Utafiti wa biomaterial kwa mbinu ya IF. Mtihani wa damu wa ELISA - maelezo ya njia, faida na hasara, tafsiri ya matokeo. Dalili za uchambuzi

Hivi sasa, idadi kubwa ya aina anuwai na marekebisho ya ELISA hutumiwa. Lahaja mbalimbali za kipimo cha immunosorbent kilichounganishwa na kimeng'enya (ELISA) zimeenea.

Awamu thabiti ya ELISA ilipendekezwa mnamo 1971. Kanuni za msingi za ELISA ya awamu dhabiti, bila kujali muundo, ni kama ifuatavyo.

• 1. Katika hatua ya 1 ya mmenyuko, antijeni au antibodies hutangazwa kwenye awamu imara. Katika kesi hiyo, reagents zisizofungwa kwa awamu imara huondolewa kwa urahisi kwa kuosha.
• 2. Sampuli ya mtihani imeingizwa kwenye visima vilivyohamasishwa. Visima vya udhibiti vyema vina vitendanishi vya kawaida. Katika kesi hiyo, complexes za kinga zinaundwa juu ya uso wa awamu imara. Vipengele visivyofungwa vinaondolewa kwa kuosha.
• 3. Wakati wa kuongeza conjugate ya antibody-enzyme au antigen-enzyme na kuifunga kwa tata ya kinga isiyoweza kusonga, tovuti ya kazi ya enzyme inabaki inapatikana kwa kuingiliana baadae na substrate. Incubation ya substrate katika visima na conjugate immobilized inaongoza kwa maendeleo ya mmenyuko wa rangi. Mwitikio huu unaweza kusimamishwa katika hatua inayotakiwa, ukali wa uchafu unaweza kupimwa kwa kuibua au kwa wiani wa macho. Hatua muhimu katika tofauti yoyote ya uchambuzi wa awamu imara ni utaratibu wa kuosha reagents zisizofungwa. Ni muhimu sio tu suuza vipengele vilivyowekwa kwenye awamu imara, lakini kuondoa reagents kutoka kwa kina kizima cha safu. Sampuli zinaweza kuosha moja kwa moja na washer au manually na pipette ya multichannel. Ili kufanya ELISA, unahitaji:
  • · kompyuta kibao ya polystyrene au chaguzi nyingine za awamu imara zinazotumika;
  • suluhisho la kuosha;
  • conjugate (antijeni zilizo na enzyme au antibodies);
  • mchanganyiko wa substrates kutumika;
  • suluhisho la kuacha (Acha reagent - suluhisho la kuacha majibu);
  • Sampuli zinazotumiwa kwa udhibiti chanya na/au hasi;
  • antijeni ya kawaida (kwa ajili ya kujenga curve ya calibration);
  • pipettes moja na multichannel;
  • · washer;
  • kifaa cha macho kwa ajili ya kuamua wiani wa macho ya ufumbuzi wa mtihani (ELISA msomaji, msomaji kwamba sequentially photometers visima vyote);
  • · 5-100 µl ya nyenzo za kibaolojia zilizosomwa.

ELISA ya moja kwa moja

1. Antijeni au antibodies (nyenzo za mtihani) hupigwa kwenye visima vya paneli. Mara nyingi katika ELISA ya moja kwa moja, antijeni isiyoweza kusonga kwenye awamu imara ni seli na antijeni nyingine za chembe.

Udhibiti. Kama kidhibiti, visima vilivyo na sampuli chanya ya udhibiti, ambayo lazima iwe na antijeni inayotakikana, na sampuli ya udhibiti hasi, ambayo ni wazi haina antijeni ya majaribio, hutumiwa. Mbele ya antijeni ya kawaida iliyosafishwa, majibu hufanywa kwa dilutions kadhaa ili curve ya calibration iweze kujengwa.

• 2. “Zuia tovuti za kuunganisha zisizolipishwa zilizosalia kwenye awamu dhabiti zilizo na kasini BSA, n.k. (ili kuzuia mseto usio mahususi wa unganisha kwenye awamu dhabiti).
• 3. Kingamwili zilizo na enzyme au antijeni (conjugate) huongezwa kwenye visima na kuingizwa. Kufunga kwa muunganisho kwa awamu dhabiti kutatokea tu ikiwa vipengele vyote viwili vya mfumo vinakamilishana. Baada ya incubation na conjugate, visima huosha, hivyo kuondoa sehemu isiyofungwa ya conjugate.

• 4. Substrate maalum kwa enzyme inayotumiwa huongezwa kwenye visima na kuingizwa. Wakati kiwango bora cha uchafu katika visima vya udhibiti mzuri kinafikiwa, mmenyuko wa enzyme husimamishwa.
• 5. Uhasibu kwa majibu. Kwanza, matokeo ya mmenyuko yanazingatiwa kwa macho. Kwa akaunti sahihi zaidi ya matokeo, kiwango cha upakaji madoa hutathminiwa kwa msomaji wa ELISA kwa kutumia kichujio cha mwanga kinachofaa. Kulingana na matokeo ya uchambuzi, grafu ya utegemezi wa wiani wa macho kwenye mkusanyiko hujengwa. ELISA kunyonya antibody immobilization
• a) kugundua antijeni; b) kugundua antibodies.

ELISA isiyo ya moja kwa moja.

Lahaja hii ya ELISA kwa kawaida hutumiwa kugundua kingamwili maalum. Antijeni ya kawaida huingizwa kwenye visima vya paneli na kuingizwa na sampuli za seramu au nyenzo nyingine za kibiolojia zilizopatikana kutoka kwa mgonjwa (ugiligili wa ubongo, mate, nk). Kingamwili maalum zinazofungamana na antijeni kwenye awamu dhabiti hugunduliwa kwa kutumia kiunganishi cha antiglobulini. Kulingana na madhumuni ya uchambuzi, reagents tofauti za antiglobulini hutumiwa ambazo hutambua antibodies ya isotypes zote, au maalum kwa madarasa ya mtu binafsi na subclasses ya immunoglobulins. Faida kuu ya njia ni umoja wa conjugate. Unganishi sawa inaweza kutumika kugundua kingamwili za binadamu kwa aina mbalimbali za antijeni katika sampuli yoyote. majibu ni methodically rahisi.

Hatua kuu za ELISA isiyo ya moja kwa moja ya kugundua antibodies:

• 1. Antijeni inatangazwa kwenye awamu imara, kisha kuosha kutoka kwa vipengele visivyofungwa.
• 2. Zuia tovuti za kumfunga bila malipo. Imefuliwa.

• 3. Nyenzo ya mtihani huongezwa kwenye visima, kuingizwa na kisha kuosha. Kwa sambamba, sampuli zilizo na udhibiti mzuri na hasi huwekwa.
• 4. Ongeza conjugate ya antiglobulini katika dilution ya kazi, incubate, safisha vipengele visivyofungwa.
• 5. Substrate huletwa, incubated. Baada ya kufikia kiwango bora cha uchafu kwenye visima vya kudhibiti vyema, majibu yanasimamishwa kwa kuongeza suluhisho la kuacha.
• 6. Pima kiasi cha bidhaa ya majibu kwenye msomaji wa ELISA.

Chini ya hali bora za upimaji, mbinu ni maalum sana na nyeti. Inakuwezesha kuchunguza kiasi cha nanogram ya antibodies katika sera ya wagonjwa waliosoma. Ili kupata matokeo ya kuridhisha, viwango vya vitendanishi na mbinu ni muhimu. Lahaja hii ya ELISA inaweza pia kutumika kupima kingamwili za monokloni.

"Sandwich" - tofauti ya ELISA kwa ajili ya kugundua antigens.

Antijeni zinazogunduliwa kwa kutumia lahaja hii ya ELISA lazima ziwe na epitopu kadhaa zenye uwezo wa kufunga kingamwili, au ziwe na epitopu zilizojirudia, zilizotenganishwa kwa anga za umaalum sawa.

Wakati wa kutekeleza lahaja hii ya ELISA, kingamwili mahususi zaidi za aina nyingi au monokloni zilizowekwa kwenye awamu dhabiti huwekwa kwenye sampuli ya majaribio. Baada ya utaratibu wa kuosha, antibodies zilizo na enzyme (conjugate) kwa antijeni sawa huongezwa kwenye visima, na kisha hatua nyingine zote za mmenyuko hufanyika. Ufanisi wa malezi ya tata maalum katika kila hatua ya uchambuzi inategemea mara kwa mara ya kisheria ya mmenyuko wa antijeni-antibody.

Hatua kuu za uchambuzi:

• 1. Kingamwili za monokloni au kingamwili za polyclonal zilizosafishwa kwa mshikamano hazijahamishika kwenye awamu dhabiti.
• 2. Sampuli ya mtihani huletwa ndani ya visima vya paneli, sampuli ya udhibiti mzuri na sampuli ya udhibiti hasi huwekwa kwa sambamba katika dilutions mbalimbali. Incubated na kuosha.
• 3. Antibodies za monoclonal au polyclonal (conjugate) zilizo na enzyme zinaongezwa kwenye visima. Kuosha hufanywa baada ya incubation.
• 4. Substrate huletwa, incubated. Mmenyuko umesimamishwa wakati uchafuzi bora unapatikana katika visima vyema vya kudhibiti.
• 5. Uhasibu kwa matokeo kwenye msomaji wa ELISA.

Faida kuu ya njia ni unyeti wake wa juu, ambao unazidi uwezo wa mipango mingine ya ELISA.

ELISA ya Ushindani.

Chaguo hili la uchanganuzi linatokana na shindano la kingamwili zilizo na lebo (conjugate) na zisizo na lebo (jaribio) za kumfunga antijeni iliyotangazwa kwenye awamu dhabiti. Kiasi cha enzyme iliyounganishwa na awamu imara itapungua kwa uwiano wa maudhui ya antibodies ya bure katika mchanganyiko. Kuamua antijeni, chaguo sawa hutumiwa, lakini katika kesi hii antijeni inayotakiwa inashindana na antijeni iliyoandikwa, ya kawaida ya kuunganisha kwa kingamwili zisizohamishika kwenye uso wa awamu imara.

Njia ya ushindani inahitaji idadi ya chini ya uendeshaji, matumizi ya chini ya reagents, na inaweza kuwa automatiska kwa urahisi. Wakati wa kufanya ELISA ya ushindani kwa ugunduzi wa kingamwili, ni bora kutumia antibodies ya monoclinal iliyoitwa, kisha ushindani wa conjugate na sampuli ya mtihani hutokea kwa epitope moja ya antijeni iliyotangazwa kwenye awamu imara. Lahaja hii ya ELISA hutumiwa kubainisha misombo mbalimbali, kama vile immunoglobulini ya binadamu, antijeni ya kiinitete ya saratani, insulini, n.k. Huruhusu ugunduzi wa kingamwili kwa epitopes muhimu za uchunguzi wa mawakala wa kuambukiza.

Hatua kuu za uchambuzi wa kugundua antijeni:

• 1. Kingamwili za monokloni maalum kwa ajili ya antijeni kugunduliwa zimezuiliwa kwenye awamu dhabiti.
• 2. Ongeza antijeni iliyoandikwa na kimeng'enya na sampuli ya majaribio katika mkusanyiko unaojulikana kwenye visima vya paneli. Fanya incubation na kuosha. Kwa sambamba, udhibiti mzuri na hasi huwekwa kwenye visima vya karibu. Kujenga urekebishaji kwa kutumia antijeni ya kawaida isiyo na lebo katika dilutions mbalimbali.
• 3. Ongeza substrate, incubate, kuacha majibu wakati staining mojawapo yanaendelea katika visima chanya kudhibiti.
• 4. Uhasibu kwa majibu juu ya msomaji wa ELISA.

Katika kesi hii, kiasi cha antijeni katika sampuli ya mtihani ni kinyume chake na shughuli za enzymatic kwenye awamu imara.

kizuizi cha ELISA.

Katika lahaja hii ya ELISA, antijeni iliyopo katika sampuli ya jaribio hufungamana na kingamwili za kimeng'enya zenye lebo ya monokloni na kuzuia mwingiliano wao na antijeni ya kawaida isiyohamishika kwenye awamu dhabiti. Kuwepo katika sampuli ya hata kufuatilia kiasi cha antijeni mahususi kwa konganishi kutazuia ufungaji wa kingamwili zilizo na lebo kwa antijeni isiyohamishika. Kiwango cha kuzuia ni sawa sawa na maudhui ya antijeni katika suluhisho. Kwa uchanganuzi wa kiasi, curve ya calibration hujengwa kwa kutumia dilutions za serial za antijeni ya kawaida. Hatua kuu za kuzuia ELISA kwa kugundua antijeni (Mchoro 6).

• 1. Adsorb antijeni ya kawaida katika visima vya paneli. Chagua dilution ya kufanya kazi ya kingamwili zilizo na alama kwa titration.
• 2. Kiunganishi huwekwa awali kwenye dilution ya kufanya kazi na dilutions ya sampuli ya majaribio, antijeni ya kawaida na sampuli za udhibiti chanya.
• 3. Mchanganyiko huhamishiwa kwenye visima vya paneli. Ili kudhibiti kumfunga kwa 100%, antibodies zilizo na lebo zinaongezwa kwenye visima kadhaa, bila antijeni ya kuzuia. Paneli hizo huingizwa na kisha kuosha.
• 4. Ongeza substrate.
• 5. Rekodi matokeo.

Mkusanyiko wa antijeni utakaobainishwa katika sampuli ya jaribio unawiana kinyume na shughuli ya enzymatic kwenye awamu dhabiti.

ELISA inaweza kutumika sio tu kuamua antijeni ya mumunyifu au antibody, lakini pia seli zinazozalisha protini mbalimbali.

Njia ya immunostain ya enzyme (ELISPOT).

Mnamo 1983, teknolojia ya ELISA ilichukuliwa kwa ajili ya kugundua seli za lymphoid zinazotoa kingamwili au antijeni (kwa mfano, cytokines) katika vitro. Njia hiyo inaitwa ELISPOT (enzymatic immunoassay au doa method). Kanuni kuu ya mbinu:

• 1. Juu ya uso wa kisima cha polystyrene (kwa kutumia paneli za 24 za seli za seli), antijeni au antibodies zinatangazwa, ambazo hutumika kama vitendanishi vya "kunasa".
• 2. Seli za lymphoid zilizojifunza huongezwa, hupandwa kwa saa kadhaa saa 37 ° C, na kuwapa fursa ya kuchukua mahali fulani na kufanya kazi ya siri. Kingamwili au antijeni zinazofichwa na seli kama hizo hunaswa na vitendanishi vilivyowekwa kwenye awamu dhabiti.
• 3. Seli huondolewa kwa kutumia suluhisho la kuosha na sabuni ya seli ya lysing.
• 4. Maeneo ya mkusanyiko wa bidhaa za siri huonyeshwa kwa kuongeza antibodies zinazohusiana na enzyme (antiglobulin reagent).
• 5. Mchanganyiko wa substrate-agarose huongezwa (vipande vidogo vinavyotumiwa lazima viyeyuke katika agarose na kuunda bidhaa za mmenyuko zisizoyeyuka), madoa ya kahawia au bluu huunda juu ya uso wa awamu imara (kulingana na vimeng'enya na substrates kutumika), akifunua maeneo ambapo seli. zilipatikana.
• * Matangazo yanayotokana yanahesabiwa chini ya darubini, hii itakuwa idadi ya seli za siri.

Utando wa nitrocellulose unaweza kutumika kama awamu thabiti. Katika kesi hii, kuna faida kadhaa: kwa sababu ya uwezo wa juu wa utangazaji wa NCM, kiasi kidogo sana cha antijeni kinachotumiwa kama kitendanishi cha "kunasa" kinahitajika, kwa kuongeza. hakuna haja ya kuingiza agarose kwenye substrate.

Kwa wakati huo huo kuamua idadi ya seli za siri na kiasi cha jumla cha antijeni iliyofichwa au antibody kwenye kisima, ambayo inawezekana wakati wa kutumia substrate tofauti, inawezekana kuamua kiasi cha dutu iliyofichwa na seli moja.

Njia hii imepata matumizi mengi ya kutathmini idadi ya seli zinazotoa antijeni iliyokamatwa na kingamwili za adsorbed, hutumiwa kuamua idadi ya seli zinazotoa cytokines (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a) .

Mifumo ya kukuza ishara.

Wakati wa kutumia kingamwili zenye mshikamano wa juu, unyeti wa anuwai za ELISA ni kubwa sana na kinadharia hufanya iwezekanavyo kugundua molekuli moja ya antijeni, lakini kwa mazoezi unyeti huo unazuiliwa na mambo kadhaa: shughuli ya enzyme, nguvu ya ishara, na njia za uhasibu za ishara. . Mifumo ya kukuza ishara hufanya iwezekanavyo kuongeza unyeti wa anuwai anuwai za ELISA. Fikiria baadhi ya mifumo hii:

Kulingana na mwingiliano wa avidin-biotin.

Molekuli za koenzyme ya biotini (m.m. 244 Da) huunganishwa na kingamwili kwa kutumia biotinyl-N-hydroxysuccimide. Molekuli ndogo ya biotini ni rahisi kushikamana na immunoglobulini au protini nyingine bila kukiuka mali yake ya kinga au enzymatic. Enzyme katika kesi hii imefungwa kwa yai nyeupe glycoprotein avidin. Uhusiano wa kisheria wa avidin kwa biotini ni wa juu sana (mara kwa mara ya kutenganisha tata ni 10-15 mol), conjugate ya avidin-enzyme imewekwa kwa uthabiti kwenye tata ya antigen-antibody-biotin. Baada ya kuongeza substrate inayofaa, bidhaa ya majibu imedhamiriwa spectrophotometrically au kwa kiwango cha luminescence.

Molekuli moja ya avidin ina vijisehemu vinne vinavyofanana na ina uwezo wa kuingiliana na molekuli nne za biotini, ambayo inaruhusu kutumika kama molekuli inayounganisha kati ya misombo miwili iliyo na biotini. Katika kesi hii, enzyme pia ni biotinilated, na avidin hufanya kama daraja, kuunganisha molekuli mbili zilizo na mabaki ya biotini. Avidin ya bure huongezwa kwa tata inayotokana ya antijeni-antibody-biotin, ikifuatiwa na kimeng'enya cha biotini. Rekodi majibu.

Protini ya avidin inaweza kuingizwa kwenye molekuli nyingine kwa njia isiyo maalum, kwa hivyo, protini nyingine inayofunga biotini, streptavidin, inayopatikana katika bakteria ya Streptomyces avidinii, inazidi kutumiwa. Streptavidin pia huunda tata yenye nguvu na biotini na inajumuisha subunits nne zinazofanana.

Matumizi ya tata ya avidin-biotin inafanya uwezekano wa kuongeza kwa kiasi kikubwa unyeti wa ELISA, kwani molekuli kadhaa za biotini zinaweza kufungwa kwa molekuli moja ya AT wakati wa awali ya conjugate. Kupata viunganishi (kingamwili na vimeng'enya vilivyo na biotini) ni rahisi sana na huambatana na mabadiliko madogo katika shughuli zao za kinga na enzymatic. Viunganishi vya vimeng'enya vilivyo na biotini vinaweza kutumika kama vitendanishi vya ulimwengu wote.

Matumizi ya athari za chemiluminescent.

Athari za chemiluminescent zinaweza kutumika kupata ishara katika ELISA, huku kuongeza unyeti wa njia na kupunguza muda wa uchambuzi. Horseradish peroxidase hutumiwa sana kama lebo katika ELISA, na athari mbalimbali za chemiluminescent pia zinaweza kutumika kuigundua. Miitikio ya chemiluminescent inategemea uwezo wa luminol kung'aa inapooksidishwa na peroxide ya hidrojeni. Katika uchambuzi wa moja kwa moja, mmenyuko wa enzymatic hutoa peroksidi ya hidrojeni na oxidize luminol; mmenyuko huu huchochewa na peroxidase ya horseradish. Ili kuongeza ishara, misombo mbalimbali hutumiwa, kwa mfano, luciferin, phenols, katika kesi hii, kiwango cha luminescence kinaimarishwa na mara 10-100, katika baadhi ya matukio kwa mara 500 (uchambuzi ulioimarishwa wa chemiluminescent). Ishara ya luminescent ni thabiti sana, kiwango chake hufikia kiwango cha juu katika 30 s (kwa kulinganisha: mmenyuko wa rangi na OPD kama kiashiria hukua kikamilifu katika dakika 30 tu).

Katika uchanganuzi usio wa moja kwa moja na luminol au derivatives yake, kingamwili imeandikwa. Lebo kama hiyo katika hali ya bure ina uwezo wa kuoksidishwa na peroxide ya hidrojeni na kutolewa kwa mwanga. Ikiwa imeunda tata, inapoteza uwezo wake wa oxidize.

Kulingana na mifumo ya kuteleza.

Ili kuongeza unyeti wa ELISA, mifumo ya cascade ya enzyme inaweza kutumika. Katika hali hii, kimeng'enya cha kwanza kinachofunga kingamwili husababisha substrate inayoweza kupunguzwa kwa mfumo wa pili wa kimeng'enya. Mfumo wa pili wa enzyme unaweza kuwa substrate-cyclic au redoxycyclic. Katika kesi hii, phospho-glucoisomerase, aldolase, phosphatase ya alkali inaweza kutumika kama lebo za enzyme. Bidhaa ya mwisho ya majibu imedhamiriwa kwa kuibua au spectrophotometrically.

Mifumo ya kukuza ELISA inafikia unyeti wa juu. Mifumo hiyo ya ELISA hutumiwa kuamua kiwango cha homoni.

Uchunguzi wa immunosorbent unaohusishwa na enzyme (ELISA) unafanywa kwa tathmini ya kina ya kazi za kinga za mwili. Wakati wa utafiti, idadi na mali ya seli za kinga, kuwepo kwa antibodies muhimu ni kuamua. Uchunguzi wa damu wa ELISA unafanywa ili kutambua magonjwa ya kuambukiza, ya hematological, autoimmune, immunodeficiencies ya msingi na ya sekondari. Fikiria kipimo cha damu cha ELISA ni nini, na ni dalili gani zilizopo kwa utafiti huu.

Ni nini

Kipimo cha damu cha ELISA ni njia ya kimaabara inayotambua kingamwili au antijeni katika sampuli ya damu. Utafiti huu hutumiwa kuchunguza kiwango cha immunoglobulins, complexes immunological, homoni.

Dalili za uchambuzi

Kwa uteuzi wa mtihani wa damu wa ELISA, kuna dalili zifuatazo:

• utambuzi wa magonjwa ya zinaa - ureaplasma, mycoplasma, chlamydia, trichomonas, syphilis;
• utambuzi wa magonjwa ya virusi - cytomegalovirus, herpes, hepatitis, virusi vya Epstein-Barr;
• kuamua kiwango cha homoni;
• utambuzi wa magonjwa ya oncological;
• uamuzi wa immunodeficiency;
• kugundua allergy;
• uchunguzi wa kina wa kabla ya upasuaji kabla ya kupandikiza chombo;
• tathmini ya ufanisi wa tiba.

Kanuni ya mbinu

Kanuni ya uendeshaji wa njia ya immunoassay ya enzyme inategemea uamuzi wa protini-antibodies maalum katika damu - immunoglobulins. Immunoglobulins huzalishwa na mfumo wa kinga ya binadamu wakati antigens (microorganisms za kigeni) huingia mwili. Molekuli hizi za kinga hufunga kwa aina mbalimbali za mawakala wa kuambukiza katika mwili na kuzipunguza.

Immunoglobulins ina sifa muhimu - maalum. Kutokana na hili, wanaweza kujifunga kwa antijeni maalum, na kutengeneza tata ya antigen-antibody. Wakati wa mtihani wa damu wa ELISA, ni ngumu hii ambayo imedhamiriwa kwa ubora na kwa kiasi.

Kuna madarasa tano ya immunoglobulins. Lakini kwa kawaida madarasa matatu yanafafanuliwa - immunoglobulins A, M, G. Antibodies hizi hujilimbikiza katika mwili kwa nyakati tofauti kutoka wakati wa maambukizi.

• Immunoglobulins darasa M (IgM) kuonekana kwenye damu kwanza siku ya tano kutoka wakati wa kuambukizwa. Wao ni katika mwili kwa wiki 5-6, kisha kutoweka kutoka kwa damu. Kingamwili za IgM zinaonyesha kipindi cha papo hapo cha ugonjwa au kuzidisha kwa ugonjwa katika kozi yake sugu.
• Takriban wiki 3-4 baada ya kuambukizwa, immunoglobulins huonekana katika damu darasa G (IgG). Wanaweza kuwepo katika damu ya binadamu kwa miezi kadhaa au hata miaka. Kwa mujibu wa uamuzi wa mtihani wa damu wa ELISA, ikiwa katika sampuli mbili za damu zilizochukuliwa mfululizo wiki mbili baadaye, kiasi cha immunoglobulins ya IgG kinaongezeka, wanasema juu ya maambukizi ya sasa au kuambukizwa tena - kuambukizwa tena na maambukizi sawa.
• Immunoglobulins darasa A (IgA) inaweza kugunduliwa kwa njia hii ya utafiti wiki 2-4 baada ya kuambukizwa au kuzidisha kwa ugonjwa wa kuambukiza. Kati ya hizi, 20% tu huzunguka katika damu, wengine hufichwa na utando wa mucous. Kingamwili za IgA hupotea kutoka kwa damu wiki 2-8 baada ya uharibifu wa mawakala wa kuambukiza. Kutoweka kwa immunoglobulins hizi kunamaanisha tiba ya maambukizi. Ikiwa, baada ya mwisho wa ugonjwa huo, uwepo wa antibodies ya IgA katika damu imedhamiriwa, basi ugonjwa huo umepita katika hatua ya muda mrefu.

Maandalizi ya uchambuzi

Damu ya binadamu mara nyingi hutumiwa kufanya mtihani wa damu wa ELISA. Lakini unaweza pia kuchunguza yaliyomo ya mwili wa vitreous, maji ya cerebrospinal, maji ya amniotic.

Sampuli ya damu kwa ajili ya utafiti inachukuliwa kutoka kwa mgonjwa kutoka kwa mshipa wa cubital. Inashauriwa kuchangia damu kwenye tumbo tupu (angalau masaa 12 yanapaswa kupita kutoka wakati wa mlo wa mwisho). Inahitajika kumwambia daktari ikiwa mgonjwa anachukua dawa, kwani baadhi yao wanaweza kubadilisha matokeo ya uchambuzi. Kuegemea kwa matokeo ya utafiti huathiriwa na matumizi ya pombe na madawa ya kulevya.

Usimbuaji

Fomu ya matokeo ya uchambuzi huu inaonyesha matokeo mazuri (+) au hasi (-) kwa kila darasa la immunoglobulins.

Fikiria tafsiri ya decoding iwezekanavyo ya mtihani wa damu wa ELISA.

• Matokeo mabaya ya IgM, IgG, IgA - ukosefu wa kinga ya maambukizi.
• IgM hasi, IgA na matokeo mazuri ya IgG - kinga ya baada ya kuambukizwa au baada ya chanjo.
• IgG hasi au chanya, IgA na IgM chanya ni maambukizi ya papo hapo.
• Matokeo mazuri ya IgM, IgG, IgA ni kuzidisha kwa ugonjwa sugu wa kuambukiza.
• Matokeo mabaya ya IgM na matokeo hasi au chanya ya IgG, IgA ni maambukizi ya muda mrefu.
• Matokeo hasi ya IgM na hakuna IgG, IgA - kupona.

Faida za mbinu

Mtihani wa damu wa ELISA una faida nyingi. Ya kuu yanaweza kutofautishwa:

• usahihi wa juu (unyeti);
• uwezekano wa utambuzi wa mapema;
• uwezo wa kufuatilia mienendo ya mchakato wa kuambukiza;
• kiwango cha juu cha umoja, ambayo inaruhusu tafiti za wingi;
• muda mfupi unaohitajika ili kupata matokeo ya uchambuzi;
• urahisi katika kazi;
• automatisering ya hatua zote za uchambuzi;
• gharama ya chini kiasi.

Mapungufu

Hasara ya njia ya ELISA ni kwamba wakati mwingine inatoa matokeo mabaya ya uongo au uongo. Mbali na makosa ya kiufundi wakati wa utafiti, sababu ya matokeo ya uongo inaweza kuwa sababu ya rheumatoid kwa mgonjwa, kuwepo kwa magonjwa ya muda mrefu (ambayo antibodies huzalishwa), matatizo ya kimetaboliki, na kuchukua dawa fulani.

• ascariasis;
• trichinosis - uchambuzi unafanywa mara kadhaa, kiwango cha juu cha antibodies kinatambuliwa katika wiki 4-12 baada ya kuambukizwa;
• cysticercosis;
• taeniasis;
• fascioliasis - antibodies ni kuamua katika hatua ya papo hapo ya ugonjwa huo;
• opisthorchiasis - kufanya utambuzi tofauti kati ya aina sugu na kali za ugonjwa huo;
• giardiasis;
• leishmaniasis ya visceral na ngozi;
• amoebiasis;
• toxoplasmosis.

4.2 4.20 kati ya 5 (Kura 5)

Orodha ya hatua za kawaida za uchunguzi zinazotumiwa kwa magonjwa ya kuambukiza ni pamoja na uchunguzi wa kinga ya enzyme. Ikiwa ELISA ya kaswende ni chanya, usiogope mara moja.

Wacha tuzingatie kwa undani zaidi sifa za mbinu hii ya utafiti na kanuni za kufafanua matokeo yaliyopatikana katika kategoria tofauti za wagonjwa.

Uchunguzi wa kinga ya enzyme ni mojawapo ya njia za kawaida za kuchunguza magonjwa ya kuambukiza. Ni ya kikundi cha vipimo vya treponemal, yaani, inaweza kutumika kuanzisha uwepo katika mwili wa mgonjwa wa wakala wa causative wa syphilis - treponema ya rangi.

Kwa ELISA, kaswende hugunduliwa kutokana na kugundua antibodies kwa treponema. Zinazomo katika damu ya mgonjwa, na aina na wingi wao hutegemea hatua na aina ya ugonjwa huo, ambayo inakuwezesha kupata taarifa muhimu kuhusu hali ya sasa ya afya ya binadamu.

Faida na hasara

ELISA mara nyingi huwekwa kwa kaswende inayoshukiwa au magonjwa mengine ya kuambukiza. Hii ni kutokana na ukweli kwamba uchambuzi unakuwezesha kutambua aina halisi na hatua ya ugonjwa huo, na uaminifu wake unabakia katika kiwango cha juu - uwezekano wa makosa kulingana na matokeo ya tafiti nyingi ni 1% tu, ELISA ya msingi. ina usahihi wa karibu 90%.

Matumizi ya reagents ya ubora na vifaa vya kisasa hutuwezesha kuongeza usahihi wa viashiria.

Kwa ujumla, faida za njia ni:

1. Usahihi wa juu wa matokeo. Uwezekano wa kupokea data ya uwongo ni mdogo sana.
2. Kupunguza kiwango cha ushawishi wa mwanadamu. Vifaa vya kisasa vya kufanya ELISA havijumuishi ushawishi wa binadamu juu ya matokeo ya utafiti kutokana na automatisering ya mchakato.
3. Kugundua antibodies maalum. Haiwezekani kuchanganya antigens ya aina moja na wengine, hivyo uchambuzi unaonyesha matokeo sahihi kwa uchunguzi maalum.
4. Kurekebisha kupotoka kidogo kutoka kwa kawaida. Hata mkusanyiko mdogo wa mawakala wa patholojia hautapita bila kutambuliwa.

Usisahau kuhusu udhaifu wa njia hii. ELISA ina hasara zifuatazo:

1. Bei ya juu. Gharama kubwa ni kutokana na mambo mengi, hasa, haja ya vifaa vyema, vitendanishi vya ubora wa juu na wataalamu wenye kiwango cha kutosha cha mafunzo.
2. Haja ya utambuzi wa awali. Unahitaji kujua ni antijeni gani za kutafuta, kwani bila data ya ziada haitawezekana kufanya utambuzi sahihi.
3. Uwezekano wa matokeo chanya ya uwongo. Baadhi ya hali za mwili na mambo mengine yanaweza kupotosha data ya mwisho.

Dalili za kutekeleza

Daktari anaweza kuagiza immunoassay ya enzyme kutambua si tu kaswende, lakini pia idadi ya magonjwa mengine ya kuambukiza.

Ikiwa tunazingatia hali hiyo moja kwa moja na maambukizi ya treponema, sababu ya uchunguzi inaweza kuwa:

• kuonekana kwa dalili za nje za ugonjwa huo (chancres, upele wa syphilitic, gummas, nk);
• kupungua kwa kiasi kikubwa kwa kinga;
• kitambulisho au tuhuma za kaswende kwa mwenzi wa ngono, jamaa na wanafamilia;
• mmenyuko mzuri wakati wa vipimo vingine;
• utambuzi wa magonjwa mengine ambayo yanaweza kuhusishwa na kaswende;
• hamu ya kibinafsi ya mtu kuchunguzwa.

Mbinu za kutekeleza

ELISA inaweza kufanywa kwa njia tofauti. Katika kila kesi, chaguo sahihi zaidi huchaguliwa.

Kwanza kabisa, kuna mgawanyiko wa njia katika:

1. Ubora. Uwepo wa maambukizi au virusi katika mwili wa mgonjwa hugunduliwa.
2. Kiasi. Huamua mkusanyiko wa antibodies kwa wakala wa pathogenic katika mwili wa binadamu, ambayo inaonyesha hatua na ukali wa maendeleo ya ugonjwa huo.

Pia kuna uainishaji wa njia za kufanya ELISA kulingana na kanuni ya kuzaliana majibu muhimu.

Kuna chaguzi 3:

1. Moja kwa moja. Kingamwili zilizo na lebo hudungwa kwenye sampuli za damu zilizotolewa.
2. Moja kwa moja na antijeni. Antijeni za adsorbed huwekwa hapo awali kwenye seli za sahani ya polystyrene iliyokusudiwa kwa ELISA. Kisha antibodies ya virusi huongezwa kwao, ambayo husababisha kuundwa kwa magumu ya kinga muhimu kwa tathmini zaidi ya matokeo.
3. Moja kwa moja na antibodies. Kwa magonjwa ya zinaa, njia hii hutumiwa mara nyingi. Inahusisha sorption ya awali ya antibodies, basi tu antijeni huongezwa kwenye sahani.

Sheria za sampuli za nyenzo

Ili kupunguza hatari za kupata matokeo ya uongo, ni muhimu kutoa damu kwa uchambuzi kwa usahihi.

Kabla ya kupata ELISA, vizuizi kadhaa lazima zizingatiwe:

• kuepuka matatizo makubwa ya kimwili na ya kihisia;
• kuacha sigara na kunywa pombe angalau siku 1 hadi 3 mapema;
• kwa siku chache unahitaji kubadili lishe sahihi;
• ni kuhitajika kwa wanawake kudhibiti awamu ya mzunguko wa hedhi, kwani homoni zinaweza kupotosha matokeo;
• chakula cha mwisho kinapaswa kuwa masaa 8-10 kabla ya utoaji wa damu;
• kwa siku 10, dawa ambazo zinaweza kuathiri matokeo ya utafiti hazijumuishwa.

Kwa ELISA, damu ya venous inachukuliwa kutoka kwa mshipa wa cubital, lazima ichukuliwe asubuhi juu ya tumbo tupu. Kwa ujumla, sheria za kawaida za kuandaa sampuli ya damu ya venous hutumika. Kulingana na uwepo wa ugonjwa gani unaojaribiwa, mahitaji ya ziada ya maandalizi ya awali ya mgonjwa yanaweza kuletwa.

Mbinu

Maagizo ya kufanya ELISA ni rahisi sana:

1. Mgonjwa huchukua damu kutoka kwa mshipa.
2. Nyenzo zilizochukuliwa zinatayarishwa na kugawanywa katika sampuli kwenye palette maalum ya faini-mesh.
3. Antijeni huchanganywa na antibodies kulingana na njia iliyochaguliwa.
4. Mwitikio unatathminiwa. Sampuli zinalinganishwa na sampuli za udhibiti, tathmini ya ubora na kiasi cha matokeo hufanyika.
5. Data imeingizwa katika meza maalum na matumizi ya viashiria vya kiasi (jumla ya kingamwili).
6. Daktari anayehudhuria anaamua matokeo. Ikiwa ni lazima, matibabu sahihi yanaagizwa.

Baada ya uchunguzi, mgonjwa hupewa hati na matokeo. Ina fomu ya meza iliyo na majina yanayolingana kinyume na kila aina ya immunoglobulini kwenye makutano na majina ya magonjwa ya kuambukiza.

Usimbuaji

Mtaalam tu ndiye atakayeweza kufafanua kwa usahihi matokeo ya uchambuzi. Ni vigumu kufikiri peke yako, kwa mfano, matokeo ya ELISA k = 1 4 inamaanisha nini. Syphilis inaweza pia kutokea kwa aina tofauti, ambayo pia huathiri data ya mwisho.

Matokeo yanaonyesha aina 3 za immunoglobulins:

1. IgM. Ruhusu kuamua kipindi cha kuambukizwa na syphilis. Matokeo mazuri yanaonyesha kuzidisha kwa ugonjwa huo. Kutokuwepo kwao kunaweza kuonyesha msamaha wa pathologies ya muda mrefu au aina ya latent ya ugonjwa huo.
2. IgA. Inaonyesha ugonjwa ambao umekuwa zaidi ya mwezi mmoja tangu kuambukizwa. Pia ni ishara ya awamu ya papo hapo ya ugonjwa huo, wote na patholojia za kawaida na za juu za muda mrefu.
3. IgG. Ni ishara ya kipindi cha kilele cha ugonjwa huo, yaani, kuzidisha kwake. Kwa syphilis, mmenyuko mzuri huonekana muda baada ya matibabu. Katika aina fulani za magonjwa, inaweza kuwa ishara ya kinga iliyoendelea.

Dutu hizi huzalishwa na mwili kwa mlolongo fulani, ambayo ni ishara ya ziada ya ugonjwa huo. Kwa vipimo vya ubora, uwepo tu wa immunoglobulins katika damu ya kila aina huanzishwa.

Hii inaonyeshwa kwa mabadiliko katika rangi ya nyenzo zinazohusika katika uchambuzi. Viashiria vya kiasi ni msaidizi, vinaelezea kwa usahihi hali hiyo. Uwiano wa antijeni na antibodies unaonyesha ukali wa ugonjwa huo na nguvu ya majibu ya mwili.

Nini cha kufanya

Ikiwa mgonjwa ana syphilis kweli, ELISA chanya hugunduliwa kila wakati, haiwezekani kugundua uwepo wa treponemas katika utafiti kama huo. Usikate tamaa, ugonjwa hujibu vizuri kwa matibabu, hasa katika hatua za awali.

Nini cha kufanya ikiwa matokeo ya mtihani ni chanya:

• kupitia mitihani ya ziada kulingana na dalili za daktari;
• kuchukua kozi ya tiba ya antibiotic kulingana na mpango uliochaguliwa;
• kuzingatia kuimarisha mfumo wa kinga;
• mjulishe mpenzi wako kuhusu ugonjwa huo;
• katika siku zijazo, mara kwa mara hupitia uchunguzi wa kuzuia hadi kufutwa kwa usajili katika zahanati (baada ya miaka 5 kwa kukosekana kwa matokeo mazuri ya mtihani).

Hakuna haja ya kuahirisha likizo ya ugonjwa na kuogopa kutangaza matokeo. Utambuzi huo umefichwa na unabaki kuwa siri, tu ikiwa kuna tishio la kuambukizwa kwa watu wengine, ni muhimu kuwajulisha jamaa na mpenzi wa ngono kuhusu tatizo ili wapate mitihani inayohitajika.

Matokeo chanya ya uwongo na sababu zake

Wakati mwingine matokeo ya vipimo vingine hurekodiwa na ELISA ni chanya ya uwongo ya kaswende. Ndiyo maana inashauriwa kutekeleza njia 2-3 za msaidizi na kurudia immunoassay ya enzyme baada ya muda.

Ukosefu kama huo ni nadra, ni kwa sababu ya sababu kama hizi:

• mimba;
• magonjwa sugu;
• chanjo ya hivi karibuni;
• kuumia.

Matokeo chanya ya uwongo yamegawanywa kuwa ya papo hapo na sugu, kulingana na asili ya sababu iliyowakasirisha.

Ya kuu yanawasilishwa kwenye meza:

Katika uwepo wa shida kama hizo za kiafya, mtihani wa kaswende unaweza kuonyesha matokeo chanya, lakini hii ni matokeo tu ya utengenezaji wa mwili wa proteni kupambana na ugonjwa huo. Walakini, ELISA inazitambua kama antijeni.

Mtoto mwenye afya njema hadi umri wa miaka moja na nusu anaweza kupata matokeo ya uongo ya ELISA ikiwa mwanamke aliambukizwa na kaswende wakati wa ujauzito. Kabla ya umri huu, damu bado haina muda wa kufanya upya kabisa, hivyo antibodies ya mama inaweza kuwepo ndani yake. Isipokuwa ni hali ya kugundua immunoglobulins ya IgM.

Unaweza kujifunza zaidi kuhusu vipengele vya immunoassay ya enzyme na mbinu yake kwa kutazama video katika makala hii.

ELISA au immunoassay ya enzyme ni njia ya kisasa ya kuamua patholojia nyingi, ikiwa ni pamoja na wale wa asili ya kuambukiza. Utafiti huo unafanywa katika maabara. Lengo kuu la mbinu ni kuchunguza antibodies, uwepo wao unaonyesha kupenya kwa mawakala wa pathogenic ndani ya mwili. Dawa ya kisasa hutumia uchambuzi wa ELISA kutambua magonjwa mengi na kutambua misombo ya tatu.

Uchambuzi wa ELISA: wakati na jinsi gani unafanywa

Kutumia njia ya ELISA, wataalam wanaweza kugundua uwepo wa antibodies maalum (immunoglobulins) katika seramu ya damu na kuamua antijeni. Immunoglobulins huzalishwa kama matokeo ya michakato tata ya neva inayofanywa na kazi za kinga za mwili. Wao ni mmenyuko wa asili wa mfumo wa kinga kwa kupenya kwa mawakala wa kigeni. Kingamwili maalum hutolewa kwa kila aina ya pathojeni.

Muhimu: kwa uwepo wa complexes fulani, njia ya immunoassay ya enzyme inakuwezesha kutambua aina ya pathogen katika mwili wa binadamu.

Utambuzi wa ELISA unafanywa kugundua magonjwa yafuatayo:

• malengelenge;
• aina ya virusi ya hepatitis;
• Virusi vya Epstein-Barr (aina ya herpes 4);
• cytomegalovirus.

Mtihani wa damu unaonyesha bakteria kuu ya pathogenic ambayo husababisha maendeleo ya syphilis, ureaplasmosis na trichomoniasis. Kupitia uchambuzi, wataalam huamua antibodies kwa aina 600 za mzio. Kufanya immunoassay ya enzyme ni sahihi katika maandalizi ya kupandikiza chombo.

Muhimu: katika hali nyingine, ELISA ni njia ya ziada ya kuamua oncology katika mwili wa binadamu.

Uchambuzi unafanywa peke katika maabara. Kwa utafiti, damu ya venous inachukuliwa kutoka kwa mshipa wa cubital. Matokeo ya uchambuzi yatapatikana siku inayofuata. Ili kupata habari ya kuaminika, wataalam wanapendekeza kufuata sheria za kuandaa ELISA:

• siku moja kabla ya utafiti, ni muhimu kuachana na matumizi ya vyakula vya spicy na kuvuta sigara;
• pombe ni marufuku;
• damu hutolewa asubuhi juu ya tumbo tupu;
• kabla ya utafiti, ni muhimu kuwatenga matatizo yoyote ya kimwili na ya kihisia;
• inashauriwa kuacha sigara.

Ni patholojia gani zinazogunduliwa na immunoassay ya enzyme

Kutumia immunoassay ya enzyme, mtaalamu huamua madarasa mbalimbali ya immunoglobulins, uwepo ambao unaonyesha maendeleo ya michakato ya pathological katika mwili. Kwa hivyo, viashiria kuu vya ELISA ni IgM na IgG. Uwepo wa immunoglobulin ya IgM unaonyesha maendeleo ya mchakato wa pathological papo hapo. Kiashiria cha IgG katika damu ni kawaida kwa hatua ya kupona.

Kupitia uchambuzi wa ELISA, wataalam hutambua idadi ya magonjwa hatari. Hizi ni pamoja na:

Muhimu: mtihani wa ELISA umewekwa ili kuthibitisha syphilis wakati matokeo mazuri yanapatikana kwa kutoa damu kwa RV.

Uchunguzi wa wakati unakuwezesha kufuatilia ufanisi wa tiba na, ikiwa ni lazima, kurekebisha.

Kuamua uchambuzi: majibu chanya na hasi

Ufafanuzi wa matokeo ya ELISA unafanywa na mtaalamu, kulingana na data iliyopatikana. Jibu linaweza kuwa chanya au hasi.

ELISA chanya

Matokeo yake yanachukuliwa kuwa chanya ikiwa immunoglobulins ya madarasa ya IgG na IgM yaligunduliwa katika damu wakati wa utafiti. Uwepo wa vipengele vilivyowasilishwa unaonyesha maendeleo ya magonjwa yafuatayo:

• kaswende;
• aina ya virusi ya hepatitis;
• CMVI (cytomegalovirus);
• malengelenge;
• tetekuwanga;
• magonjwa yanayosababishwa na staphylococci na streptococci;
• klamidia.

Pamoja na maendeleo ya syphilis, antibodies maalum hupatikana katika damu siku 14 baada ya kuambukizwa. Kulingana na idadi yao, mtaalamu huamua ukali wa kozi ya ugonjwa huo. Tiba hai ya kaswende huondoa bakteria zote baada ya miezi 6. Ikiwa hakuna matibabu, itachukua angalau miaka 1.5 kwa mwili kurejesha kikamilifu.

Uchunguzi wa ELISA hutambua hepatitis ya aina ya virusi hata katika kipindi cha incubation, kabla ya dalili za kwanza kuonekana.

CMVI ni ugonjwa wa kawaida ambao hutokea kwa kila mtu wa tatu. Kwa idadi ya watu, haitoi hatari, maambukizi hutokea tumboni.

Kwa kawaida, hakuna antibodies kwa virusi vya herpes katika mwili wa binadamu. Wanapogunduliwa, ni desturi ya kutambua awamu ya papo hapo ya ugonjwa huo.

Pamoja na maendeleo ya kuku, immunoglobulins maalum ya IgM hupatikana katika damu ya binadamu. Wana uwezo wa kubaki katika mwili kwa miaka 2, baada ya kuondolewa kabisa kwa ugonjwa huo.

Kuamua magonjwa yanayosababishwa na streptococci na staphylococci, mtihani wa mara mbili kwa ELISA inaruhusu. Inapochunguzwa tena, kiwango cha antibodies maalum huongezeka kwa kasi.

Maendeleo ya chlamydia yanaonyeshwa na kiwango cha juu cha immunoglobulin - 1: 8 na hapo juu. Kiashiria kinaweza kutofautiana kulingana na maendeleo ya ugonjwa huo.

Tahadhari: ili kuthibitisha maendeleo ya mchakato fulani wa patholojia, mtaalamu anaelezea maabara ya ziada na masomo ya ala. Utafiti wa kina unakuwezesha kuagiza tiba ya ufanisi ya matibabu.

ELISA hasi

Kwa matokeo mabaya, immunoglobulins maalum ya darasa la IgM haipatikani katika damu ya binadamu. Labda uwepo wa IgG, antibodies zinaweza kubaki katika mwili baada ya magonjwa, aina ya bakteria na virusi. Katika baadhi ya matukio, uwepo wao katika serum ya damu huendelea kwa miongo kadhaa.

Makini: mtaalamu aliye na uzoefu tu ndiye anayeweza kufafanua kwa usahihi matokeo ya uchambuzi.

Uchunguzi wa kujitegemea wa majibu katika hali nyingi husababisha majaribio ya kuchunguza na kuagiza matibabu yasiyo sahihi, bila ushiriki wa daktari. Athari kama hiyo inachukuliwa kuwa bora kwa maendeleo zaidi ya mchakato wa patholojia.