Određivanje indikacija za bakteriološke, virološke, serološke studije u dešifriranju etiologije oki i procjenu rezultata. Virološka istraživanja Koji je smisao istraživanja

Arhiva stranica Internetska arhiva Wayback Machine Vrlo često napad crnih PR-ovaca dolazi neočekivano za vas. U ovom slučaju, po prvi put, suočeni ste s potrebom da pomno proučavate neprijatelja. Ako ste uopće pretpostavili takav razvoj događaja (na primjer, u

4.9. Sigurnosna kopija s Time Machineom

4.9. Izrada sigurnosnih kopija s Time Machineom Mac OS X Leopard vam omogućuje redovito sigurnosno kopiranje vašeg računala pomoću aplikacije Time Machine. Nakon odgovarajućih postavki, aplikacija će automatski

4.9.2. Napravite svoju prvu sigurnosnu kopiju s Time Machineom

4.9.2. Stvaranje vaše prve sigurnosne kopije pomoću Time Machine-a Prije nego počnete stvarati svoju prvu sigurnosnu kopiju, morate ili umetnuti vanjski disk ili imati slobodnu particiju tvrdog diska odvojenu samo za sigurnosno kopiranje.

4.9.4. Korištenje vremeplova

4.9.4. Korištenje Time Machine-a Nakon što napravite potrebne postavke Time Machine-a i napravite brojne sigurnosne kopije, možete početi tražiti i vraćati ranije verzije svojih datoteka. Za ovo: 1. Otvorite prozor Findera i odaberite datoteku koju trebate vratiti.2. Ako a

metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se naširoko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako prodiru u stanicu i značajke reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i bjelančevine. Razvijaju se metode za određivanje slijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koje one kodiraju s nukleotidnim slijedom i utvrditi uzroke unutarstaničnih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s protutijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemoliza, enzimska aktivnost), značajkama interakcije virusa sa stanicom domaćina ( priroda citopatskog učinka, stvaranje intracelularnih inkluzija, itd.).

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao iu pripremi pripravaka cjepiva, široko se koristi metoda kulture tkiva i stanica. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne kulture stanica. Primarne kulture dobivaju se dispergiranjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor stanica mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u tzv. madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se nakon pričvršćivanja na površinu posude stanice počinju razmnožavati. Za virusnu infekciju obično se koristi stanični monosloj. Hranjiva tekućina se ocijedi, virusna suspenzija se unosi u određenim razrjeđenjima, a nakon kontakta sa stanicama dodaje se svježa hranjiva podloga, najčešće bez seruma.

Stanice iz većine primarnih kultura mogu se potkulturirati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolaskom stanica nastaje populacija stanica sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava izvorni set kromosoma. To su takozvane diploidne stanice. U serijskom uzgoju stanica dobivaju se stabilne kontinuirane stanične kulture. Tijekom prolaza pojavljuju se homogene stanice koje se brzo dijele s heteroploidnim skupom kromosoma. Stabilne stanične linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u raznim posudama pomoću mješalica. Postoji više od 400 staničnih linija izvedenih iz 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmazove, vodozemce, ribe, kukce) i ljudi.

Dijelovi pojedinih organa i tkiva (organske kulture) mogu se uzgajati u umjetnim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (primjerice, koronavirusi).

U zaraženim kulturama stanica viruse je moguće otkriti promjenom morfologije stanice, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u stanici i u tekućini kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tekućini kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećim embrijima ili osjetljivim životinjama; detekcijom pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u stanicama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među stanovništvom (primjerice, identificirati serovarijantu virusa influence, divlji ili cjepni soj virusa dječje paralize itd.); u slučajevima kada je potrebno provesti hitne epidemiološke mjere; kada se pojave nove vrste ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoliša. Pri izolaciji virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane s dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobivena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a postupak dobivanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali najčešće se koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa obično se utvrđuje specifičnom degeneracijom stanica (citopatski učinak), stvaranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom koji se detektira pomoću imunofluorescencije, hemadsorpcije, hemaglutinacije (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. . Ovi se znakovi mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, poput virusa influence, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.

Pri radu s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa obično se provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i antigena specifičnih za virus. Metoda plaka može se koristiti za titraciju brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa žarišta su virusom uništenih stanica jednoslojne kulture tkiva pod agarom. Brojanje kolonija omogućuje kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na temelju činjenice da jedna čestica zaraznog virusa tvori jedan plak. Plakovi se identificiraju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralno crvenim; plakovi ne apsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svijetle mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje stvaraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentriranje virusa obično se provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentu koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, kromatografija ionske izmjene, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje uzročnika ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinom slučaju ovisi o prirodi bolesti, razdoblju bolesti i mogućnostima laboratorija. Suvremena dijagnostika virusnih infekcija temelji se na ekspresnim metodama koje omogućuju dobivanje odgovora nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijima nakon bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije, detekcija antitijela klase lgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućuje diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Primjena elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve gdje je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj skupini. Taj se nedostatak uklanja primjenom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se temelji na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućuje njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike provodi se elektronsko mikroskopsko ispitivanje ekstrakata tkiva, izmeta, tekućine iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija naširoko se koristi za proučavanje morfogeneze virusa, a njezine se mogućnosti proširuju korištenjem obilježenih protutijela.

Metoda molekularne hibridizacije, koja se temelji na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućuje detekciju pojedinačnih kopija gena i nema ravne u pogledu osjetljivosti. Reakcija se temelji na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNA ili RNA (sondi) i stvaranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Primjena kolorimetrijskih reakcija obećava. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: točkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dan bolesti) i nestaju nakon nekoliko tjedana, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Protutijela klase IgM otkrivaju se imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom pomoću anti-μ antiseruma (anti-IgM serumi teških lanaca).

Serološke metode u virologiji temelje se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi Imunološke metode istraživanja). : reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, neizravna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove se tehnike stalno usavršavaju. Ove se metode koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se odredio porast protutijela u drugom serumu u usporedbi s prvim (prvi serum uzima se u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 tjedna). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja protutijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela klase lgM ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela klase lgC traju nekoliko godina, a ponekad i cijeli život.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i protutijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina koristi se imunobloting. Metoda kombinira frakcioniranje proteina pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu s naknadnim imunološkim ispitivanjem proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za kemijskom čistoćom antigena i omogućuje identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije enzimskog imunološkog testa posljedica prisutnosti antitijela na stanične antigene, koji su prisutni kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija protutijela u serumima pacijenata na unutarnje i vanjske virusne antigene omogućuje određivanje stadija bolesti, au analizi populacije - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i protutijela na njih. Pri analizi populacija metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode leži u mogućnosti analize antigena sintetiziranih tehnologijom rekombinantne DNA, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

20) Glavna strukturna komponenta viriona (potpune virusne čestice) je nukleokapsida, tj. proteinski omotač (kapsid) koji okružuje virusni genom (DNA ili RNA). Nukleokapsida većine obitelji virusa okružena je lipoproteinskom ovojnicom. Između ovojnice i nukleokapsida kod nekih virusa (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- i retrovirusi) nalazi se neglikozilirani matrični protein, koji virionima daje dodatnu krutost. Virusi većine obitelji imaju ovojnicu koja igra važnu ulogu u infektivnosti. Virioni dobivaju vanjski sloj ovojnice kada nukleokapsida pupanjem prodre kroz staničnu membranu. Proteine ​​ovojnice kodira virus, a lipide posuđuje iz stanične membrane. Glikoproteini obično u obliku dimera i trimera tvore peplomere (izbočine) na površini viriona (orto-, paramiksovirusi, rhabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirusi). Glikozilirani fuzijski proteini povezani su s peplomerima i igraju ključnu ulogu u ulasku virusa u stanicu. Kapside i ovojnice viriona formiraju mnoge kopije jedne ili više vrsta proteinskih podjedinica kao rezultat procesa samosastavljanja. Interakcija u sustavu protein-protein, zbog slabih kemijskih veza, dovodi do ujedinjenja simetričnih kapsida. Razlike kod virusa u obliku i veličini viriona ovise o obliku, veličini i broju strukturnih proteinskih podjedinica i prirodi međudjelovanja među njima. Kapsida se sastoji od mnogih morfološki izraženih podjedinica (kapsomera) sastavljenih od virusnih polipeptida na strogo definiran način, u skladu s relativno jednostavnim geometrijskim principima. Proteinske podjedinice, povezujući se jedna s drugom, tvore kapside dvije vrste simetrije: izometrične i spiralne. Građa nukleokapsida virusa s ovojnicom slična je građi nukleokapsida virusa bez ovojnice. Na površini ovojnice virusa razlikuju se morfološki izražene glikoproteinske strukture - peplomeri. Sastav superkapsidne membrane uključuje lipide (do 20-35%) i ugljikohidrate (do 7-8%), koji su staničnog podrijetla. Sastoji se od dvostrukog sloja staničnih lipida i proteina specifičnih za virus koji se nalaze izvan i unutar lipidnog biosloja. Vanjski sloj superkapsidne ljuske predstavljen je peplomerima (izbočinama) jednog ili više tipova, koji se sastoje od jedne ili više molekula glikoproteina. Nukleokapsida virusa s ovojnicom često se naziva jezgrom, a središnji dio viriona koji sadrži nukleinsku kiselinu naziva se nukleoid. Kapsomeri (peplomeri) sastoje se od strukturnih jedinica građenih od jednog ili više homolognih ili heterolognih polipeptidnih lanaca (proteinskih podjedinica). klasifikacija virusa Izometrične kapside nisu kugle, već pravilni poliedri (ikozaedri). Njihove linearne dimenzije su identične duž osi simetrije. Prema Kasparu i Klugu (1962.), kapsomeri u kapsidama raspoređeni su prema ikosaedarskoj simetriji. Takve kapside sastoje se od identičnih podjedinica koje tvore ikosaedar. Imaju 12 vrhova (kutova), 30 ploha i 20 ploha u obliku jednakokračnih trokuta. U skladu s tim pravilom, kapsid poliovirusa i virusa slinavke i šapa sastoji se od 60 proteinskih strukturnih jedinica, od kojih se svaka sastoji od četiri polipeptidna lanca. Ikosaedar optimalno rješava problem pakiranja ponavljajućih podjedinica u strogu kompaktnu strukturu s minimalnim volumenom. Samo neke konfiguracije strukturnih podjedinica mogu tvoriti površine, vrhove i lica virusnog ikosaedra. Na primjer, strukturne podjedinice adenovirusa tvore heksagonalne kapsomere (heksone) na površinama i licima, te peterokutne kapsomere (peptone) na vrhovima. Kod nekih virusa obje vrste kapsomera formiraju isti polipeptidi, kod drugih različiti polipeptidi. Budući da se strukturne podjedinice različitih virusa međusobno razlikuju, neki virusi izgledaju više heksagonalni, drugi sferičniji. Svi poznati virusi kralježnjaka koji sadrže DNA, s izuzetkom virusa velikih boginja, kao i mnogi virusi koji sadrže RNA (7 obitelji) imaju tip simetrije kubične kapside. Reovirusi, za razliku od drugih virusa kralježnjaka, imaju dvostruku kapsidu (vanjsku i unutarnju), od kojih se svaka sastoji od morfoloških jedinica. Virusi sa spiralnim tipom simetrije imaju oblik cilindrične filamentozne strukture, njihova genomska RNA ima oblik spirale i nalazi se unutar kapside. Svi životinjski virusi spiralne simetrije okruženi su lipoproteinskom ovojnicom. Spiralne nukleokapside karakteriziraju duljina, promjer, korak spirale i broj kapsomera po zavoju spirale. Dakle, u virusu Sendai (paramiksovirus), nukleokapsida je spirala duga oko 1 μm, promjera 20 nm i koraka spirale od 5 nm. Kapsida se sastoji od približno 2400 strukturnih jedinica, od kojih je svaka protein molekulske mase 60 kD. Postoji 11-13 podjedinica po zavoju spirale. U virusima sa spiralnim tipom nukleokapsidne simetrije, savijanje proteinskih molekula u spiralu osigurava maksimalnu interakciju između nukleinske kiseline i proteinskih podjedinica. U ikosaedarskim virusima, nukleinska kiselina je umotana unutar viriona i stupa u interakciju s jednim ili više polipeptida koji se nalaze unutar kapside.

Antireceptori (receptori) Virusni- proteini površinskih viriona, na primjer, hemaglutinin, koji se komplementarno vežu na odgovarajući receptor osjetljive stanice.

21) Imunološke metode u virološkim istraživanjima.

Serološki testovi razlikuju se po sposobnosti otkrivanja pojedinih klasa protutijela. Test aglutinacije, na primjer, dobar je za otkrivanje IgM protutijela, ali je manje osjetljiv za otkrivanje IgG protutijela. Testovi vezanja komplementa i hemolize, koji zahtijevaju komplement, ne otkrivaju antitijela koja se ne vežu na komplement, kao što su IgA antitijela i IgE antitijela. U reakciji neutralizacije virusa sudjeluju samo protutijela usmjerena protiv antigenskih determinanti površine viriona povezanih s patogenošću. Osjetljivost I. m. i. nadmašuje sve druge metode za proučavanje antigena i antitijela, posebno radioimunotest i enzimski imunotest omogućuju hvatanje prisutnosti proteina u količinama mjerenim u nanogramima, pa čak i u pikogramima. Uz pomoć I. m. i. odrediti skupinu i provjeriti sigurnost krvi (hepatitis B i HIV infekcija). Kod transplantacije tkiva i tijela I. m. omogućuju određivanje kompatibilnosti tkiva i testiranje metoda za suzbijanje nekompatibilnosti. U sudskoj medicini Castellanijeva reakcija koristi se za utvrđivanje specifičnosti vrste proteina, a reakcija aglutinacije za određivanje krvne grupe.

Imunološke metode imaju široku primjenu u laboratorijskoj dijagnostici zaraznih bolesti. Etiologija bolesti također se utvrđuje na temelju porasta protutijela na uzročnika u krvnom serumu rekonvalescenta u usporedbi s uzorkom uzetim u prvim danima bolesti. Na temelju I. m. i. proučavati imunitet stanovništva u odnosu na masovne infekcije, poput gripe, te također procijeniti učinkovitost preventivnih cijepljenja.

Ovisno o njihovom mehanizmu i prikazu rezultata I. m. i. mogu se podijeliti na reakcije koje se temelje na fenomenu aglutinacije; reakcije temeljene na fenomenu taloženja; reakcije koje uključuju komplement; reakcija neutralizacije; reakcije pomoću kemijskih i fizikalnih metoda.

Reakcije temeljene na fenomenu aglutinacije. Aglutinacija je lijepljenje stanica ili pojedinih čestica - nositelja antigena uz pomoć imunološkog seruma na ovaj antigen.

Bakterijski test aglutinacije s odgovarajućim antibakterijskim serumom jedan je od najjednostavnijih seroloških testova. Različitim razrjeđenjima ispitivanog krvnog seruma dodaje se suspenzija bakterija i nakon određenog kontaktnog vremena na t°37° bilježi se pri kojem najvećem razrjeđenju krvnog seruma dolazi do aglutinacije. Reakcija aglutinacije bakterija koristi se za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti: bruceloze, tularemije, trbušnog i paratifusnog tifusa, bacilarne dizenterije i tifusa.

Reakcija pasivne ili neizravne hemaglutinacije (RPGA, RNGA). Koristi eritrocite ili neutralne sintetske materijale (primjerice, čestice lateksa), na čijoj su površini adsorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni.

Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera i dr.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpelji). encefalitis, krimska hemoragijska groznica itd.), kao i za određivanje određenih hormona, za prepoznavanje preosjetljivosti bolesnika na lijekove i hormone, kao što su penicilin i inzulin.

Test inhibicije hemaglutinacije (HITA) temelji se na fenomenu prevencije (inhibicije) imunološkog seruma hemaglutinacije eritrocita virusima, a koristi se za dokazivanje i titraciju antivirusnih protutijela. Služi kao glavna metoda serodijagnostike gripe, ospica, rubeole, zaušnjaka, krpeljnog encefalitisa i drugih virusnih infekcija, čiji uzročnici imaju hemaglutinirajuća svojstva. na primjer, za serodijagnozu encefalitisa koji prenose krpelji, dvostruka razrjeđenja bolesnikova seruma u otopini alkalnog boratnog pufera ulijevaju se u jažice ploče. Zatim se dodaje određena količina, obično 8 AU (aglutinirajućih jedinica), antigena krpeljnog encefalitisa, a nakon 18 sati izlaganja na t ° 4 °, uvodi se suspenzija guščjih eritrocita pripremljena u otopini kiselog fosfatnog pufera. Ako u krvnom serumu bolesnika postoje protutijela na virus krpeljnog encefalitisa, tada se antigen neutralizira i ne dolazi do aglutinacije eritrocita.

Reakcije temeljene na fenomenu taloženja. Taloženje nastaje kao rezultat interakcije protutijela s topivim antigenima. Najjednostavniji primjer reakcije taloženja je stvaranje neprozirne precipitacijske trake u epruveti na granici slojeva antigena na antitijelu. Široko se koriste različite vrste reakcija taloženja u polutekućem agaru ili agaroznom gelu (Ouchterlonova dvostruka imunodifuzijska metoda, radijalna imunodifuzijska metoda, imunoelektroforeza), koje su i kvalitativne i kvantitativne. Kao rezultat slobodne difuzije u gelu antigena i antitijela u zoni njihovog optimalnog omjera, nastaju specifični kompleksi - precipitacijske trake, koje se otkrivaju vizualno ili bojenjem. Značajka metode je da svaki par antigen-antitijelo formira individualnu precipitacijsku traku, a reakcija ne ovisi o prisutnosti drugih antigena i antitijela u sustavu koji se proučava.

Reakcije koje uključuju komplement, koji se koristi kao svježi serum zamorca, temelje se na sposobnosti podkomponente komplementa Clq, a zatim i drugih komponenata komplementa da se vežu za imunološke komplekse.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) omogućuje titraciju antigena ili protutijela prema stupnju fiksacije komplementa kompleksom antigen-antitijelo. Ova reakcija sastoji se od dvije faze: interakcije antigena s ispitivanim krvnim serumom (testni sustav) i interakcije hemolitičkog seruma s eritrocitima ovna (indikatorski sustav). S pozitivnom reakcijom dolazi do fiksacije komplementa u sustavu koji se proučava, a zatim, kada se dodaju eritrociti osjetljivi na antitijela, hemoliza se ne opaža. Reakcija se koristi za serodijagnostiku sifilisa (Wassermannova reakcija), virusnih i bakterijskih infekcija.

Reakcija neutralizacije temelji se na sposobnosti protutijela da neutraliziraju određene specifične funkcije makromolekularnih ili topivih antigena, kao što su aktivnost enzima, bakterijski toksini i patogenost virusa. Reakcija neutralizacije toksina može se procijeniti biološkim učinkom, npr. titriraju se antitetanusni i antibotulinum serumi. Mješavina toksina i antiseruma primijenjena na životinje ne uzrokuje njihovu smrt. U virologiji se koriste različite varijante reakcije neutralizacije. Kada se virusi pomiješaju s odgovarajućim antiserumom i ta smjesa se primijeni na životinje ili stanične kulture, patogenost virusa se neutralizira i životinje se ne razboljevaju, a stanice kultura se ne uništavaju.

Reakcije pomoću kemijskih i fizikalnih oznaka. Imunofluorescencija se sastoji u upotrebi antitijela obilježenih fluorokromom, točnije imunoglobulinske frakcije IgG antitijela. Antitijelo obilježeno fluorokromom tvori kompleks antigen-antitijelo s antigenom, koji postaje dostupan za promatranje pod mikroskopom u UV zrakama koje pobuđuju luminiscenciju fluorokroma. Reakcija izravne imunofluorescencije koristi se za proučavanje staničnih antigena, otkrivanje virusa u zaraženim stanicama i otkrivanje bakterija i rikecija u razmazima.

Šire se koristi metoda neizravne imunofluorescencije. temelji se na detekciji kompleksa antigen-antitijelo pomoću luminiscentnih seruma anti-lgG antitijela i koristi se za detekciju ne samo antigena, već i za titraciju antitijela.

Imunoenzimske ili enzimske imunološke metode temelje se na upotrebi protutijela konjugiranih s enzimima, uglavnom peroksidazom hrena ili alkalnom fosfatazom. Poput imunofluorescencije, enzimski imunotest se koristi za otkrivanje antigena u stanicama ili za titraciju antitijela na stanicama koje sadrže antigen.

Radioimunološka metoda temelji se na korištenju radioizotopne oznake antigena ili protutijela. To je najosjetljivija metoda za određivanje antigena i antitijela, koristi se za određivanje hormona, lijekova i antibiotika, za dijagnostiku bakterijskih, virusnih, rikecijskih, protozoalnih bolesti, proučavanje proteina krvi, tkivnih antigena.

Imunobloting se koristi za otkrivanje protutijela na pojedinačne antigene ili "prepoznavanje" antigena iz poznatih seruma. Metoda se sastoji od 3 faze: razdvajanje bioloških makromolekula (na primjer virusa) u pojedinačne proteine ​​pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu; prijenos odvojenih proteina iz gela na čvrstu podlogu (blot) nanošenjem ploče poliakrilamidnog gela na aktivirani papir ili nitrocelulozu (elektroblot); detekcija željenih proteina na supstratu izravnim ili neizravnim enzimskim imunotestom. Kao dijagnostička metoda, imunobloting se koristi za HIV infekciju. Dijagnostička vrijednost je otkrivanje protutijela na jedan od proteina vanjske ljuske virusa.

22) Tipovi simetrije virusa (kubični, spiralni, mješoviti). Interakcija proteina i nukleinskih kiselina u pakiranju virusnih genoma.

Ovisno o interakciji kapside s nukleinskom kiselinom, čestice virusa mogu se podijeliti u nekoliko tipova simetrije:

1). Tip kubične simetrije.

Kubične kapside su ikosideri s otprilike 20 trokutastih ploha i 12 vrhova. Oni tvore strukturu nalik sfernoj formaciji, ali zapravo je to poliedar. U nekim slučajevima, posebne lipoproteinske formacije koje se nazivaju šiljci pričvršćene su na vrhove takvih ikosaedarskih poliedara. Uloga ovih šiljaka vjerojatno se svodi na interakciju viriona ili virusnih čestica s odgovarajućim područjima stanica domaćina koja su na njih osjetljiva. S kubičnom simetrijom, virusna nukleinska kiselina je zbijeno upakirana (umotana u kuglu), a proteinske molekule je okružuju, tvoreći poliedar (ikosaedar). Ikosaedar je poliedar s dvadeset trokutastih stranica koji ima kubičnu simetriju i približno sferni oblik. Ikozaedarski virusi uključuju herpes simplex virus, reoviruse itd.

2). Tip spiralne simetrije. Spiralne kapside su nešto jednostavnije. Oni. Kapsomeri koji čine kapsidu prekrivaju spiralni NK i također tvore prilično stabilnu proteinsku ovojnicu ovih virusa. A kada se koriste elektronski mikroskopi visoke rezolucije i odgovarajuće metode pripreme, mogu se vidjeti spiralne strukture na virusima. Uz spiralnu simetriju kapside, virusna nukleinska kiselina tvori spiralnu (ili spiralnu) figuru, šuplju iznutra, a proteinske podjedinice (kapsomere) također su naslagane oko nje u spiralu (tubularna kapsida). Primjer virusa sa spiralnom simetrijom kapside je virus duhanskog mozaika, koji je štapićastog oblika, duljine mu je 300 nm s promjerom od 15 nm. Sastav virusne čestice uključuje jednu molekulu RNK veličine oko 6000 nukleotida. Kapsida se sastoji od 2000 identičnih proteinskih podjedinica raspoređenih u spiralu.

3). Mješoviti ili složeni tip simetrije. U pravilu, ova vrsta simetrije nalazi se uglavnom među bakterijskim virusima. A klasični primjeri su ti fagi, E. coli ili umjereni fagi. To su složene formacije koje imaju glavu s unutarnjim nukleinskim sadržajem, razne vrste dodataka, repni proces i uređaj različitih stupnjeva složenosti. I svaka komponenta takvih čestica obdarena je specifičnom funkcijom koja se ostvaruje u procesu interakcije između virusa i stanice. Drugim riječima, složena vrsta simetrije je kombinacija kubične simetrije, glava je ikosider poliedra, a štapićaste formacije su repni izrastci. Iako među bakterijskim virusima postoje i prilično jednostavno organizirani virioni, koji su primitivni nukleokapsidi, sferičnog ili kubičnog oblika. Bakterijski virusi su složeniji od biljnih i životinjskih virusa.

24) Interakcija faga sa stanicom. Virulentni i umjereni fagi.

Adsorpcija.

Interakcija počinje pričvršćivanjem virusnih čestica na površinu stanice. Proces postaje moguć u prisutnosti odgovarajućih receptora na površini stanice i antireceptora na površini virusne čestice.

Virusi koriste stanične receptore dizajnirane za prijenos bitnih tvari: hranjivih čestica, hormona, faktora rasta itd.

Receptori: proteini, ugljikohidratna komponenta proteina i lipida, lipidi. Specifični receptori određuju daljnju sudbinu virusne čestice (transport, isporuka u područja citoplazme ili jezgre). Virus se može vezati za nespecifične receptore i čak prodrijeti u stanicu. Međutim, ovaj proces ne uzrokuje infekciju.

U početku se stvara jednostruka veza između antireceptora i receptora. Ova veza je krhka i može puknuti. Za nastanak ireverzibilne adsorpcije potrebno je viševalentno pričvršćivanje. Do stabilnog vezanja dolazi zbog slobodnog kretanja receptorskih molekula u membrani. Tijekom interakcije virusa sa stanicom uočava se povećanje fluidnosti lipida i stvaranje receptorskih polja u području interakcije između virusa i stanice. Receptori brojnih virusa mogu biti prisutni samo u ograničenom skupu stanica domaćina. To određuje osjetljivost organizma na ovaj virus. Dakle, virusna DNA i RNA imaju sposobnost zaraziti širi raspon stanica domaćina.

Antireceptori se mogu pronaći u jedinstvenim virusnim organelama: izrasline u T-bakteriofagima, vlakna u adenovirusa, šiljci na površini virusnih membrana, korona u koronavirusa.

Prodiranje.

2 mehanizma - endocitoza receptora i fuzija membrane.

Receptorska endocitoza:

Uobičajeni mehanizam ulaska hranjivih i regulatornih tvari u stanicu. Javlja se u specijaliziranim područjima - gdje postoje posebne jame prekrivene klatrinom, specifični receptori nalaze se na dnu jame. Jame omogućuju brzu invaginaciju i stvaranje vakuola prekrivenih klatrinom (od trenutka adsorpcije ne prođe više od 10 minuta, u jednoj minuti može se formirati do 2000 vakuola). Vakuole se stapaju s većim citoplazmatskim vakuolama da bi formirale receptorosome (koji više ne sadrže klatrin), koji se zatim stapaju s lizosomima.

Fuzija virusnih i staničnih membrana:

U virusima s ovojnicom, fuzija je posredovana točkastim interakcijama virusnog proteina s lipidima stanične membrane, što rezultira integracijom virusne lipoproteinske ovojnice sa staničnom membranom. Kod virusa bez ovojnice, jedan od površinskih proteina također stupa u interakciju s lipidima stanične membrane, a unutarnja komponenta prolazi kroz membranu (kod paramiksovirusa, F-protein; kod ortomiksovirusa, HA2 hemaglutinirajuća podjedinica). Na konformaciju površinskih proteina utječe pH.

Traka.

U tom procesu nestaje infektivna aktivnost, često se javlja osjetljivost na nukleaze i javlja se rezistencija na antitijela. Krajnji produkt svlačenja su nukleinske kiseline vezane za unutarnji virusni protein. Stadij svlačenja također ograničava mogućnost infekcije (virusi se ne mogu svući u svakoj stanici). Svlačenje se događa u specijaliziranim područjima stanice: lizosomima, Golgijevom aparatu i perinuklearnom prostoru.

Svlačenje se odvija kao rezultat niza reakcija. Na primjer, u pikornavirusima, svlačenje se odvija stvaranjem srednjih subviralnih čestica veličine od 156 do 12S. Kod adenovirusa u citoplazmi i jezgrinim porama ima najmanje 3 stadija:

Stvaranje subviralnih čestica veće gustoće od viriona;

Stvaranje jezgri u kojima nedostaju 3 virusna proteina;

Stvaranje kompleksa DNA-protein u kojem je DNA kovalentno povezana s terminalnim proteinom.

Karakterizacija virulentnih i umjerenih faga.

Kada je bakterija zaražena fagom, dolazi do tzv. litičke infekcije, tj. infekcije koja kulminira lizom stanice domaćina, ali to je karakteristično samo za takozvane virulentne fage, čija interakcija sa stanicom dovodi do stanične smrti i stvaranja fagnog potomstva.

U tom slučaju razlikuju se sljedeći stupnjevi prema interakcijama faga sa stanicom: miješanje faga sa staničnom kulturom (mnoštvo infekcije je 1 fag na 10 stanica), a koncentracija mora biti dovoljno visoka da se fagi mogu kontaktirati stanice. Kako bi se izbjegla ponovna infekcija - nakon infekcije maksimalno 5 minuta, kada se fagi adsorbiraju - ova smjesa stanica s fagom se razrjeđuje. Postoji latentno razdoblje tijekom kojeg se broj faga ne povećava, zatim vrlo kratko razdoblje izlaska, kada broj čestica faga naglo raste, kada stanica lizira i potomstvo faga se oslobađa, a zatim broj faga ostaje na istoj razini, jer ne dolazi do ponovne infekcije. Na temelju ove krivulje mogu se razlikovati ove faze: vegetativno razdoblje "rasta" (latentno razdoblje), izlazno razdoblje i izračunati prinos faga po 1 zaraženoj stanici. Tijekom latentnog razdoblja u bakterijama se ne može naći ništa što bi podsjećalo na čestice faga, te nije moguće izolirati infektivni princip iz takvih stanica u latentnom razdoblju. Samo zrele čestice faga mogu zaraziti bakterije. Dakle, virulentni fagi uvijek uzrokuju smrt bakterija i proizvode infekciju, koja se očituje u proizvodnji novih virusnih čestica sposobnih zaraziti sljedeće i druge osjetljive stanice.

Za razliku od virulentnih, infekcija umjerenim fagima ne dovodi do lize bakterijskih stanica, već se ostvaruje stvaranje posebnog stanja koegzistencije faga s bakterijskom stanicom. Ova koegzistencija se izražava u činjenici da je određeni početak faga prisutan u bakterijskoj stanici bez ikakvih nepovoljnih uvjeta za to i čuva se iz generacije u generaciju. U određenim fazama takvog suživota fag se aktivira u stanici i ulazi u stanje litičkog ciklusa razvoja, uzrokujući lizu stanice i oslobađanje fagnog potomstva. Takvi se fagi nazivaju lizogeni ili umjereni fagi, a stanje umjerenog postojanja s fagom je lizogenija, a bakterije koje sadrže takav latentni fag nazivaju se lizogene bakterije. Naziv lizogene bakterije proizašao je iz činjenice da su jednom otkrivene kulture u kojima se spontano pojavio fag, pa se taj bakteriofag počeo smatrati kontaminacijom kulture, odnosno ulazak bakterijskog virusa u kulturu, te su takve kulture nazvane lizogenim, odnosno generiraju lizu .

Virusi se, za razliku od bakterija, razmnožavaju samo u živim stanicama. S tim u vezi, uzgoj virusa može se provoditi na razini tijela pokusne životinje (pileći embrij kao organizam u razvoju naziva se pokusnim životinjama) ili žive stanice uzgojene izvan tijela, tj. na razini stanične kulture.

Korištenje laboratorijskih životinja. Jedna od metoda izolacije i uzgoja virusa je zaraza laboratorijskih životinja. Koriste se za izolaciju virusa koji ne uzrokuju razvoj citopatskih promjena u kulturama stanica i ne razmnožavaju se u pilećim embrijima. Korištenje laboratorijskih životinja također omogućuje prepoznavanje prirode virusne infekcije kompleksom kliničkih simptoma. Kao laboratorijske životinje najčešće se koriste bijeli miševi, hrčci, zamorci i kunići, ovisno o namjeni rada i vrsti virusa koji se proučavaju. Od većih životinja koriste se majmuni raznih vrsta i neke druge životinje. Od ptica koristite kokoši, guske, patke. Posljednjih godina, novorođenčad (osjetljivija na viruse), "sterilne životinje" (izvađene iz maternice i držane u sterilnim uvjetima koristeći sterilni zrak i steriliziranu hranu) i životinje čistih linija s poznatim nasljeđem (inbred ili linearne životinje) češće se koristi.

U pokus se uzimaju samo zdrave životinje, po mogućnosti iz jednog rasadnika i jedne serije. Istovremeno se mjeri i tjelesna temperatura, budući da ima dnevnih oscilacija. Ispitni materijal se primjenjuje uzimajući u obzir tropizam virusa na određena tkiva. Dakle, za izolaciju neutrotropnih virusa materijal se ubrizgava u mozak, za izolaciju pneumotropnih virusa - kroz nos (pod laganom eter anestezijom).

Kod laboratorijskih životinja, nakon infekcije materijalom koji sadrži virus, važno je pravodobno i pravilno te aseptično uzeti materijal za daljnje istraživanje. Rezultati izolacije virusa smatraju se pozitivnima ako životinja razvije simptome infekcije nakon odgovarajućeg razdoblja inkubacije.

Korištenje pilećih embrija. U tkivima embrija, njegovim membranama, žumanjčanoj vrećici mogu se razmnožavati mnogi patogeni ljudski i životinjski virusi. U ovom slučaju važna je selektivnost virusa prema određenom tkivu: virusi velikih boginja dobro se razmnožavaju i nakupljaju u stanicama korionsko-alantoisne membrane, virus zaušnjaka u amnionu, virusi influence u amnionu i alantoisu, a virus bjesnoće u žumanjčanoj vrećici.

Uzgoj virusa u embrijima u razvoju ima niz prednosti u odnosu na druge metode: gusta ljuska prilično pouzdano štiti unutarnji sadržaj od mikroba; kada se zaraze pileći embriji, dobiva se veći prinos materijala koji sadrži virus nego kod drugih metoda uzgoja; metoda zaraze pilećih embrija je jednostavna i dostupna svim virološkim laboratorijima; embriji imaju dovoljnu održivost i otpornost na patogene vanjske čimbenike. Međutim, pileći embriji nisu uvijek slobodni od latentnih virusnih i bakterijskih infekcija. Teško je promatrati dinamiku patoloških promjena koje se javljaju u embriju nakon infekcije virusom. Obdukcija zaraženih embrija često ne otkrije vidljive promjene, a otkriva virus pomoću testa hemaglutinacije i drugih metoda. Kod zaraženih embrija nemoguće je pratiti porast titra antitijela. Metoda nije prikladna za sve viruse.

Za virološka istraživanja koriste se embriji stari 7-12 dana koji se dobivaju s farmi peradi. Možete uzgajati zametke u konvencionalnom termostatu, na čijem se dnu nalaze posude s vodom za vlaženje zraka. Temperatura u termostatu treba biti 37 ° C, a vlažnost zraka 60-65%. Odaberite velika, čista (ali neoprana), oplođena jaja od bijelih pilića, čuvana ne više od 10 dana na temperaturi od 5-10°C. Oplođena jajašca prepoznaju se po prisutnosti germinativnog diska koji, proziran ovoskopom, izgleda kao tamna mrlja.

U radu s virusima mogu se koristiti različite metode inficiranja embrija, no najpraktičnija primjena je aplikacija virusa na korionsko-alantoisnu membranu, uvođenje u alantoičnu, amnionsku šupljinu i žumanjčanu vrećicu.

(Slika 10.5). Izbor metode ovisi o biološkim svojstvima virusa koji se proučava.

Riža. 10.5.

Prije infekcije ovoskopom se utvrđuje vitalnost embrija. Živi embriji su pokretni, pulsiranje žila membrana je jasno vidljivo. Prilikom svijećenja označite jednostavnom olovkom na ljusci granice zračnog mjehurića ili mjesto embrija koje se određuje prema njegovoj sjeni na ljusci.

Pileći embriji se inficiraju u kutiji u strogo aseptičnim uvjetima pomoću instrumenata steriliziranih kuhanjem.

Kod infekcije na korionsko-alantoisnoj membrani najprikladniji su embriji stari 12 dana. Za infekciju u alantoisnoj šupljini koriste se embriji od 10-11 dana, u amnionskoj šupljini - embriji od 7-11 dana, u žumanjčanoj vrećici - embriji od 7 dana.

Jaja sa zaraženim embrijima stavljaju se na postolje s tupim krajem prema gore. Temperaturni režim i razdoblje inkubacije ovise o biološkim svojstvima inokuliranog virusa. Životna sposobnost embrija prati se svakodnevno pod ovoskopom. Ne ispituju se embriji koji su prvi dan nakon infekcije uginuli zbog ozljede.

Prije uzimanja materijala, embriji se hlade na 4 °C 18-20 sati kako bi se suzile krvne žile i spriječilo krvarenje pri autopsiji. Embriji se u boksu otvaraju u skladu s pravilima asepse.

Alantoisna tekućina se usisava pipetom, sterilnost se kontrolira inokulacijom u šećernu ili mesno-peptonsku juhu, provjerava prisutnost virusa u reakciji hemaglutinacije i čuva na 4 °C u smrznutom stanju.

Za dobivanje amnionske tekućine najprije se aspirira alantoisna tekućina, zatim se amnionska ovojnica uhvati pincetom, lagano podigne te se amnionska tekućina usisava Pasteur-ovom pipetom.

Prilikom proučavanja promjena na korionsko-alantoisnoj membrani ona se reže škarama i sav sadržaj se kroz otvor izlije u Petrijevu zdjelicu. Korionsko-alantoisna membrana ostaje unutar ljuske i uklanja se pincetom u Petrijevu zdjelicu s fiziološkom otopinom. Ovdje se pere, ravna i proučava se priroda žarišnih lezija na tamnoj pozadini.

Da bi se dobila amnionska membrana, amnionska vrećica u kojoj je embrij zatvoren se reže i oslobađa od embrija, pregledava se ima li lezija.

Za dobivanje žumanjčane opne prereže se korion-alantois, isiše se alantoisna i amnionska tekućina, pincetom se izvadi plod, odvoji pupkovinom, uhvati žumanjčana vrećica i stavi u Petrijevu zdjelicu. Kontrola sterilnosti, pregled prisutnosti lezija. Žumanjak se po potrebi može izvaditi štrcaljkom bez vađenja žumanjčane vrećice.

Prisutnost virusa u alantoisnoj i amnionskoj tekućini zaraženog embrija utvrđuje se testom hemaglutinacije. Tekućine iz hemaglutinacijski pozitivnih embrija nakon testiranja na sterilnost skupljaju se i titriraju u proširenom hemaglutinacijskom testu.

U prisutnosti male količine virusa ili nemogućnosti njegovog otkrivanja u ispitnom materijalu, provode se uzastopne pasaže na pilećim zamecima. Ako se nakon tri uzastopna pasaža na embrijima virus ne otkrije u ispitivanom materijalu, rezultat se smatra negativnim.

Korištenje staničnih kultura. Uzgoj stanica izvan tijela zahtijeva ispunjenje niza uvjeta. Jedan od njih je strogo poštivanje sterilnosti tijekom rada, budući da su korišteni hranjivi mediji izvrstan hranjivi supstrat i za bakterije i gljivice. Stanice tkiva su vrlo osjetljive na soli teških metala. Stoga se kvaliteti različitih sastojaka koji čine fiziološke otopine i hranjive medije, kao i metodama obrade posuđa i gumenih čepova koji se koriste u staničnoj kulturi, mora pridati iznimna važnost.

Jedan od preduvjeta za uspješan rad sa stanicama je visoka kvaliteta destilirane vode (kontrola dva puta tjedno). Za rad sa stanicama koristi se bidestilirana ili deionizirana voda. Najbolji destilatori su uređaji izrađeni od stakla ili legiranog čelika: ioni teških metala, koji su otrovni za stanice, ne ispiru se iz takve opreme. Deionizirana voda dobiva se u posebnim postrojenjima, gdje se voda pročišćava od soli uzastopnim prolaskom kroz kolone s anionskim i kationskim izmjenjivačem.

Kod uzgoja stanica posebno se visoki zahtjevi postavljaju na pripremu i sterilizaciju posuda i čepova. U mnogim slučajevima, njihovo nepravilno pranje i sterilizacija uzrokuje nepričvršćivanje stanica na staklo ili brzu degeneraciju staničnog monosloja.

Za rast i razmnožavanje stanica izvan tijela potreban je složen skup fizikalno-kemijskih čimbenika: određena temperatura, koncentracija vodikovih iona, anorganskih spojeva, ugljikohidrata, aminokiselina, bjelančevina, vitamina, kisika i ugljičnog dioksida, dakle, za za uzgoj virusa u kulturama stanica koriste se hranjive podloge složenog sastava. Ovi mediji se prema prirodi sastojaka koji ulaze u njihov sastav dijele u dvije skupine.

• 1. Mediji, koji su mješavine slanih otopina (Hanks, Earl i dr.) i prirodnih komponenti (životinjski i ljudski krvni serum, hidrolizat albumina). Količina svake od ovih komponenti u različitim formulacijama medija je različita.
• 2. Sintetski i polusintetski mediji koji se sastoje od slanih otopina (Earl, Hanks i dr.) s dodatkom aminokiselina, vitamina, koenzima i nukleotida (Eagle media, 199 i dr.). U sintetskim podlogama stanice mogu postojati u održivom stanju kratko vrijeme (do 7 dana). Da bi se duže vrijeme održale u vitalnom stanju, kao i da bi se stvorili bolji uvjeti za rast i razmnožavanje stanica, u sintetske podloge dodaje se serum životinjske krvi (krave, telad i dr.).

Za izolaciju virusa mogu se koristiti različite metode uzgoja stanica izvan tijela. Međutim, trenutačno su najveću praktičnu primjenu dobile jednoslojne kulture primarnih tripsiniziranih i transplantiranih staničnih linija. Jednoslojne stanične kulture uzgajaju se u staklenim posudama ravnih stijenki-madracima zapremine 1 l, 250 i 100 ml ili u konvencionalnim bakteriološkim epruvetama tretiranim na odgovarajući način.

Kada se koriste primarne tripsinizirane stanične kulture, bit metode je u razaranju međustaničnih veza u tkivima proteolitičkim enzimima i odvajanju stanica za rast monosloja na površini stakla. Kao izvor za dobivanje stanica mogu poslužiti tkiva i organi ljudskih i životinjskih embrija, zaklanih životinja i ptica, kao i oni izvađeni iz ljudi tijekom operacije. Koristiti normalna i maligna degenerirana tkiva, epitelna, fibroblastičnog tipa i miješana. Sposobnost reprodukcije stanica ekstrahiranih iz tijela usko je povezana sa stupnjem diferencijacije tkiva. Što je tkivo manje diferencirano, sposobnost njegovih stanica za proliferaciju in vitro je intenzivnija. Stoga je stanice embrionalnih i tumorskih tkiva mnogo lakše kultivirati izvan tijela nego normalne stanice odraslih životinja.

Dnevne kulture promatraju se pod mikroskopom s malim povećanjem kako bi se odredila priroda njihova rasta. Ako stanice ne proliferiraju, izgledaju okrugle, zrnate, tamne i ljušte se sa stakla, stakleno posuđe je loše obrađeno ili su sastojci u mediju kulture otrovni.

Uz primarna tripsinizirana tkiva, presađene stanične kulture naširoko se koriste za uzgoj virusa; stanične kulture sposobne za beskonačnu reprodukciju izvan tijela. Najčešće se koriste stanične kulture dobivene iz normalnih i kancerogenih ljudskih tkiva. Postala je široko poznata stanična linija HeLa dobivena iz tumora vrata maternice, Hep-2 iz karcinoma larinksa, KV iz tkiva raka usne šupljine. Takve stanične kulture pripremaju se i iz normalnih životinjskih tkiva - bubrega majmuna, zeca i embrija svinje (tablica 10.1).

Za presađivanje transplantiranih stanica hranjivi medij se usisava pipetom i izlijeva. Nastali tanki sloj stanica uništava se otopinom tripsina, a tako oslobođene stanice prenose se u novu posudu sa svježom hranjivom otopinom, gdje se ponovno formira jednosloj stanica.

Indikator prisutnosti virusa u zaraženim kulturama stanica može biti:

• a) razvoj specifične degeneracije stanica;
• b) otkrivanje intracelularnih inkluzija;
• c) dokazivanje specifičnog antigena imunofluorescencijom;
• d) pozitivna hemadsorpcijska reakcija;
• e) pozitivna reakcija hemaglutinacije;
• e) stvaranje plakova.

Tablica 10.1

Popis najčešće korištenih staničnih kultura

Kako bi se otkrila specifična degeneracija u zaraženim kulturama, stanice se svakodnevno ispituju pod mikroskopom s malim povećanjem. Mnogi virusi, kada se množe u stanicama, uzrokuju njihovu degeneraciju, t.j. imaju citopatogeno djelovanje (CPA) (slika 10.6).

Riža. 10.6.

Vrijeme razvoja i priroda citopatskih promjena u inficiranim staničnim kulturama određeni su svojstvima i dozom inokuliranog virusa, kao i svojstvima i uvjetima uzgoja stanica. Neki virusi uzrokuju CPP unutar prvog tjedna nakon infekcije (boginje, dječja paraliza, Coxsackie B, itd.), Drugi - nakon 1-2 tjedna. nakon infekcije (adenovirusi, virusi parainfluence, ECHO i dr.).

Virusi uzrokuju tri glavne vrste citopatskih promjena: stvaranje višenuklearnih divovskih stanica i simplasta, koji su rezultat spajanja citoplazme mnogih stanica; degeneracija okruglih stanica koja je posljedica gubitka međustaničnih veza i zaokruživanja stanica; razvoj žarišta stanične proliferacije, koji se sastoji od nekoliko slojeva stanica.

Tijekom reprodukcije nekih virusa u kulturama stanica, unutarstanične inkluzije nastaju u citoplazmi ili jezgri zahvaćenih stanica. Kulture stanica za otkrivanje inkluzija uzgajaju se na staklenim pločama u epruvetama zaraženim virusom, a nakon određenih inkubacijskih perioda pripremaju se preparati bojenjem konvencionalnim bojama.

Za detekciju specifičnog antigena u inficiranim kulturama stanica pripravci se pripremaju na isti način kao i za detekciju inkluzija pomoću MFA.

Metoda plaka temelji se na stvaranju obojenih područja u jednoslojnom sloju stanica zaraženih virusom ispod agarske prevlake koja se sastoji od degeneriranih (mrtvih) stanica. Ta područja, koja se nazivaju plakovi, kolonije su virusa, obično formirana od jedne virusne čestice.

U nedostatku citopatskih promjena, intracelularnih inkluzija, stvaranja plaka, negativnih reakcija hemadsorpcije i hemaglutinacije u kulturama stanica zaraženim ispitivanim materijalom, provode se dva uzastopna pasaža. U nedostatku ovih promjena u konačnom prolazu, rezultat izolacije virusa smatra se negativnim.

Sljedeće metode mogu se koristiti za otkrivanje virusa u zaraznom materijalu.

Mikroskopski:

• a) viroskopija;
• b) detekcija intracelularnih inkluzija.

Imunološki:

• a) imunološka elektronska mikroskopija;
• b) imunofluorescencija;
• c) hemaglutinacija;
• d) hemadsorpcija.

Identifikacija virusa provodi se imunološkim metodama, uključujući sljedeće reakcije:

• a) inhibicija hemaglutinacije;
• b) kašnjenja hemadsorpcije;
• c) vezanje komplementa;
• d) neutralizacija;
• e) taloženje u agar gelu.

mikroskopske metode. Svjetlosnim mikroskopom mogu se otkriti samo veliki virusi veći od 150 nm. Prepoznavanje manjih virusa moguće je samo elektronskim mikroskopom. Svjetlo, fazni kontrast i fluorescentna mikroskopija mogu se koristiti za otkrivanje velikih virusa.

Tijekom virusnih infekcija u zaraženim stanicama nastaju osebujne inkluzije. Neke infekcije popraćene su stvaranjem inkluzija u citoplazmi zahvaćenih stanica (bjesnoća, cjepivo protiv velikih boginja), druge - u citoplazmi i jezgri (ospice, prirodne i vodene kozice, adenovirusne bolesti). Uključci imaju različitu prirodu, strukturu, oblik i veličinu od 0,25 do 25 mikrona. Prema suvremenim podacima, u nekim infekcijama inkluzije su mjesto reprodukcije virusa i predstavljaju njegove nakupine okružene staničnom tvari, dok su u drugima proizvod degeneracije stanica.

Inkluzije se mogu detektirati u obojenim otiscima organa i tkiva, strugotinama stanica, histološkim rezovima zahvaćenog tkiva i preparatima kulture stanica zaraženih virusom. Bojanje se često vrši prema metodi Romanovsky-Giemsa. Za bojenje ovom metodom, pripravci se fiksiraju u mješavini Dubosque - Brazil - Bouin, koja se sastoji od pikrinske kiseline, formalina, alkohola, octene kiseline. Intracelularne inkluzije u većini virusnih infekcija su oksifilne i boje se ružičasto ili lila prema metodi Romanovsky-Giemsa.

Imunološke metode dijagnostike virusnih infekcija. Posljednjih godina ove su metode postale vodeće u laboratorijskoj dijagnostici virusnih infekcija. To je većim dijelom zbog ekonomskih razloga, budući da su klasične metode virološke analize dosta skupe. Osim toga, trajanje studija koje koriste virološke metode (tjedni), čak i ako su prilično učinkovite, čini ih retrospektivnim.

Imunološke metode koriste se kako za otkrivanje virusnih antigena u različitim biosupstratima i objektima okoliša, tako i za serodijagnostiku - otkrivanje protutijela na virusne antigene u krvnim serumima bolesnih ljudi i laboratorijskih životinja. Osim toga, za identifikaciju viriona nezamjenjive su imunološke metode istraživanja.

U interakciji s tijelom, virusi uzrokuju stvaranje protutijela koja, adsorbirana na virionima, sprječavaju prodiranje viriona u stanice i razvoj citopatskog djelovanja (CPE); neutralizirati smrtonosni učinak virusa tijekom njihove reprodukcije u pilećim embrijima i životinjama; inaktiviraju virionske hemaglutinine i neuraminidazu, sprječavajući reakciju hemaglutinacije (RGA) i reakciju hemadsorpcije (RGads) na stanicama zahvaćenim virusom. Ta protutijela koja neutraliziraju virus također uzrokuju aglutinaciju i taloženje virusnih čestica, a nastali imunološki kompleksi vežu komplement. Stoga se za identifikaciju viriona koristi klasična reakcija neutralizacije (PH) na kulturama stanica, pilećim embrijima i životinjama te njezine modifikacije: reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA); reakcija inhibicije hemadsorpcije (RTGads). Iste se reakcije koriste u serodijagnostici virusnih infekcija za otkrivanje virusneutralizirajućih protutijela u serumu bolesnika prema poznatom virusnom antigenu (diagnosticum).

Metoda imunoelektronske mikroskopije (IEM). Elektronska mikroskopija trenutno igra važnu ulogu u proučavanju virusa. Upravo podaci elektronske mikroskopije služe kao osnova za suvremenu klasifikaciju virusa.

Nova faza u razvoju elektronskog mikroskopskog proučavanja virusa je uporaba tehnika imunoelektronske mikroskopije. Korištenjem ove metode postalo je moguće ne samo izravno otkrivanje virusa, već i njihova identifikacija, kao i brza serotipizacija virusnih sojeva i titracija protutijela na njih. IEM je stekao veliku važnost za određivanje lokalizacije virusnih antigena unutar stanica makroorganizma.

Nedvojbena prednost IEM-a je njegova visoka osjetljivost u usporedbi s konvencionalnim metodama elektronske mikroskopije.

Kada virusni antigen ili virusna komponenta dođe u kontakt s homolognim antiserumom, formira se kompleks antitijelo-antigen. Ovaj fenomen je osnova tehnike koja se koristi za detekciju i identifikaciju virusnih antigena ili antitijela na njih. Upravo se ti kompleksi antigena s antitijelima nakon negativnog bojenja mogu promatrati u elektronskom mikroskopu. U kliničkoj dijagnostici antigenski materijal ne zahtijeva temeljito pročišćavanje. Dakle, ako se otkrije virus influence, može se ispitati nepročišćena alantoisna tekućina. Trenutačno se vjeruje da je gotovo svaka vrsta kliničkog materijala prikladna za IEM. U dijagnostičke svrhe mogu se koristiti obični nefrakcionirani serumi, kao i serumi rekonvalescenata. Treba napomenuti da omjer količine antigena i antitijela ima veliki utjecaj na konačne rezultate. S viškom antigena opaža se obilje čestica; aglomerata u ovom slučaju bit će malo. S viškom antitijela, virusne čestice su okružene njihovim debelim slojem, gotovo je nemoguće otkriti male strukturne detalje viriona; agregata je također malo. Uz optimalan omjer antigena i antitijela, agregati su uvećani s dobrom slikom detalja viriona. Iz navedenih razmatranja, poželjno je koristiti imunološki serum u nekoliko razrjeđenja.

Noseći film izrađen od paladija nanosi se na potpornu rešetku. Pri korištenju niskih koncentracija paladija i za poboljšanje adsorpcijskih svojstava supstrat se ojačava ugljikom. Da bi se to postiglo, ugljen se raspršuje na gotov suhi film-supstrat na elektronsko-mikroskopskoj rešetki u vakuumu. Debljina filma-supstrata i ojačavajućeg karbonskog sloja ima značajan utjecaj na kontrast i sliku finih detalja objekta. Svaki istraživač pojedinačno određuje specifičnu debljinu supstratnih filmova i sloja ugljika, na temelju činjenice da je ugljik elektronski prozirniji od paladija.

Virusi i antitijela na njih imaju nisku gustoću elektrona. Stoga se biološki objekti ne mogu otkriti pomoću elektronskog mikroskopa bez prethodne obrade. Virusi se vizualiziraju pomoću tehnike negativnog kontrasta (ili negativne boje). Za negativno bojenje virusa i kompleksa virus-antitijelo koriste se razne soli teških metala. Kontrastna sredstva (atomi teških metala) prodiru u hidrofilna područja predmeta i zamjenjuju vodu u njima. Kao rezultat toga, elektronska gustoća objekta raste, te ga postaje moguće promatrati u elektronskom mikroskopu.

Izravna IEM metoda našla je najveću primjenu u praksi. Suspenzija virusa se pomiješa s nerazrijeđenim antiserumom. Nakon snažnog miješanja, smjesa je inkubirana 1 h pri

37°C, zatim preko noći na 4°C. Sljedećeg dana smjesa se centrifugira kako bi se istaložili imunološki kompleksi. Talog se resuspendira u kapi destilirane vode i podvrgne negativnom kontrastu.

Pri procjeni rezultata IEM-a produkti interakcije antigena i protutijela u elektronskom mikroskopu mogu imati različit izgled (pojedinačna virusna čestica prekrivena protutijelima u cijelosti ili djelomično; nakupine virusnih čestica). Aglomerati mogu zauzimati različitu površinu, imati drugačiji izgled i sadržavati različiti broj čestica. Stoga je uz eksperimentalne potrebno proučavati i kontrolne pripravke (s puferskom otopinom ili heterolognim antiserumom).

Kriterij za procjenu rezultata dobivenih korištenjem IEM je prisutnost ili odsutnost klastera virusnih čestica agregiranih imunološkim serumom u pripravcima. Prisutnost aglomerata antigena i specifičnih antiserumskih protutijela znak je pozitivne reakcije. Ipak, treba uzeti u obzir mogućnost nespecifične agregacije antigenskih čestica pod utjecajem centrifugiranja velikom brzinom. Zbog toga mnogi autori preporučuju razmatranje rezultata na uvjetnoj skali od 0 do 4+. Temelji se na procjeni stupnja pokrivenosti agregiranih čestica serumskim protutijelima.

Metode hemaglutinacije i hemadsorpcije. Mnogi virusi imaju sposobnost aglutinacije eritrocita strogo određenih vrsta sisavaca i ptica. Tako virusi gripe i zaušnjaka aglutiniraju eritrocite kokoši, zamoraca i ljudi; virus krpeljnog encefalitisa - ovčji eritrociti; Virusi japanskog encefalitisa - eritrociti jednodnevnih kokoši i gusaka; adenovirusi - eritrociti štakora, miševa, majmuna. Kao ispitni materijal u reakciji hemaglutinacije (HA) koriste se alantoisna, amnionska tekućina, suspenzija korionsko-alantoisnih membrana pilećih embrija, suspenzije i ekstrakti kultura stanica ili organa životinja zaraženih virusima. Reakcija hemaglutinacije može se postaviti metodom kapanja na staklu iu proširenom nizu u epruvetama ili jažicama polistirenskih ploča. Prva metoda je indikativna.

Budući da je specifičan za skupinu, RGA ne omogućuje određivanje vrste virusa. Identificiraju se testom inhibicije hemaglutinacije (HITA). Za njegovu formulaciju koriste se poznati imunološki antivirusni serumi. Svakom razrjeđenju dodaje se jednaka količina tekućine koja sadrži virus. Kontrola je suspenzija virusa.

Smjesa se drži u termostatu, zatim se dodaje suspenzija eritrocita. Nekoliko minuta kasnije određuje se titar neutralizirajućeg seruma, tj. njegovo maksimalno razrjeđenje, što je uzrokovalo odgodu aglutinacije eritrocita.

U serološkoj dijagnostici virusnih bolesti RTHA se preporuča koristiti s parnim serumima od kojih se jedan dobiva na početku bolesti, a drugi nakon 1-2 tjedna ili više. Četverostruko povećanje titra protutijela u drugom serumu potvrđuje predloženu dijagnozu.

Hemadsorpcijska reakcija (RGads) koristi se za indiciranje virusa s hemaglutinirajućom aktivnošću u inficiranim staničnim kulturama. Bit reakcije leži u činjenici da se eritrociti osjetljivi na hemaglutinirajuće djelovanje virusa adsorbiraju na površini stanica zaraženih virusima. Na primjer, kokošji eritrociti adsorbiraju se na stanice zaražene virusom variole; virus ospica - eritrociti majmuna; adenovirusi - majmuni i štakori itd.

Reakcija neutralizacije (PH). Razmnožavajući se u kulturama stanica, virusi uzrokuju različite vrste CPD-a, izražene u zaokruživanju, boranju, smanjenju ili, obrnuto, povećanju veličine stanica, njihovom spajanju i formiranju simplasta, uništavanju citoplazme i jezgre. Naposljetku, u monosloju stanica zaraženih virusima, kao rezultat njihovog uništavanja određenih dijelova stančnog sloja, mogu se pojaviti "sterilne mrlje" ili plakovi, koji su klon virusne čestice, što omogućuje ne samo izolirati virus, ali i odrediti njegov titar.

Vrlo je teško identificirati virus prema prirodi plakova, pa se pribjegava određivanju PH izoliranog virusa poznatim serumima koji neutraliziraju virus. U tu se svrhu virus dobiven od bolesnika akumulira u staničnoj kulturi i njegova se različita razrjeđenja miješaju s nerazrijeđenim antivirusnim serumom.

Mješavina virusa i seruma može zaraziti pileće embrije ili osjetljive životinje. U takvim slučajevima neutralizirajuća aktivnost protutijela najčešće se utvrđuje neutralizacijom virusnih hemaglutinina u tekućinama embrija i uklanjanjem letalnog učinka virusa na embrije i životinje. Istodobno se izračunava neutralizacijski indeks koji izražava najveći broj letalnih doza virusa koje neutralizira ovaj serum u usporedbi s rezultatima kontrolnog pokusa uzetim kao jedinica.

Slično, korištenjem PH, identificiraju se virusi izolirani iz materijala bolesnika kada inficiraju kokošje embrije i životinje. Da bi se to postiglo, tekućine embrija koje sadrže virus i suspenzije zahvaćenih organa životinja dodaju se u serume koji neutraliziraju virus. Nakon određenog vremena inkubacije smjesama se zaraze stanične kulture, pileći embriji i životinje.

U serodijagnostici virusnih infekcija određuje se dinamika porasta titra virusneutralizirajućih protutijela za poznati virus. Pritom se PH postavlja parnim serumima uzetim od pacijenata na početku i na kraju bolesti. Dijagnostički će biti 4-struko povećanje titra imunoglobulina u drugom od njih.

PH se temelji na sposobnosti specifičnih antitijela da se dovoljno snažno vežu za virusnu česticu. Kao rezultat interakcije između virusa i protutijela dolazi do neutralizacije infektivne aktivnosti virusa zbog blokade antigenskih determinanti odgovornih za vezu virusne čestice s osjetljivim stanicama. Kao rezultat toga, virus gubi sposobnost umnožavanja u osjetljivom biološkom sustavu in vitro ili in vivo.

Rezultati PH postaju vidljivi nakon što se mješavina virusa i njegovih homolognih protutijela, nakon vremenskog izlaganja, unese u osjetljivi biološki sustav (kultura stanica tkiva, pileći embrij, prijemljivo životinjsko tijelo), gdje se virus može razmnožavati i uzrokovati mjerljive promjene koje će djelomično ili potpuno biti potisnute u prisutnosti protutijela.

Tri su komponente uključene u PH:

• 1) virus;
• 2) serum koji sadrži antitijela;
• 3) biološki objekt (laboratorijske životinje, pileći embriji u razvoju, kulture tkiva), čiji izbor ovisi o vrsti virusa s kojim se istraživanje treba provesti.

PH se koristi ili za identifikaciju izoliranog patogena ili za otkrivanje i titraciju protutijela u serumu. U prvom slučaju koriste se serumi posebno imuniziranih laboratorijskih životinja ili oporavljenih ljudi. U drugom slučaju koriste se serumi uzeti u početnoj fazi bolesti i tijekom razdoblja rekonvalescencije.

Protutijela koja neutraliziraju virus u serumu oporavljenih ljudi, za razliku od antihemaglutinina ili protutijela za fiksaciju komplementa, postoje godinama, a kod nekih virusnih infekcija (primjerice ospice) i doživotno. To u nekim slučajevima omogućuje korištenje skupa seruma mnogih rekonvalescenata kao referentnog lijeka, koji je nakon punjenja u ampule i liofilizacije dugotrajno prikladan za dijagnostički rad.

Za identifikaciju izoliranih uzročnika koriste se unaprijed pripremljeni hiperimuni serumi različitih životinja: zečeva, bijelih štakora i miševa, zamoraca, majmuna, ovaca, konja itd. Aktivnost hiperimunih seruma za PH ovisi o načinu imunizacije životinja.

Prije postavljanja svakog eksperimenta neutralizacije, virus se prethodno titrira, određujući konačno razrjeđenje koje uzrokuje oštećenje kulture tkiva ili infekciju laboratorijskih životinja (ili pilećih embrija). Titar virusa izražava se kao 50% doza (TCID50 - 50% infektivna doza za kulturu tkiva).

Molekularno genetičke dijagnostičke metode u virološkoj praksi. Metode molekularne biologije razvijene su 50-ih godina prošlog stoljeća. XX. stoljeća. Postali su mogući zahvaljujući činjenici da u genomu svakog virusa postoje jedinstvene nukleotidne sekvence specifične za vrstu, čijim otkrivanjem se može identificirati bilo koji uzročnik infekcije. Ove su metode najvažnije u identificiranju mikroorganizama koji se dugoročno ili teško uzgajaju konvencionalnim metodama. U 1970-ima, detekcija DNA sondom korištena je za otkrivanje infektivnog agensa ili mutacije, na temelju hibridizacije specifičnih oligonukleotidnih sondi obilježenih radioaktivnim izotopom (ili fluorokromom) s izoliranim DNA uzorkom. Hibridizacijska analiza koristi sposobnost nukleinskih kiselina da pod određenim uvjetima tvore specifične komplekse s nukleinskim kiselinama koje imaju sekvence koje su im komplementarne. Metoda otkrivanja zaraznih uzročnika DNA hibridizacijom pokazala se iznimno napornom, dugotrajnom i skupom. Osim toga, njegova je osjetljivost nedovoljna za identifikaciju mikroorganizama u kliničkim materijalima kao što su feces i urin.

Hibridizacija DNA zamijenjena je metodom koja oponaša prirodnu replikaciju DNA i omogućuje otkrivanje i opetovano kopiranje određenog fragmenta DNA pomoću termofilne DNA polimeraze. Lančana reakcija polimerazom (PCR) je elegantna metoda koja oponaša prirodnu replikaciju DNK i omogućuje da se određeni dio DNK otkrije i opetovano kopira pomoću termofilne DNK polimeraze.

Zbog svojih visokih dijagnostičkih kvaliteta, PCR je općepriznat dodatak tradicionalnim metodama koje se koriste u virologiji: razmnožavanje virusa u staničnoj kulturi, imunološka detekcija virusnih antigena i elektronska mikroskopija. Značajna prednost ove metode je mogućnost otkrivanja virusa u latentnim infekcijama (citomegalovirus, herpes virus) i virusa koje je teško ili još nije moguće kultivirati (virus humane imunodeficijencije, Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, virus hepatitisa Vidr). Perspektive proučavanja bolesti kao što su Creutzfeldt-Jakobova bolest, Alzheimerova bolest i multipla skleroza povezuju se s PCR metodom.

Etiološka dijagnostika virusnih bolesti provodi se virusološkim, virusološkim, serološkim i molekularno genetskim metodama. Posljednje tri metode mogu se koristiti kao ekspresne dijagnostičke metode.

Virološka dijagnostička metoda.

Krajnji cilj metode je identificirati viruse prema vrsti ili serološkoj varijanti. Virološka metoda uključuje nekoliko faza:

1) izbor materijala za istraživanje;

2) obrada materijala koji sadrži viruse;

3) kontaminacija osjetljivih živih sustava materijalom;

4) indikacija virusa u živim sustavima;

5) titracija izoliranih virusa;

6) identifikacija virusa u imunološkim reakcijama.

1. Odabir materijala za istraživanje .

Provodi se u ranim fazama bolesti, uz pridržavanje pravila koja sprječavaju kontaminaciju materijala stranom mikroflorom i infekciju medicinskog osoblja. Kako bi se spriječila inaktivacija virusa tijekom transporta, materijal se stavlja u virusni transportni medij (VTS) koji se sastoji od uravnotežene otopine soli, antibiotika i serumskog albumina. Materijal se transportira u posebnom spremniku s toplinskom izolacijom i zatvorenim plastičnim vrećicama s ledom. Po potrebi materijal se skladišti na -20˚C. Svaki uzorak materijala za istraživanje treba biti označen i označen imenom bolesnika, vrstom materijala, datumom uzorkovanja, detaljnom kliničkom dijagnozom i drugim podacima.

Ovisno o prirodi bolesti, materijal za studiju može biti:

1) brisevi iz nosnog dijela ždrijela i bris iz ždrijela;

2) cerebrospinalna tekućina;

3) feces i rektalni brisevi;

6) tekućina iz seroznih šupljina;

7) bris sa konjunktive;

8) sadržaj vezikula;

8) sekcijski materijal.

Za ispiranje orofarinksa koristi se 15-20 ml VTS. Pacijent pažljivo ispire VTS grlo 1 minutu i skuplja ispiranje u sterilnu bočicu.

Bris sa stražnje strane ždrijela uzima se sterilnom vatom, pritišćući lopaticom na korijen jezika. Bris se stavi u 2-3 ml VTS, ispere i iscijedi.

Cerebrospinalna tekućina se dobiva lumbalnom punkcijom. 1-2 ml cerebrospinalne tekućine stavlja se u sterilnu posudu i dostavlja u laboratorij.

Uzorci izmeta uzimaju se unutar 2-3 dana u sterilne bočice. Iz dobivenog materijala pomoću Hankove otopine priprema se 10% suspenzija. Suspenzija se centrifugira na 3000 okretaja u minuti, supernatant se prikupi, u njega se dodaju antibiotici i stavi u sterilnu posudu.

Krv dobivena venepunkcijom u volumenu od 5-10 ml defibrinira se dodatkom heparina. Puna krv se ne zamrzava i ne dodaju se antibiotici. Za dobivanje seruma uzorci krvi se inkubiraju na 37°C 60 minuta.

Tekućina iz seroznih šupljina dobiva se punkcijom u količini od 1-2 ml. Tekućina se koristi odmah ili se čuva zamrznuta.

Bris s konjunktive uzima se sterilnim tupferom i stavlja u VTS, nakon čega se materijal centrifugira i zamrzava.

Sadržaj vezikula se aspirira štrcaljkom s tankom iglom i stavlja u VTS. Materijal se šalje u laboratorij u obliku osušenih razmaza na stakalcima ili u zatvorenim sterilnim kapilarama ili ampulama.

Sekcijski materijal uzima se što je ranije moguće, poštujući pravila asepse. Za prikupljanje svakog uzorka koriste se zasebni setovi sterilnih instrumenata. Količina odabranih tkiva je 1-3 g, koja se stavljaju u sterilne bočice. Prvo se uzimaju uzorci ekstrakavitarnih organa (mozak, limfni čvorovi itd.). Tkiva prsne šupljine uzimaju se prije otvaranja trbušne šupljine. Dobiveni uzorci tkiva usitnjavaju se u tarioniku uz dodatak sterilnog pijeska i sterilne otopine natrijevog klorida, nakon čega se materijal centrifugira. Supernatant se skuplja u bočice, dodaju se antibiotici. Materijal za virusološka istraživanja koristi se odmah ili se čuva na -20°C.

2. Obrada materijala koji sadrži viruse.

Provodi se kako bi se materijal oslobodio popratne bakterijske mikroflore. Za to se koriste fizikalne i kemijske metode.

Fizičke metode:

1) filtracija kroz različite bakterijske filtere;

2) centrifugiranje.

Kemijske metode:

1) obrada materijala eterom u slučajevima izolacije virusa koji nemaju superkapsid;

2) dodavanje mješavine heptana i freona u materijal;

3) uvođenje antibiotika (penicilin - 200-300 U / ml; streptomicin - 200-500 μg / ml; nistatin - 100-1000 U / ml).

3. Infekcija osjetljivih živih sustava materijalom.

1) laboratorijske životinje;

2) pileći embriji;

3) kulture organa;

4) kultura tkiva.

laboratorijske životinje. Koriste se bijeli miševi, zamorci, hrčci, kunići i dr. Bijeli miševi su najosjetljiviji na veliki broj vrsta virusa. Način infekcije životinja određen je tropizmom virusa na tkiva. Infekcija u mozgu koristi se u izolaciji neurotropnih virusa (virusi bjesnoće, poliovirusi itd.). Intranazalna infekcija se provodi kada se izoliraju uzročnici respiratornih infekcija. Naširoko korištene intramuskularne, intravenske, intraperitonealne, supkutane i druge metode infekcije. Bolesne životinje se eutanaziraju eterom, otvaraju i uzima materijal iz organa i tkiva.

pileći embriji. Široko dostupan i jednostavan za korištenje. Nanesite pileće embrije u dobi od 5 do 14 dana. Prije infekcije, pileći embriji se ovoskopiraju: utvrđuje se njihova održivost, na ljusci se označava granica zračne vrećice i mjesto embrija ("tamno oko" embrija). Rad s pilećim embrijima provodi se u sterilnoj kutiji sa sterilnim instrumentima (pincete, šprice, škare, šprice i dr.). Nakon dovršetka dijela rada, instrumenti se uranjaju u 70% etilni alkohol i spaljuju prije sljedeće manipulacije. Prije zaraze, ljuska pilećeg embrija se obriše gorućom alkoholnom vatom i alkoholnom otopinom joda. Volumen ispitivanog materijala ubrizganog u embrij je 0,1-0,2 ml. Za izolaciju virusa iz jednog materijala koriste se najmanje 4 pileća embrija.