određivanje onkologije u ljudskom tijelu.

Analiza se provodi isključivo u laboratoriju. Za istraživanje se uzima venska krv iz kubitalne vene. Rezultati analize bit će dostupni sljedeći dan. Kako bi dobili pouzdane informacije, stručnjaci preporučuju pridržavanje pravila za pripremu za ELISA:

• jedan dan prije studije potrebno je napustiti korištenje začinjene i dimljene hrane;
• alkohol je zabranjen;
• krv se daje ujutro na prazan želudac;
• prije studije potrebno je isključiti bilo kakav fizički i emocionalni stres;
• preporučljivo je prestati pušiti.

Koje se patologije otkrivaju enzimskim imunološkim testom

Koristeći enzimski imunotest, stručnjak određuje različite klase imunoglobulina, čija prisutnost ukazuje na razvoj patoloških procesa u tijelu. Dakle, glavni pokazatelji ELISA su IgM i IgG. Prisutnost IgM imunoglobulina ukazuje na razvoj akutnog patološkog procesa. Pokazatelj IgG u krvi tipičan je za fazu oporavka.

Analizom ELISA-e stručnjaci identificiraju niz opasnih bolesti. To uključuje:

Važno: ELISA test je propisan za potvrdu sifilisa kada se dobije pozitivan rezultat davanjem krvi za RV.

Pravovremena dijagnoza omogućuje praćenje učinkovitosti terapije i, ako je potrebno, prilagođavanje.

Dešifriranje analize: pozitivan i negativan odgovor

Tumačenje rezultata ELISA-e provodi stručnjak na temelju dobivenih podataka. Odgovor može biti pozitivan ili negativan.

Pozitivna ELISA

Rezultat se smatra pozitivnim ako su imunoglobulini klase IgG i IgM otkriveni u krvi tijekom studije. Prisutnost predstavljenih komponenti ukazuje na razvoj sljedećih bolesti:

• sifilis;
• hepatitis virusnog tipa;
• CMVI (citomegalovirus);
• herpes;
• vodene kozice;
• bolesti izazvane stafilokokom i streptokokom;
• klamidija.

S razvojem sifilisa, specifična protutijela nalaze se u krvi 14 dana nakon infekcije. Prema njihovom broju, stručnjak određuje ozbiljnost tijeka bolesti. Aktivna terapija sifilisa eliminira sve bakterije nakon 6 mjeseci. Ako nema liječenja, trebat će najmanje 1,5 godina da se tijelo potpuno oporavi.

ELISA analiza otkriva hepatitis virusnog tipa čak iu razdoblju inkubacije, prije nego što se pojave prvi simptomi.

CMVI je uobičajena patologija koja se javlja kod svake treće osobe. Za stanovništvo, to ne predstavlja opasnost, infekcija se javlja u maternici.

Normalno, u ljudskom tijelu nema protutijela na virus herpesa. Kada se otkriju, uobičajeno je dijagnosticirati akutnu fazu bolesti.

S razvojem vodenih kozica, specifični IgM imunoglobulini nalaze se u ljudskoj krvi. Oni su u stanju ostati u tijelu 2 godine, nakon potpunog uklanjanja patologije.

Za određivanje bolesti uzrokovanih streptokokom i stafilokokom, dvostruki test za ELISA omogućuje. Kada se ponovno pregleda, razina specifičnih antitijela brzo raste.

Na razvoj klamidije ukazuje visoka razina imunoglobulina - 1: 8 i više. Indikator može varirati ovisno o progresiji bolesti.

Pažnja: kako bi potvrdio razvoj određenog patološkog procesa, stručnjak propisuje dodatne laboratorijske i instrumentalne studije. Sveobuhvatna studija omogućuje vam propisivanje učinkovitog režima liječenja.

Negativan ELISA

S negativnim rezultatom, specifični imunoglobulini klase IgM nisu otkriveni u ljudskoj krvi. Možda prisutnost IgG, antitijela mogu ostati u tijelu nakon bolesti, bakterijskog i virusnog tipa. U nekim slučajevima njihova prisutnost u krvnom serumu traje desetljećima.

Pažnja: samo iskusni stručnjak može ispravno dešifrirati rezultate analize.

Samostalno proučavanje odgovora u većini slučajeva dovodi do pokušaja dijagnosticiranja i propisivanja netočnog liječenja, bez sudjelovanja liječnika. Takav utjecaj smatra se idealnim za daljnje napredovanje patološkog procesa.