Bakteriológiai, virológiai, szerológiai vizsgálatok indikációinak meghatározása az oki etiológiájának megfejtésében és az eredmények értékelése. Virológiai kutatás Mi a kutatás értelme

Webhelyek archívuma Internetes archívum Wayback Machine A fekete PR-emberek támadása gyakran váratlanul éri Önt. Ebben az esetben először szembesül azzal, hogy alaposan tanulmányoznia kell az ellenséget. Ha egyáltalán feltételezi az események ilyen alakulását (például in

4.9. Biztonsági mentés a Time Machine segítségével

4.9. Biztonsági mentés a Time Machine segítségével A Mac OS X Leopard rendszerrel rendszeresen készíthet biztonsági másolatot számítógépéről a Time Machine alkalmazás segítségével. A megfelelő beállítások után az alkalmazás automatikusan elindul

4.9.2. Készítse el első biztonsági másolatát a Time Machine segítségével

4.9.2. Az első biztonsági másolat létrehozása a Time Machine segítségével Mielőtt elkezdené az első biztonsági másolat készítését, vagy be kell helyeznie egy külső meghajtót, vagy szabad merevlemez-partíciót kell elkülönítenie csak biztonsági mentés céljából.

4.9.4. Időgép használata

4.9.4. A Time Machine használata Miután elvégezte a Time Machine szükséges beállításait és számos biztonsági másolatot készített, elkezdheti keresni és visszaállítani a fájlok korábbi verzióit. Ehhez: 1. Nyisson meg egy Finder ablakot, és válassza ki a visszaállítandó fájlt.2. Ha egy

módszerek a vírusok biológiájának tanulmányozására és azonosítására. A virológiában széles körben alkalmazzák a molekuláris biológiai módszereket, amelyek segítségével sikerült megállapítani a vírusrészecskék molekuláris szerkezetét, a sejtbe való behatolásukat és a vírusok szaporodásának jellemzőit, a vírusnukleinsavak elsődleges szerkezetét. és fehérjéket. A virális nukleinsavak és fehérje aminosavak alkotóelemeinek szekvenciájának meghatározására szolgáló módszerek fejlesztés alatt állnak. Lehetővé válik a nukleinsavak és az általuk kódolt fehérjék funkcióinak a nukleotidszekvenciával való összekapcsolása, valamint a vírusfertőzés patogenezisében fontos szerepet játszó intracelluláris folyamatok okainak feltárása.

A virológiai kutatási módszerek az immunológiai folyamatokon (antigén kölcsönhatása antitestekkel), a vírus biológiai tulajdonságain (hemagglutinációs képesség, hemolízis, enzimaktivitás), a vírus és a gazdasejt kölcsönhatásának sajátosságain is alapulnak. a citopátiás hatás természete, intracelluláris zárványok kialakulása stb.).

A vírusfertőzések diagnosztizálásában, a vírusok tenyésztésében, izolálásában és azonosításában, valamint vakcinakészítmények készítésénél széles körben alkalmazzák a szövet- és sejttenyésztés módszerét. Primer, másodlagos, stabil folyamatos és diploid sejttenyészeteket használnak. Az elsődleges tenyészeteket a szövet proteolitikus enzimekkel (tripszin, kollagenáz) történő diszpergálásával nyerik. A sejtek forrása emberi és állati embriók szövetei és szervei (gyakrabban veséi) lehetnek. A tápközegben lévő sejtszuszpenziót az úgynevezett matracokba, palackokba vagy Petri-csészékbe helyezik, ahol az ér felszínéhez tapadva a sejtek szaporodni kezdenek. Vírusfertőzéshez általában sejt monoréteget használnak. A tápfolyadékot lecsepegtetjük, a vírusszuszpenziót bizonyos hígításokban adagoljuk, majd a sejtekkel való érintkezés után friss, általában szérum nélküli táptalajt adunk hozzá.

A legtöbb primer tenyészetből származó sejtek továbbtenyészthetők, és másodlagos tenyészeteknek nevezik őket. A sejtek további passzázsával a fibroblaszt-szerű sejtek populációja képződik, amely képes a gyors szaporodásra, amelyek többsége megtartja az eredeti kromoszómakészletet. Ezek az úgynevezett diploid sejtek. A sejtek sorozatos tenyésztése során stabil, folyamatos sejttenyészeteket kapunk. A passzálások során heteroploid kromoszómakészlettel rendelkező, gyorsan osztódó homogén sejtek jelennek meg. A stabil sejtvonalak lehetnek egyrétegűek és szuszpenziósak. Az egyrétegű tenyészetek folyamatos réteg formájában nőnek az üvegfelületen, a szuszpenziós kultúrák szuszpenziók formájában nőnek különféle edényekben keverő segítségével. Több mint 400 sejtvonal létezik, amelyek 40 különböző állatfajból (beleértve a főemlősöket, madarakat, hüllőket, kétéltűeket, halakat, rovarokat) és az emberből származnak.

Az egyes szervek és szövetek darabjai (szervtenyészetek) mesterséges tápközegben nevelhetők. Az ilyen típusú tenyészetek megőrzik a szöveti szerkezetet, ami különösen fontos a differenciálatlan szövettenyészetekben nem szaporodó vírusok (például koronavírusok) izolálásához és passzálásához.

A fertőzött sejttenyészetekben a vírusok kimutathatók a sejtmorfológiai változással, a citopátiás hatással, amely lehet specifikus, a zárványok megjelenésével, a sejtben és a tenyészfolyadékban található vírusantigének meghatározásával; a vírusutódok biológiai tulajdonságainak meghatározása tenyészfolyadékban és a vírusok titrálása szövettenyészetben, csibeembriókban vagy érzékeny állatokban; egyedi virális nukleinsavak sejtekben molekuláris hibridizációval vagy nukleinsavcsoportok kimutatásával citokémiai módszerrel, fluoreszcens mikroszkóppal.

A vírusok izolálása fáradságos és hosszadalmas folyamat. Ezt a lakosság körében keringő vírus típusának vagy változatának meghatározására végzik (például az influenza vírus szerovariánsának, a poliovírus vad vagy vakcinatörzsének azonosítására stb.); olyan esetekben, amikor sürgős járványügyi intézkedéseket kell tenni; amikor a vírusok új típusai vagy változatai jelennek meg; ha szükséges, erősítse meg az előzetes diagnózist; vírusok jelzésére a környezeti objektumokban. A vírusok izolálásakor figyelembe veszik az emberi szervezetben való fennmaradásuk lehetőségét, valamint két vagy több vírus által okozott vegyes fertőzés előfordulását. Az egyetlen virionból nyert vírus genetikailag homogén populációját vírusklónnak, a megszerzésének folyamatát pedig klónozásnak nevezzük.

A vírusok izolálására fogékony laboratóriumi állatok fertőzését, csirkeembriókat használnak, de leggyakrabban szövettenyésztést alkalmaznak. A vírus jelenlétét általában specifikus sejtdegeneráció (citopátiás hatás), szimplasztok és syncytia képződése, intracelluláris zárványok kimutatása, valamint immunfluoreszcenciával, hemadszorpcióval, hemagglutinációval (hemagglutináló vírusokban) stb. kimutatott specifikus antigén határozza meg. . Ezeket a tüneteket csak a vírus 2-3 átjutása után lehet észlelni.

Számos vírus, például influenzavírusok izolálására csirkeembriókat, egyes Coxsackie vírusok és számos arbovírus izolálására újszülött egereket használnak. Az izolált vírusok azonosítása szerológiai tesztekkel és egyéb módszerekkel történik.

A vírusokkal végzett munka során meghatározzák a titerüket. A vírusok titrálása általában szövettenyészetben történik, meghatározva a vírustartalmú folyadék legmagasabb hígítását, amelynél szöveti degeneráció következik be, zárványok és vírusspecifikus antigének képződnek. A plakk módszer számos vírus titrálására használható. A plakkok vagy negatív vírustelepek egyrétegű szövettenyészet vírus által elpusztított sejtjeinek gócai agar bevonat alatt. A telepszámlálás lehetővé teszi a vírusok fertőző aktivitásának kvantitatív elemzését azon az alapon, hogy egy fertőző vírusrészecske egy plakkot képez. A plakkokat úgy azonosítják, hogy a tenyészetet létfontosságú színezékekkel, általában semleges vörösre festik; a plakkok nem adszorbeálják a festéket, ezért világos foltokként láthatók a festett élő sejtek hátterében. A vírus titerét a plakkképző egységek számában fejezzük ki 1-ben ml.

A vírusok tisztítását és koncentrálását általában differenciált ultracentrifugálással, majd koncentráció- vagy sűrűséggradiensben végzett centrifugálással végzik. A vírusok tisztítására immunológiai módszereket, ioncserélő kromatográfiát, immunszorbenseket stb.

A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája magában foglalja a kórokozó vagy összetevőinek kimutatását a klinikai anyagokban; vírus izolálása ebből az anyagból; szerodiagnózis. A laboratóriumi diagnosztikai módszer megválasztása minden esetben a betegség természetétől, a betegség időszakától és a laboratórium képességeitől függ. A vírusfertőzések modern diagnosztikája olyan expressz módszerekre épül, amelyek lehetővé teszik, hogy a klinikai anyag felvétele után néhány órával a betegséget követő korai stádiumban választ kapjon, beleértve az elektron- és immunelektron-mikroszkópiát, valamint az immunfluoreszcenciát, a molekuláris hibridizációs módszert. , az IgM osztályba tartozó antitestek kimutatása stb.

A negatívan festett vírusok elektronmikroszkópos vizsgálata lehetővé teszi a vírusok megkülönböztetését és koncentrációjuk meghatározását. Az elektronmikroszkópia alkalmazása a vírusfertőzések diagnosztizálásában azokra az esetekre korlátozódik, amikor a vírusrészecskék koncentrációja a klinikai anyagban kellően magas (10 5 az 1-ben). mlés magasabb). A módszer hátránya, hogy nem tud különbséget tenni az azonos taxonómiai csoportba tartozó vírusok között. Ezt a hátrányt immunelektron-mikroszkóppal küszöböljük ki. A módszer immunkomplexek képződésén alapul, amikor specifikus szérumot adnak a vírusrészecskékhez, miközben a vírusrészecskék egyidejű koncentrációja következik be, ami lehetővé teszi azok azonosítását. A módszert antitestek kimutatására is használják. Az expressz diagnosztika céljából szövetkivonatok, széklet, hólyagokból származó folyadék és orrgarat titkok elektronmikroszkópos vizsgálatát végzik. Az elektronmikroszkópiát széles körben használják a vírus morfogenezisének tanulmányozására, képességeit jelölt antitestek használatával bővítik.

A molekuláris hibridizációs módszer, amely a vírusspecifikus nukleinsavak kimutatásán alapul, lehetővé teszi a gének egyetlen másolatának kimutatását, és érzékenységében nincs párja. A reakció a DNS vagy RNS komplementer szálainak (próbák) hibridizációján és kétszálú struktúrák kialakításán alapul. A legolcsóbb próba a klónozott rekombináns DNS. A szondát radioaktív prekurzorokkal (általában radioaktív foszforral) jelölték. A kolorimetriás reakciók alkalmazása ígéretes. A molekuláris hibridizációnak több változata létezik: ponthibridizáció, blot hibridizáció, szendvics hibridizáció, in situ hibridizáció stb.

Az lgM osztályba tartozó antitestek korábban (a betegség 3-5. napján) jelennek meg, mint a G osztályú antitestek, és néhány hét múlva eltűnnek, így kimutatásuk friss fertőzésre utal. Az IgM osztályba tartozó antitestek kimutatása immunfluoreszcenciával vagy enzim immunoassay-vel történik, anti-μ antiszérum (anti-IgM nehézlánc szérum) felhasználásával.

A virológia szerológiai módszerei a klasszikus immunológiai reakciókon alapulnak (lásd Immunológiai kutatási módszerek) : komplement rögzítési reakciók, hemagglutináció gátlás, biológiai neutralizáció, immundiffúzió, indirekt hemagglutináció, radiális hemolízis, immunfluoreszcencia, enzim immunoassay, radioimmunoassay. Számos reakcióhoz fejlesztettek ki mikromódszereket, és technikáikat folyamatosan fejlesztik. Ezeket a módszereket vírusok azonosítására használják ismert szérumok segítségével, valamint szerodiagnózisra annak érdekében, hogy meghatározzák az antitestek növekedését a második szérumban az elsőhöz képest (az első szérumot a betegség utáni első napokban, a másodikat - azután) 2-3 hét). A diagnosztikai érték nem kevesebb, mint a második szérum antitesteinek négyszeres növekedése. Ha az lgM osztályba tartozó antitestek kimutatása a közelmúltban történt fertőzésre utal, akkor az lgC osztályba tartozó antitestek több évig, sőt esetenként egész életen át fennmaradnak.

A vírusok egyedi antigénjeinek és az ellenük lévő antitesteknek komplex keverékekben történő azonosítására előzetes fehérjetisztítás nélkül immunoblotot alkalmaznak. A módszer kombinálja a poliakrilamid gélelektroforézissel végzett fehérjefrakcionálást a fehérjék ezt követő enzimes immunoassay-vel végzett immunológiai vizsgálatával. A fehérjék szétválasztása csökkenti az antigén kémiai tisztaságára vonatkozó követelményeket, és lehetővé teszi az egyedi antigén-antitest párok azonosítását. Ez a feladat például a HIV-fertőzés szerodiagnózisában releváns, ahol az álpozitív enzim-immunoassay reakciók a sejtantigénekkel szembeni antitestek jelenléte miatt alakulnak ki, amelyek a vírusfehérjék elégtelen tisztítása következtében jelennek meg. Az antitestek azonosítása a betegek szérumában a belső és külső vírusantigénekkel szemben lehetővé teszi a betegség stádiumának meghatározását, a populációk elemzésében pedig a vírusfehérjék variabilitását. A HIV-fertőzésben végzett immunoblot vizsgálatot megerősítő tesztként alkalmazzák az egyes vírusantigének és az azokkal szembeni antitestek kimutatására. A populációk elemzésekor a módszert a vírusfehérjék variabilitásának meghatározására használják. A módszer nagy értéke abban rejlik, hogy lehetőség nyílik a rekombináns DNS technológiával szintetizált antigének elemzésére, méretük és antigéndeterminánsok jelenlétének megállapítására.

20) A virionok fő szerkezeti összetevője (teljes vírusrészecskék) egy nukleokapszid, azaz. a vírusgenomot (DNS vagy RNS) körülvevő fehérjehüvely (kapszid). A legtöbb víruscsalád nukleokapszidját lipoprotein burok veszi körül. Egyes vírusokban (orto-, paramixo-, rabdo-, filo- és retrovírusok) a burok és a nukleokapszid között egy nem glikozilált mátrix fehérje található, amely további merevséget ad a virionoknak. A legtöbb család vírusának van egy buroka, amely fontos szerepet játszik a fertőzőképességben. A virionok akkor szerzik meg a burok külső rétegét, amikor a nukleokapszid bimbózással áthatol a sejtmembránon. A burokfehérjéket a vírus kódolja, a lipideket pedig a sejtmembránból kölcsönzik. A glikoproteinek általában dimerek és trimerek formájában peplomereket (nyúlványokat) képeznek a virionok felszínén (orto-, paramixovírusok, rhabdo-, filo-, korona-, bunya-, aréna-, retrovírusok). A glikozilált fúziós fehérjék peplomerekhez kapcsolódnak, és kulcsszerepet játszanak a vírus sejtbe jutásában. A virionok kapszidjai és burkai egy vagy több típusú fehérje alegység sok kópiájából jönnek létre önszerveződési folyamat eredményeként. A fehérje-fehérje rendszerben a gyenge kémiai kötések miatti kölcsönhatás a szimmetrikus kapszidok egyesüléséhez vezet. A vírusokban a virionok alakjában és méretében mutatkozó különbségek a strukturális fehérje alegységek alakjától, méretétől és számától, valamint a köztük lévő kölcsönhatás természetétől függenek. A kapszid számos morfológiailag expresszált alegységből (kapszomerből) áll, amelyeket szigorúan meghatározott módon, viszonylag egyszerű geometriai elvek szerint állítottak össze virális polipeptidekből. A fehérje alegységei egymással összekapcsolódva kétféle szimmetriájú kapszidokat alkotnak: izometrikus és spirális. A burokkal rendelkező vírusok nukleokapszidjának szerkezete hasonló a burokkal nem rendelkező vírusok nukleokapszidjának szerkezetéhez. A vírusok borítékának felületén morfológiailag kifejezett glikoprotein struktúrákat - peplomereket különböztetnek meg. A szuperkapszid membrán összetétele lipideket (legfeljebb 20-35%) és szénhidrátokat (legfeljebb 7-8%) tartalmaz, amelyek sejt eredetűek. Kétrétegű sejt lipidekből és vírusspecifikus fehérjékből áll, amelyek a lipid biorétegen kívül és belül helyezkednek el. A szuperkapszid héj külső rétegét egy vagy több típusú peplomerek (nyúlványok) képviselik, amelyek egy vagy több glikoprotein molekulából állnak. A burokkal rendelkező vírusok nukleokapszidját gyakran magnak, a virionok nukleinsavat tartalmazó központi részét pedig nukleoidnak nevezik. A kapszomerek (peplomerek) szerkezeti egységekből állnak, amelyek egy vagy több homológ vagy heterológ polipeptidláncból (fehérje alegységekből) épülnek fel. vírusok osztályozása Az izometrikus kapszidok nem gömbök, hanem szabályos poliéderek (ikozaéderek). Lineáris méreteik a szimmetriatengelyek mentén azonosak. Kaspar és Klug (1962) szerint a kapszidokban a kapszomerek ikozaéder szimmetria szerint vannak elrendezve. Az ilyen kapszidok azonos alegységekből állnak, amelyek egy ikozaédert alkotnak. 12 csúcsuk (sarkuk), 30 lapjuk és 20 felületük van egyenlő szárú háromszög formájában. Ennek a szabálynak megfelelően a poliovírus és a ragadós száj- és körömfájás vírusának kapszidját 60 fehérje szerkezeti egység alkotja, amelyek mindegyike négy polipeptid láncból áll. Az ikozaéder optimálisan megoldja azt a problémát, hogy az ismétlődő alegységeket egy szigorú kompakt szerkezetbe csomagolja minimális térfogattal. Csak a szerkezeti alegységek bizonyos konfigurációi alkothatják a vírus ikozaéder felületeit, csúcsait és lapjait. Például az adenovírus szerkezeti alegységei hexagonális kapszomereket (hexonokat) képeznek a felületeken és az arcokon, és ötszögletű kapszomereket (peptonokat) a csúcsokon. Egyes vírusokban mindkét típusú kapszomert ugyanazok a polipeptidek, másokban különböző polipeptidek alkotják. Mivel a különböző vírusok szerkezeti alegységei különböznek egymástól, egyes vírusok hatszögletűbbnek, mások gömb alakúnak tűnnek. A himlővírusok kivételével minden ismert DNS-tartalmú gerinces vírus, valamint számos RNS-tartalmú vírus (7 család) köbös kapszidszimmetria típusú. A reovírusok, ellentétben más gerinces vírusokkal, kettős kapsziddal (külső és belső) rendelkeznek, amelyek mindegyike morfológiai egységekből áll. A spirális típusú szimmetriájú vírusok hengeres fonalas szerkezetűek, genomi RNS-ük spirál alakú és a kapszid belsejében található. Minden spirális szimmetriájú állati vírust lipoprotein burok vesz körül. A spirális nukleokapszidokat a hosszúság, az átmérő, a hélix emelkedése és a kapsomerek száma a hélix fordulatánként jellemzi. Tehát a Sendai vírusban (paramyxovírus) a nukleokapszid egy körülbelül 1 μm hosszú, 20 nm átmérőjű és 5 nm hélix osztású hélix. A kapszid körülbelül 2400 szerkezeti egységből áll, amelyek mindegyike 60 kD molekulatömegű fehérje. A hélix fordulatánként 11-13 alegység található. A spirális nukleokapszid szimmetriájú vírusokban a fehérjemolekulák hélixbe való hajtogatása biztosítja a maximális kölcsönhatást a nukleinsav és a fehérje alegységei között. Az ikozaéderes vírusokban a nukleinsav a virionok belsejében tekercselődik, és kölcsönhatásba lép a kapszid belsejében található egy vagy több polipeptiddel.

Antireceptorok (receptorok) Vírusos- felszíni virionfehérjék, például hemagglutinin, amelyek komplementer módon kötődnek egy fogékony sejt megfelelő receptorához.

21) Immunológiai módszerek a virológiai kutatásban.

A szerológiai tesztek különböző antitest-osztályok kimutatására való képességüket tekintve eltérőek. Az agglutinációs teszt például jó az IgM antitestek kimutatására, de kevésbé érzékeny az IgG antitestek kimutatására. A komplement rögzítési és hemolízis tesztek, amelyekhez komplementre van szükség, nem mutatnak ki nem komplementhez kötődő antitesteket, például IgA antitesteket és IgE antitesteket. A vírussemlegesítési reakcióban csak a virion felszínének patogenitással összefüggő antigéndeterminánsai ellen irányuló antitestek vesznek részt. Érzékenység I. m. és. felülmúl minden más antigének és antitestek vizsgálati módszerét, különösen a radioimmunoassay és az enzim immunoassay teszi lehetővé a fehérje jelenlétének rögzítését nanogrammban, sőt pikogrammban is. Segítségével I. m. és. határozza meg a csoportot és ellenőrizze a vér biztonságát (hepatitis B és HIV fertőzés). Szövetek és testek átültetésénél And. m. lehetővé teszik a szöveti kompatibilitás meghatározását és az inkompatibilitás-elnyomó módszerek tesztelését. Az igazságügyi orvostanban a Castellani-reakciót egy fehérje fajspecifitásának, az agglutinációs reakciót pedig a vércsoport meghatározására használják.

Az immunológiai módszereket széles körben alkalmazzák a fertőző betegségek laboratóriumi diagnosztikájában. A betegség etiológiáját a lábadozó vérszérumában a kórokozó elleni antitestek növekedése alapján is megállapítják a betegség első napjaiban vett mintához képest. Az I. m. és. tanulmányozza a lakosság immunitását a tömeges fertőzésekkel, például az influenzával kapcsolatban, és értékelje a megelőző védőoltások hatékonyságát is.

Mechanizmusuktól és az eredmények beszámolójától függően I. m. és. az agglutináció jelensége alapján reakciókra osztható; a csapadék jelenségén alapuló reakciók; komplementet tartalmazó reakciók; semlegesítési reakció; reakciók kémiai és fizikai módszerekkel.

Az agglutináció jelenségén alapuló reakciók. Az agglutináció a sejtek vagy egyedi részecskék - egy antigén hordozói - ragasztása immunszérum segítségével ehhez az antigénhez.

A megfelelő antibakteriális szérummal végzett bakteriális agglutinációs teszt az egyik legegyszerűbb szerológiai teszt. A vizsgált vérszérum különböző hígításaihoz baktériumszuszpenziót adunk, és egy bizonyos érintkezési idő elteltével t ° 37 ° -on rögzítjük, hogy a vérszérum agglutinációja melyik hígítása a legmagasabb. A baktériumok agglutinációs reakcióját számos fertőző betegség diagnosztizálására használják: brucellózis, tularémia, tífusz és paratífusz, baciláris vérhas és tífusz.

A passzív vagy indirekt hemagglutináció (RPGA, RNGA) reakciója. Vörösvértesteket vagy semleges szintetikus anyagokat (például latex részecskéket) használ, amelyek felületén antigének (bakteriális, vírusos, szöveti) vagy antitestek adszorbeálódnak. Agglutinációjuk akkor következik be, amikor a megfelelő szérumot vagy antigéneket adják hozzá.

A passzív hemagglutinációs reakciót baktériumok (tífusz és paratífusz, vérhas, brucellózis, pestis, kolera stb.), protozoák (malária) és vírusok (influenza, adenovírusfertőzések, vírusos hepatitis B, kanyaró, kullancs által terjesztett betegségek) diagnosztizálására használják. agyvelőgyulladás, krími vérzéses láz stb.), valamint bizonyos hormonok meghatározására, a beteg gyógyszerekkel és hormonokkal szembeni túlérzékenységének azonosítására, például penicillinre és inzulinra.

A hemagglutinációs gátlási teszt (HITA) a vörösvértestek vírusok általi hemagglutinációjának immunszérumának megelőzésének (gátlásának) jelenségén alapul, és vírusellenes antitestek kimutatására és titrálására szolgál. Az influenza, a kanyaró, a rubeola, a mumpsz, a kullancsencephalitis és más vírusfertőzések fő szerodiagnostikai módszereként szolgál, amelyek kórokozói hemagglutináló tulajdonságokkal rendelkeznek. például a kullancs által terjesztett agyvelőgyulladás szerodiagnózisához a beteg szérumának kétszeres hígítását lúgos borát pufferoldatban öntik a panel üregeibe. Ezután egy bizonyos mennyiségű, általában 8 AU (agglutináló egység) kullancsencephalitis antigént adnak hozzá, és 18 órás t ° 4 ° -os expozíció után savas foszfát pufferoldatban elkészített liba eritrociták szuszpenzióját adják hozzá. Ha a páciens vérszérumában a kullancsencephalitis vírus elleni antitestek találhatók, akkor az antigén semlegesíthető, és nem következik be vörösvértest-agglutináció.

A csapadék jelenségén alapuló reakciók. A kicsapódás az antitestek oldható antigénekkel való kölcsönhatása eredményeként következik be. A kicsapási reakció legegyszerűbb példája egy átlátszatlan kicsapódási sáv kialakulása egy kémcsőben az antigén antigénrétegének határán. Széles körben alkalmazzák a különböző típusú kicsapási reakciókat félfolyékony agar- vagy agaróz gélekben (Ouchterlon kettős immundiffúziós módszer, radiális immundiffúziós módszer, immunelektroforézis), amelyek mind kvalitatívak, mind kvantitatívak. Az antigének és az antitestek gélben való szabad diffúziója eredményeként az optimális arány zónájában specifikus komplexek képződnek - kicsapódási sávok, amelyeket vizuálisan vagy festéssel detektálnak. A módszer sajátossága, hogy minden antigén-antitest pár egyedi kicsapódási sávot alkot, és a reakció nem függ más antigének és antitestek jelenlététől a vizsgált rendszerben.

A friss tengerimalac szérumként használt komplementet érintő reakciók a Clq komplement alkomponens, majd más komplement komponensek immunkomplexekhez való kötődési képességén alapulnak.

A komplementkötési reakció (CFR) lehetővé teszi az antigének vagy antitestek titrálását az antigén-antitest komplex komplementkötésének mértéke szerint. Ez a reakció két fázisból áll: az antigén kölcsönhatása a vizsgált vérszérummal (tesztrendszer) és a hemolitikus szérum kölcsönhatása a kos eritrocitákkal (indikátorrendszer). Pozitív reakció esetén a vizsgált rendszerben komplementkötés megy végbe, majd antitest-szenzitizált eritrociták hozzáadásakor hemolízis nem figyelhető meg. A reakciót szifilisz (Wassermann-reakció), vírusos és bakteriális fertőzések szerodiagnózisára használják.

A semlegesítési reakció azon alapul, hogy az antitestek képesek semlegesíteni a makromolekuláris vagy oldható antigének bizonyos specifikus funkcióit, például az enzimaktivitást, a bakteriális toxinokat és a vírusok patogenitását. A toxinok semlegesítési reakciója a biológiai hatás alapján értékelhető, például a tetanusz és botulinum elleni szérumokat titrálják. Az állatoknak beadott toxin és antiszérum keveréke nem okozza az állatok pusztulását. A virológiában a neutralizációs reakció különféle változatait használják. Ha a vírusokat megfelelő antiszérummal keverjük össze, és ezt a keveréket állatoknak vagy sejttenyészeteknek adjuk be, a vírusok patogenitása semlegesíthető, az állatok nem betegszenek meg, a tenyészetek sejtjei pedig nem pusztulnak el.

Reakciók kémiai és fizikai jelölésekkel. Az immunfluoreszcencia fluorokrómmal jelölt antitestek, pontosabban az IgG antitestek immunglobulin frakciójának felhasználásából áll. A fluorokrómmal jelölt antitest antigén-antitest komplexet képez az antigénnel, amely mikroszkóp alatt megfigyelhetővé válik a fluorokróm lumineszcenciáját gerjesztő UV-sugarakban. A közvetlen immunfluoreszcenciás reakciót celluláris antigének tanulmányozására, vírusok kimutatására a fertőzött sejtekben, valamint baktériumok és rickettsia kimutatására használják kenetekben.

Az indirekt immunfluoreszcencia módszerét szélesebb körben alkalmazzák. egy antigén-antitest komplex kimutatásán alapul lumineszcens anti-lgG antitest szérum felhasználásával, és nemcsak az antigének kimutatására, hanem az antitest titrálására is használható.

Az immunenzimes, vagy enzimimmunológiai módszerek enzimekkel, elsősorban torma-peroxidázzal vagy alkalikus foszfatázzal konjugált antitestek alkalmazásán alapulnak. Az immunfluoreszcenciához hasonlóan az enzim-immunoassay-t a sejtekben lévő antigének kimutatására vagy az antigéntartalmú sejteken lévő antitestek titrálására használják.

A radioimmunológiai módszer az antigének vagy antitestek radioizotópos jelölésének használatán alapul. Ez a legérzékenyebb módszer az antigének és antitestek meghatározására, hormonok, gyógyszerek és antibiotikumok meghatározására, bakteriális, vírusos, rickettsiás, protozoon betegségek diagnosztizálására, vérfehérjék, szöveti antigének vizsgálatára.

Az immunoblot vizsgálatot az egyes antigének elleni antitestek kimutatására vagy az ismert szérumokból származó antigének „felismerésére” használják. A módszer 3 lépésből áll: biológiai makromolekulák (például vírus) szétválasztása egyedi fehérjékre poliakrilamid gélelektroforézis segítségével; az elválasztott fehérjéket a gélről szilárd hordozóra (blot) visszük át poliakrilamid géllemez aktivált papírra vagy nitrocellulózra történő felvitelével (elektroblot); a kívánt fehérjék kimutatása a szubsztrátumon direkt vagy indirekt enzim immunoassay segítségével. Diagnosztikai módszerként immunoblotot alkalmaznak HIV-fertőzés esetén. A diagnosztikai érték a vírus külső héjának egyik fehérjével szembeni antitestek kimutatása.

22) Szimmetrikus vírustípusok (köbös, helikális, vegyes). Fehérjék és nukleinsavak kölcsönhatása a vírusgenomok csomagolásában.

A kapszid és a nukleinsav kölcsönhatásától függően a vírusrészecskék többféle szimmetriatípusra oszthatók:

1). Köbös szimmetria típus.

A köbös kapszidok körülbelül 20 háromszög alakú felülettel és 12 csúcsgal rendelkező ikozidák. Gömb alakú képződményre emlékeztető szerkezetet alkotnak, valójában azonban poliéder. Egyes esetekben az ilyen ikozaéder poliéderek csúcsaihoz speciális lipoprotein képződmények, úgynevezett tüskék kapcsolódnak. Ezeknek a tüskéknek a szerepe feltehetően a virionok vagy vírusrészecskék kölcsönhatására korlátozódik a gazdasejtek megfelelő, rájuk érzékeny területeivel. Köbös szimmetriával a vírusos nukleinsav szorosan össze van csomagolva (golyóvá tekerve), és a fehérjemolekulák körülveszik, és poliédert (ikozaédert) alkotnak. Az ikozaéder húsz háromszöglappal rendelkező poliéder, amelynek köbös szimmetriája és megközelítőleg gömb alakú. Az icosahedral vírusok közé tartozik a herpes simplex vírus, a reovírusok stb.

2). Spirális szimmetria típus. A spirális kapszidok valamivel egyszerűbbek. Azok. A kapszidot alkotó kapszomerek lefedik a spirális NK-t, és ezeknek a vírusoknak egy meglehetősen stabil fehérjehéját is képezik. Nagy felbontású elektronmikroszkópok és megfelelő előkészítési módszerek alkalmazásakor pedig spirális struktúrákat láthatunk a vírusokon. A kapszid spirális szimmetriájával a virális nukleinsav helikális (vagy spirális) alakot alkot, belül üreges, és a fehérje alegységei (kapszomerek) szintén spirálisan (tubuláris kapszid) halmozódnak fel. A kapszid spirális szimmetriájú vírusra példa a dohánymozaik vírus, amely rúd alakú, hossza 300 nm, átmérője 15 nm. A vírusrészecske összetétele egy körülbelül 6000 nukleotid méretű RNS-molekulát tartalmaz. A kapszid 2000 azonos fehérje alegységből áll, amelyek egy hélixben vannak elrendezve.

3). Vegyes vagy összetett típusú szimmetria. Általában ez a fajta szimmetria főként a bakteriális vírusok körében található. És klasszikus példák ezek a fágok, az E. coli vagy a mérsékelt égövi fágok. Ezek összetett képződmények, amelyek belső nukleinsav tartalmú fejjel, különféle függelékekkel, faroknyúlvánnyal és különböző bonyolultságú eszközzel rendelkeznek. És az ilyen részecskék minden komponense sajátos funkcióval rendelkezik, amely a vírus és a sejt közötti kölcsönhatás folyamatában valósul meg. Más szóval, a szimmetria összetett típusa a köbös szimmetria kombinációja, a fej egy ikozider poliéder, a rúd alakú képződmények pedig a faroknyúlványok. Bár a bakteriális vírusok között vannak egészen egyszerűen szervezett virionok is, amelyek primitív nukleokapszidok, gömb vagy kocka alakúak. A bakteriális vírusok összetettebbek, mint a növényi és állati vírusok.

24) Fág kölcsönhatása sejttel. Virulens és mérsékelt égövi fágok.

Adszorpció.

A kölcsönhatás a vírusrészecskék sejtfelszínhez való kötődésével kezdődik. A folyamat a sejt felszínén megfelelő receptorok és a vírusrészecske felületén antireceptorok jelenlétében válik lehetővé.

A vírusok sejtreceptorokat használnak, amelyek alapvető anyagok szállítására szolgálnak: tápanyagrészecskék, hormonok, növekedési faktorok stb.

Receptorok: fehérjék, fehérjék és lipidek szénhidrát összetevője, lipidek. Specifikus receptorok határozzák meg a vírusrészecske további sorsát (transzport, szállítás a citoplazma vagy a sejtmag területére). A vírus nem specifikus receptorokhoz kapcsolódhat, és behatolhat a sejtbe is. Ez a folyamat azonban nem okoz fertőzést.

Kezdetben egyszeres kötés jön létre az antireceptor és a receptor között. Ez a kötés törékeny és megszakadhat. Az irreverzibilis adszorpció kialakulásához többértékű kötődés szükséges. A stabil kötődés a receptormolekulák membránban való szabad mozgása miatt következik be. A vírus és a sejt kölcsönhatása során megfigyelhető a lipidek folyékonyságának növekedése, és receptormezők kialakulása a vírus és a sejt közötti kölcsönhatás területén. Számos vírus receptora csak korlátozott számú gazdasejtben lehet jelen. Ez határozza meg a szervezet érzékenységét a vírusra. Így a vírus DNS és RNS képes megfertőzni a gazdasejtek szélesebb körét.

Az antireceptorok egyedi vírusszervecskékben találhatók: kinövési struktúrák a T-bakteriofágokban, rostok az adenovírusokban, tüskék a vírusmembránok felszínén, korona a koronavírusokban.

Behatolás.

2 mechanizmus - receptor endocitózis és membránfúzió.

Receptor endocitózis:

A tápanyagok és szabályozó anyagok sejtbe való bejutásának szokásos mechanizmusa. Speciális területeken fordul elő - ahol speciális, klatrinnal borított gödrök vannak, ott specifikus receptorok találhatók a gödör alján. A gödrök gyors invaginációt és klatrinnal borított vakuolák kialakulását biztosítják (az adszorpció pillanatától legfeljebb 10 perc telik el, egy perc alatt akár 2000 vakuólum is kialakulhat). A vakuolák nagyobb citoplazmatikus vakuolákkal egyesülve receptoroszómákat képeznek (már nem tartalmaznak klatrint), amelyek viszont lizoszómákkal egyesülnek.

Vírus- és sejtmembránok fúziója:

Burkolt vírusokban a fúziót a vírusfehérje és a sejtmembrán lipidjei közötti pontkölcsönhatások közvetítik, ami a vírus lipoprotein burkának a sejtmembránnal való integrációját eredményezi. A burok nélküli vírusokban az egyik felszíni fehérje a sejtmembrán lipideivel is kölcsönhatásba lép, és a belső komponens áthalad a membránon (paramyxovírusoknál az F-protein; ortomixovírusoknál a HA2 hemagglutináló alegység). A felszíni fehérjék konformációját a pH befolyásolja.

Szalag.

Ebben a folyamatban a fertőző aktivitás megszűnik, gyakran megjelenik a nukleázokkal szembeni érzékenység, és kialakul az antitestekkel szembeni rezisztencia. A vetkőzés végterméke egy belső vírusfehérjéhez kötött nukleinsav. A vetkőzés szakasza a fertőzés lehetőségét is korlátozza (a vírusok nem képesek minden sejtben levetkőzni). A vetkőzés a sejt speciális területein történik: a lizoszómákban, a Golgi-apparátusban és a perinukleáris térben.

A vetkőzés egy sor reakció eredményeként megy végbe. Például a pikornavírusokban a levetkőzés közben 156-12S méretű, közbenső szubvirális részecskék képződnek. Az adenovírusokban a citoplazmában és a nukleáris pórusokban, és legalább 3 szakasza van:

A virionoknál nagyobb sűrűségű szubvirális részecskék képződése;

Olyan magok kialakulása, amelyekben 3 vírusfehérje hiányzik;

DNS-fehérje komplex kialakulása, amelyben a DNS kovalensen kapcsolódik egy terminális fehérjéhez.

Virulens és mérsékelt égövi fágok jellemzése.

Ha egy baktériumot fággal fertőznek meg, akkor úgynevezett lítikus fertőzés lép fel, azaz a fertőzés a gazdasejt lízisével ér véget, de ez csak az úgynevezett virulens fágokra jellemző, amelyek kölcsönhatásba lépnek a sejttel. sejthalálhoz és fág utódképzéshez vezet.

Ugyanakkor a fág és a sejt közötti kölcsönhatások szerint a következő szakaszokat különböztetjük meg: a fág keverése a sejttenyészettel (a fertőzés többszöröse 1 fág 10 sejtenként), és a koncentrációnak elég magasnak kell lennie ahhoz, hogy a fágok érintkezhetnek a sejtekkel. Az újbóli fertőzés elkerülése érdekében - legfeljebb 5 perces fertőzés után, amikor a fágok adszorbeálódnak - ezt a sejtkeveréket a fággal hígítjuk. Van egy látens periódus, amely alatt a fágok száma nem növekszik, majd egy nagyon rövid kilépési periódus, amikor a fágrészecskék száma meredeken növekszik, amikor a sejt lizál és a fág utódai felszabadulnak, majd a fágok száma a ugyanazon a szinten, mert nem fordul elő újrafertőződés. A görbe alapján ezek a fázisok különböztethetők meg: a „növekedés” vegetatív periódusa (látens periódus), a kilépési periódus és kiszámítjuk az 1 fertőzött sejtre jutó fághozamot. A látens periódusban a baktériumokban semmi fágrészecskékre emlékeztető nem található, és a látens periódusban az ilyen sejtekből nem lehet izolálni a fertőző elvet. Csak az érett fágrészecskék képesek megfertőzni a baktériumokat. Így a virulens fágok mindig a baktériumok pusztulását okozzák és fertőzést okoznak, ami új vírusrészecskék képződésében derül ki, amelyek képesek megfertőzni a következő és más érzékeny sejteket.

A virulensekkel ellentétben a mérsékelt égövi fágokkal való fertőzés nem vezet bakteriális sejtek líziséhez, hanem a fág és a baktériumsejt speciális együttélési állapotának kialakulása valósul meg. Ez az együttélés abban nyilvánul meg, hogy a fág egy bizonyos kezdete jelen van a baktériumsejtben, anélkül, hogy számára kedvezőtlen feltételek lennének, és generációról generációra megmarad. Az ilyen együttélés bizonyos szakaszaiban a fág aktiválódik a sejtben, és belép a fejlődés litikus ciklusának állapotába, ami sejtlízist és a fág utódainak felszabadulását okozza. Az ilyen fágokat lizogén vagy mérsékelt égövi fágoknak nevezik, a fággal való mérsékelt létállapot pedig lizogén, az ilyen látens fágot tartalmazó baktériumokat pedig lizogén baktériumoknak nevezzük. A lizogén baktériumok elnevezés onnan ered, hogy valamikor olyan tenyészeteket fedeztek fel, amelyekben spontán módon megjelent egy fág, és ezt a bakteriofágot kezdték a tenyészet szennyeződésének tekinteni, azaz bakteriális vírus kerül a tenyészetbe, és az ilyen tenyészeteket lizogénnek nevezték. vagyis lízist generálnak.

A vírusok a baktériumokkal ellentétben csak élő sejtekben szaporodnak. Ebben a vonatkozásban a vírusok tenyésztése történhet kísérleti állat (a csirkeembriót, mint fejlődő szervezetet kísérleti állatoknak nevezik) vagy a testen kívül termesztett élő sejt testének szintjén, pl. sejtkultúra szintjén.

Laboratóriumi állatok használata. A vírusok izolálásának és tenyésztésének egyik módja a laboratóriumi állatok megfertőzése. Olyan vírusok izolálására szolgálnak, amelyek nem okoznak citopátiás változásokat a sejttenyészetekben, és nem szaporodnak csirkeembriókban. A laboratóriumi állatok használata lehetővé teszi a vírusfertőzés természetének a klinikai tünetegyüttes alapján történő azonosítását is. Laboratóriumi állatként leggyakrabban fehér egereket, hörcsögöket, tengerimalacokat és nyulakat használnak, a munka céljától és a vizsgált vírusok típusától függően. A nagyobb állatok közül különféle fajok majmát és néhány más állatot használnak. A madarak közül csirkéket, libákat, kacsákat használnak. Az elmúlt években újszülött állatokat (a vírusokra fogékonyabb), "steril állatokat" (a méhből kivonnak, és steril körülmények között steril levegővel és sterilizált táplálékkal tartanak) és tiszta vonalú, ismert öröklődésű állatokat (beltenyésztett vagy lineáris állatok) gyakrabban használják.

A kísérletbe csak egészséges állatokat vonnak be, lehetőleg egy óvodából és egy tételből. A testhőmérsékletet egyidejűleg mérik, mivel napi ingadozások vannak. A vizsgálati anyagot a vírusok bizonyos szövetekhez való tropizmusának figyelembevételével adjuk be. Tehát a neutrotróp vírusok izolálásához az anyagot az agyba fecskendezik, a pneumotróp vírusok izolálásához - az orron keresztül (könnyű éteres érzéstelenítés alatt).

Laboratóriumi állatoknál a vírus tartalmú anyaggal való fertőzés után fontos, hogy az anyagot időben és megfelelően, aszeptikusan vigyük el további kutatásra. A vírusizolálás eredményei akkor tekinthetők pozitívnak, ha az állaton a megfelelő lappangási idő után fertőzés tünetei jelentkeznek.

A csibeembriók használata. Az embrió szöveteiben, membránjaiban, a tojássárgája zsákjában számos patogén emberi és állati vírus képes elszaporodni. Ebben az esetben fontos a vírusok szelektivitása egy adott szövetre: a himlővírusok jól szaporodnak és felhalmozódnak a chorion-allantois membrán sejtjeiben, a mumpszvírus az amnionban, az influenzavírusok az amnionban és az allantoisban, valamint a veszettség vírus a sárgája zacskóba.

A fejlődő embriókban a vírusok tenyésztése számos előnnyel jár más módszerekkel szemben: a sűrű héj meglehetősen megbízhatóan védi a belső tartalmat a mikrobáktól; csirkeembriók megfertőzésekor nagyobb hozam érhető el vírustartalmú anyagból, mint más tenyésztési módszerekkel; a csirkeembriók fertőzésének módja egyszerű és bármely virológiai laboratórium számára hozzáférhető; az embriók elegendő életképességgel és ellenálló képességgel rendelkeznek a külső tényezők kórokozóival szemben. A csirkeembriók azonban nem mindig mentesek a látens vírusos és bakteriális fertőzésektől. Nehéz megfigyelni az embrióban a vírusfertőzés után fellépő patológiás változások dinamikáját. A fertőzött embriók boncolása gyakran nem tár fel látható elváltozásokat, és hemagglutinációs teszttel és más módszerekkel kimutatja a vírust. A fertőzött embriókban lehetetlen követni az antitest-titer növekedését. A módszer nem alkalmas minden vírusra.

A virológiai vizsgálatokhoz 7-12 napos embriókat használnak, amelyeket baromfitelepről szereznek be. Az embriókat hagyományos termosztátban növesztheti, amelynek alján vízzel párásító tálcák vannak elhelyezve. A termosztát hőmérsékletének 37 ° C-nak, a páratartalomnak 60-65% -nak kell lennie. Válasszunk nagy, tiszta (de mosatlan), megtermékenyített fehér csirkék tojásait, amelyeket legfeljebb 10 napig tárolnak 5-10 °C-on. A megtermékenyített petéket egy csírakorong jelenlétéről ismerik fel, amely ovoszkóppal áttetszővé válik, és úgy néz ki, mint egy sötét folt.

A vírusokkal végzett munka során az embriók fertőzésének különféle módszerei alkalmazhatók, de a legpraktikusabb alkalmazás a vírus felhordása a chorion-allantois membránra, az allantoisba, a magzatüregbe és a tojássárgája zsákba történő bejuttatása.

(10.5. ábra). A módszer megválasztása a vizsgált vírus biológiai tulajdonságaitól függ.

Rizs. 10.5.

A fertőzés előtt az embrió életképességét ovoszkóppal határozzák meg. Az élő embriók mozgékonyak, jól látható a membránok edényeinek pulzálása. Gyertyázáskor egyszerű ceruzával jelöljük meg a héjon a légzsák határait vagy az embrió helyét, amelyet a héjon lévő árnyéka határoz meg.

A csirkeembriókat dobozban, szigorúan aszeptikus körülmények között, forralással sterilizált eszközökkel fertőzik meg.

A chorion-allantois membránon fertőzött 12 napos embriók a legalkalmasabbak. Az allantois üregben történő fertőzéshez 10-11 napos embriókat, a magzatüregben 7-11 napos embriókat, a tojássárgájában 7 napos embriókat használnak.

A fertőzött embriókkal rendelkező tojásokat tompa végükkel állványra helyezzük. A hőmérsékleti rendszer és az inkubációs időszak a beoltott vírus biológiai tulajdonságaitól függ. Az embriók életképességét naponta ellenőrzik ovoszkóp alatt. Nem vizsgálják azokat az embriókat, amelyek a fertőzést követő első napon elpusztultak sérülés miatt.

Az anyag összegyűjtése előtt az embriókat 4 °C-ra hűtjük 18-20 órán keresztül, hogy összehúzzák az ereket és megakadályozzák a vérzést a boncoláskor. Az embriókat az aszepszis szabályainak betartásával a dobozban nyitják ki.

Az allantois folyadékot pipettával szívják fel, a sterilitást cukor- vagy hús-peptonlevesbe oltással ellenőrzik, ellenőrzik a vírus jelenlétét a hemagglutinációs reakcióban, és 4 °C-on fagyasztott állapotban tárolják.

A magzatvíz nyeréséhez először az allantois folyadékot leszívják, majd a magzatvíz membránját csipesszel felfogják, enyhén megemelik, és Pasteur pipettával leszívják a magzatvizet.

A chorion-allantois membrán változásainak tanulmányozásakor ollóval levágják, és az egészet a lyukon keresztül egy Petri-csészébe öntik. A chorion-allantois membrán a héjon belül marad, és csipesszel eltávolítjuk egy sóoldattal ellátott Petri-csészébe. Itt megmossák, kiegyenesítik, és sötét háttér előtt tanulmányozzák a fokális elváltozások természetét.

A magzatvíz membrán megszerzéséhez az embriót tartalmazó magzatvíz zsákot levágják, és kiszabadítják az embrióból, és megvizsgálják a sérüléseket.

A sárgájahártya kinyeréséhez a chorion-allantoist levágjuk, az allantois- és magzatvizet leszívjuk, a magzatot csipesszel eltávolítjuk, köldökzsinórral elválasztjuk, a sárgájazsákot befogjuk és Petri-csészébe helyezzük. A sterilitás ellenőrzése, az elváltozások megléte. A sárgája szükség esetén fecskendővel eltávolítható a sárgájazsák eltávolítása nélkül.

A vírus jelenlétét a fertőzött embrió allantois- és magzatvizében a hemagglutinációs teszt határozza meg. A hemagglutináció-pozitív embriókból származó folyadékokat sterilitási vizsgálat után egyesítjük, és egy kiterjesztett hemagglutinációs tesztben titráljuk.

Kis mennyiségű vírus jelenlétében, vagy ha a vizsgálati anyagban nem lehet kimutatni, egymást követő passzálásokat végeznek csirkeembriókon. Ha az embriókon végzett három egymást követő passzálást követően a vírus nem mutatható ki a vizsgálati anyagban, az eredmény negatívnak minősül.

Sejtkultúrák használata. A sejtek testen kívüli tenyésztéséhez számos feltétel teljesülése szükséges. Ezek egyike a sterilitás szigorú betartása a munkavégzés során, hiszen a felhasznált tápközegek kiváló táptalajt jelentenek a baktériumok és gombák számára is. A szöveti sejtek nagyon érzékenyek a nehézfémek sóira. Ezért kiemelt jelentőséget kell tulajdonítani a sóoldatokat és tápközegeket alkotó különféle összetevők minőségének, valamint a sejttenyészetben használt edények és gumidugók feldolgozási módszereinek.

A cellákkal való sikeres munka egyik előfeltétele a desztillált víz magas minősége (hetente kétszer ellenőrzik). A sejtekkel való munkához bidesztillált vagy ionmentesített vizet használnak. A legjobb lepárlók az üvegből vagy ötvözött acélból készült készülékek: az ilyen berendezésekből nem mosódnak ki a nehézfém-ionok, amelyek mérgezőek a sejtekre. Az ioncserélt vizet speciális berendezésekben nyerik, ahol a vizet megtisztítják a sóktól az anioncserélővel és kationcserélővel ellátott oszlopokon való egymás utáni áthaladása során.

A sejtek tenyésztése során különösen magas követelményeket támasztanak az edények és a dugók elkészítésével és sterilizálásával szemben. Sok esetben a nem megfelelő mosás és sterilizálás az oka annak, hogy a sejtek nem tapadnak az üveghez, vagy a sejt egyrétegű rétege gyorsan degenerálódik.

A testen kívüli sejtek növekedéséhez és szaporodásához fizikai-kémiai tényezők komplex összessége szükséges: bizonyos hőmérséklet, hidrogénionok koncentrációja, szervetlen vegyületek, szénhidrátok, aminosavak, fehérjék, vitaminok, oxigén és szén-dioxid, ezért , a vírusok sejttenyészetekben történő tenyésztéséhez komplex tápközeget használnak. Az összetételüket alkotó komponensek jellege szerint ezek a közegek két csoportra oszthatók.

• 1. Közegek, amelyek sóoldatok (Hanks, Earl stb.) és természetes összetevők (állati és emberi vérszérum, albumin hidrolizátum) keverékei. Ezen összetevők mindegyikének mennyisége a táptalaj különböző formáiban eltérő.
• 2. Sóoldatokból álló szintetikus és félszintetikus táptalajok (Earl, Hanks stb.), aminosavak, vitaminok, koenzimek és nukleotidok hozzáadásával (Eagle media, 199 stb.). Szintetikus tápközegben a sejtek rövid ideig (legfeljebb 7 napig) életképes állapotban létezhetnek. Ezek hosszabb ideig tartó életképes állapotának fenntartása, valamint a sejtek növekedésének és szaporodásának jobb feltételeinek megteremtése érdekében állati vérszérumot (tehén, borjú stb.) adnak a szintetikus táptalajokhoz.

A sejtek testen kívüli tenyésztésének különféle módszerei alkalmazhatók a vírusok izolálására. A primer tripszinnel kezelt és transzplantált sejtvonalak egyrétegű tenyészetei azonban jelenleg a legnagyobb gyakorlati felhasználásban részesültek. Az egyrétegű sejttenyészeteket 1 l, 250 és 100 ml űrtartalmú, lapos falú üvegedényekben-matracokban vagy hagyományos, megfelelő módon kezelt bakteriológiai kémcsövekben neveljük.

Primer tripszinnel kezelt sejttenyészetek alkalmazásakor a módszer lényege a szövetek sejtközi kötéseinek proteolitikus enzimekkel történő lebontása és a sejtek szétválasztása, hogy az üvegfelületen egyrétegű réteg alakuljon ki. Az emberi és állati embriók, a levágott állatok és madarak, valamint az emberből műtét során kinyert szövetek és szervek szolgálhatnak sejtek kinyerésének forrásaként. Használjon normál és rosszindulatú degenerált szöveteket, epiteliális, fibroblaszt típusú és vegyes. A szervezetből kivont sejtek szaporodásának képessége szorosan összefügg a szöveti differenciálódás mértékével. Minél kevésbé differenciált a szövet, annál intenzívebb a sejtjeinek in vitro szaporodási képessége. Ezért az embrionális és daganatos szövetek sejtjeit sokkal könnyebb a testen kívül tenyészteni, mint a felnőtt állatok normál sejtjeit.

A napi tenyészeteket kis nagyítású mikroszkóp alatt nézzük, hogy meghatározzuk növekedésük természetét. Ha a sejtek nem szaporodnak, kereknek, szemcsésnek, sötétnek tűnnek, és leválik az üvegről, akkor az üvegedény rosszul van feldolgozva, vagy a táptalaj összetevői mérgezőek.

Az elsődleges tripszinezett szövetekkel együtt az átültetett sejttenyészeteket széles körben használják vírustenyésztésre; sejtkultúrák, amelyek a testen kívül korlátlanul képesek szaporodni. Leggyakrabban normál és rákos emberi szövetekből származó sejttenyészeteket használnak. Széles körben ismertté vált a méhnyakrákból nyert HeLa sejtvonal, a gégerákból a Hep-2, a szájüregi rákos szövetből a KV. Az ilyen sejttenyészeteket normál állati szövetekből – majom, nyúl és sertés embriójából – is készítik (10.1. táblázat).

Az átültetett sejtek újraoltásához a táptalajt pipettával leszívják és kiöntik. A kialakult vékony sejtréteget tripszin oldattal elpusztítják, és az így felszabaduló sejteket friss tápoldattal egy új edénybe juttatják, ahol ismét sejt monoréteg képződik.

A vírus fertőzött sejttenyészetekben való jelenlétének mutatója lehet:

• a) specifikus sejtdegeneráció kialakulása;
• b) intracelluláris zárványok kimutatása;
• c) specifikus antigén kimutatása immunfluoreszcenciával;
• d) pozitív hemadszorpciós reakció;
• e) pozitív hemagglutinációs reakció;
• e) plakkok kialakulása.

10.1. táblázat

A leggyakrabban használt sejtkultúrák listája

A fertőzött tenyészetekben a specifikus degeneráció kimutatása érdekében a sejteket naponta vizsgáljuk alacsony nagyítású mikroszkóp alatt. Sok vírus a sejtekben szaporodva okozza azok elfajulását, pl. citopatogén hatásúak (CPA) (10.6. ábra).

Rizs. 10.6.

A fertőzött sejttenyészetekben a fejlődés idejét és a citopátiás változások természetét a beoltott vírus tulajdonságai és dózisa, valamint a sejttenyésztés tulajdonságai és körülményei határozzák meg. Egyes vírusok a fertőzést követő első héten (himlő, gyermekbénulás, Coxsackie B stb.) CPP-t okoznak, mások 1-2 hét után. fertőzés után (adenovírusok, parainfluenza vírusok, ECHO stb.).

A vírusok három fő típusú citopátiás elváltozást okoznak: többmagvú óriássejtek és szimplasztok képződése, amelyek sok sejt citoplazmájának fúziójának eredményeként jönnek létre; az intercelluláris kapcsolatok elvesztéséből és a sejtek lekerekítéséből adódó kerek sejtdegeneráció; sejtburjánzási gócok kialakulása, amely több sejtrétegből áll.

Egyes vírusok sejttenyészetekben történő szaporodása során intracelluláris zárványok képződnek az érintett sejtek citoplazmájában vagy sejtmagjában. A zárványok kimutatására szolgáló sejttenyészeteket üveglemezeken kémcsövekben növesztjük, vírussal megfertőzzük, majd bizonyos inkubációs periódusok után a preparátumokat hagyományos festékekkel festve készítjük el.

Egy specifikus antigén kimutatására fertőzött sejttenyészetekben a preparátumokat ugyanúgy készítjük el, mint a zárványok MFA-val történő kimutatását.

A plakkos módszer a vírussal fertőzött sejtek egyrétegű képződésén alapul, degenerált (elhalt) sejtekből álló, elszíneződött területek agar bevonata alatt. Ezek az úgynevezett plakkok víruskolóniák, amelyek általában egyetlen vírusrészecskéből képződnek.

Citopátiás elváltozások, intracelluláris zárványok, plakkképződés, negatív hemadszorpciós és hemagglutinációs reakciók hiányában a vizsgálati anyaggal fertőzött sejttenyészetekben két egymást követő passzálást kell végrehajtani. Ezen változások hiányában a végső passzázsban a vírusizolálás eredménye negatívnak tekinthető.

A következő módszerek használhatók a vírusok kimutatására a fertőző anyagokban.

Mikroszkopikus:

• a) viroszkópia;
• b) intracelluláris zárványok kimutatása.

Immunológiai:

• a) immunelektronmikroszkópia;
• b) immunfluoreszcencia;
• c) hemagglutináció;
• d) hemadszorpció.

A vírusok azonosítása immunológiai módszerekkel történik, beleértve a következő reakciókat:

• a) a hemagglutináció gátlása;
• b) hemadszorpciós késések;
• c) komplementkötés;
• d) semlegesítés;
• e) kicsapás agargélen.

mikroszkópos módszerek. Fénymikroszkóppal csak a 150 nm-nél nagyobb vírusokat lehet kimutatni. A kisebb vírusok felismerése csak elektronmikroszkóppal lehetséges. Fény-, fáziskontraszt- és fluoreszcens mikroszkóppal nagy méretű vírusok kimutatására használhatók.

A vírusfertőzések során a fertőzött sejtekben sajátos zárványok alakulnak ki. Egyes fertőzéseket az érintett sejtek citoplazmájában zárványok képződése kísér (veszettség, himlőoltás), mások - a citoplazmában és a sejtmagban (kanyaró, természetes és bárányhimlő, adenovírusos betegségek). A zárványok természete, szerkezete, alakja és mérete eltérő, 0,25 és 25 mikron között. A mai adatok szerint egyes fertőzéseknél a zárványok a vírusszaporodás színhelyei, és sejtanyagokkal körülvett felhalmozódásait jelentik, míg másokban a sejtdegeneráció termékei.

A zárványok kimutathatók a szervek és szövetek festett lenyomataiban, sejtkaparékban, az érintett szövet szövettani metszeteiben és a vírussal fertőzött sejttenyészet-készítményekben. A színezés gyakran Romanovsky-Giemsa módszer szerint történik. Az ezzel a módszerrel történő festéshez a készítményeket Dubosque - Brazil - Bouin keverékben rögzítik, amely pikrinsavból, formalinból, alkoholból és ecetsavból áll. A legtöbb vírusfertőzésben az intracelluláris zárványok oxifilek, és a Romanovsky-Giemsa módszer szerint rózsaszínre vagy lilára festenek.

Immunológiai módszerek a vírusfertőzések diagnosztizálására. Az elmúlt években ezek a módszerek vezető szerepet töltenek be a vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikájában. Ennek nagyrészt gazdasági okai vannak, mivel a klasszikus virológiai elemzési módszerek meglehetősen drágák. Ráadásul a virológiai módszerekkel végzett vizsgálatok időtartama (hetek), még ha elég hatékonyak is, visszamenőlegessé teszik azokat.

Immunológiai módszereket alkalmaznak mind a vírusantigének kimutatására különböző bioszubsztrátumokban és környezeti objektumokban, mind a szerodiagnosztikában - a vírusantigénekkel szembeni antitestek kimutatására beteg emberek és laboratóriumi állatok vérszérumában. Emellett az immunológiai kutatási módszerek nélkülözhetetlenek a virionok azonosításához.

A testtel kölcsönhatásba lépve a vírusok antitestek képződését idézik elő, amelyek a virionokon adszorbeálva megakadályozzák a virionok behatolását a sejtekbe és a citopatikus hatás (CPE) kialakulását; semlegesíti a vírusok halálos hatását szaporodásuk során csirkeembriókban és állatokban; inaktiválja a virion hemagglutinineket és a neuraminidázt, megakadályozva a hemagglutinációs reakciót (RGA) és a hemadszorpciós reakciót (RGads) a vírus által érintett sejteken. Ezek a vírussemlegesítő antitestek a vírusrészecskék agglutinációját és kicsapódását is okozzák, és az így létrejövő immunkomplexek komplementet kötnek. Ezért a virionok azonosítására a sejtkultúrákon, csirkeembriókon és állatokon a klasszikus neutralizációs reakciót (PH) és annak módosításait alkalmazzák: a hemagglutinációs gátlási reakciót (HITA); hemadszorpció-gátló reakció (RTGads). Ugyanezeket a reakciókat alkalmazzák a vírusfertőzések szerodiagnózisában a vírussemlegesítő antitestek kimutatására a betegek szérumában egy ismert vírusantigén (diagnosticum) alapján.

Immunelektronmikroszkópos módszer (IEM). Az elektronmikroszkópia jelenleg fontos szerepet játszik a vírusok tanulmányozásában. Az elektronmikroszkópos adatok képezik a vírusok modern osztályozásának alapját.

A vírusok elektronmikroszkópos vizsgálatának fejlődésének új állomása az immunelektronmikroszkópos technikák alkalmazása. Ezzel a módszerrel nemcsak a vírusok közvetlen kimutatása, hanem azok azonosítása, valamint a vírustörzsek gyors szerotipizálása és az ellenük termelődő antitestek titrálása is lehetővé vált. Az IEM nagy jelentőséget kapott a vírusantigének lokalizációjának meghatározásában a makroorganizmus sejtjeiben.

Az IEM kétségtelen előnye a nagy érzékenység a hagyományos elektronmikroszkópos módszerekkel összehasonlítva.

Amikor egy vírusantigén vagy víruskomponens érintkezésbe kerül egy homológ antiszérummal, antitest-antigén komplex képződik. Ez a jelenség a vírusantigének vagy az ellenük lévő antitestek kimutatására és azonosítására használt technika alapja. Ezek az antigének komplexei az antitestekkel a negatív festés után, amelyek elektronmikroszkóppal figyelhetők meg. A klinikai diagnosztikában az antigénanyag nem igényel alapos tisztítást. Tehát, ha influenzavírust észlelnek, a tisztítatlan allantois folyadék megvizsgálható. Jelenleg úgy gondolják, hogy szinte bármilyen klinikai anyag alkalmas IEM-re. Diagnosztikai célokra közönséges frakcionálatlan szérumok, valamint lábadozók szérumai használhatók. Megjegyzendő, hogy az antigén és az antitestek mennyiségének aránya nagyban befolyásolja a végeredményt. Az antigén feleslegével a részecskék bősége figyelhető meg; agglomerátum ebben az esetben kevés lesz. Az antitestek feleslegével a vírusrészecskéket vastag rétegük veszi körül, a virion apró szerkezeti részleteit szinte lehetetlen feltárni; aggregátumok is kevés. Az antigén és az antitestek optimális aránya esetén az aggregátumok megnagyobbodnak, és jó képet kapnak a virionok részleteiről. A fenti megfontolások alapján kívánatos az immunszérum használata többféle hígításban.

A tartórácsra palládiumból készült tartófóliát helyeznek fel. Alacsony koncentrációjú palládium használatakor és az aljzat adszorpciós tulajdonságainak javítása érdekében szénnel megerősítik. Ehhez vákuumban szenet permeteznek a kész száraz film-szubsztrátumra egy elektronmikroszkópos rácson. A film-szubsztrát vastagsága és az erősítő szénréteg jelentősen befolyásolja az objektum finom részleteinek kontrasztját és képét. Minden kutató egyedileg határozza meg a szubsztrátum filmek és a szénréteg fajlagos vastagságát, annak alapján, hogy a szén elektronikusan átlátszóbb, mint a palládium.

A vírusok és az ellenük lévő antitestek alacsony elektronsűrűséggel rendelkeznek. Ezért a biológiai tárgyak elektronmikroszkóppal előkezelés nélkül nem mutathatók ki. A vírusok megjelenítése negatív kontrasztos (vagy negatív festési) technikával történik. A vírusok és vírus-antitest komplexek negatív festésére nehézfémek különféle sóit használják. A kontrasztanyagok (nehézfém atomok) behatolnak a tárgyak hidrofil területeibe, és helyettesítik bennük a vizet. Ennek eredményeként az objektum elektronsűrűsége megnő, és lehetővé válik az elektronmikroszkópos megfigyelés.

A közvetlen IEM módszer a gyakorlatban a legnagyobb alkalmazást találta. A vírusszuszpenziót hígítatlan antiszérummal keverjük össze. Erőteljes keverés után az elegyet 1 órán át inkubáljuk

37°C-on, majd egy éjszakán át 4°C-on. Másnap a keveréket centrifugálják, hogy kicsapják az immunkomplexeket. A csapadékot egy csepp desztillált vízben újraszuszpendáljuk és negatív kontrasztnak vetjük alá.

Az IEM eredményeinek értékelésekor az antigén és az antitest közötti kölcsönhatás termékei elektronmikroszkópban eltérő megjelenésűek lehetnek (egyetlen vírusrészecske, amelyet egészben vagy részben antitestek borítanak; vírusrészecskék agglomerátumai). Az agglomerátumok eltérő területet foglalhatnak el, eltérő megjelenésűek és különböző számú részecskét tartalmazhatnak. Ezért a kísérletiekkel együtt szükséges a kontrollkészítmények (pufferoldattal vagy heterológ antiszérummal) vizsgálata is.

Az IEM alkalmazásával kapott eredmények értékelésének kritériuma az immunszérum által aggregált vírusrészecskék klasztereinek megléte vagy hiánya a készítményekben. Az antigén agglomerátumok és a specifikus antiszérum antitestek jelenléte a pozitív reakció jele. Mindazonáltal figyelembe kell venni az antigénrészecskék nem specifikus aggregációjának lehetőségét a nagy sebességű centrifugálás hatására. Emiatt sok szerző azt javasolja, hogy az eredményeket 0-tól 4+-ig terjedő feltételes skálán vegyék figyelembe. Az aggregált részecskék szérumantitestekkel való borítottságának értékelésén alapul.

A hemagglutináció és a hemadszorpció módszerei. Számos vírus képes agglutinálni a szigorúan meghatározott emlős- és madárfajok eritrocitáit. Így az influenza- és mumpszvírusok agglutinálják a csirkék, tengerimalacok és emberek vörösvértesteit; kullancs-encephalitis vírus - birka vörösvértestek; Japán encephalitis vírusok - egynapos csirkék és libák vörösvértestei; adenovírusok - patkányok, egerek, majmok eritrocitái. Allantois és magzatvíz, csirkeembriók chorion-allantois membránjainak szuszpenziója, szuszpenziók és vírusokkal fertőzött állatok sejt- vagy szervtenyészeteiből származó kivonatok használhatók vizsgálati anyagként a hemagglutinációs reakcióban (HA). A hemagglutinációs reakciót csepegtető módszerrel lehet beállítani üvegen és kiterjesztett sorban kémcsövekben vagy polisztirol lemez lyukaiban. Az első módszer tájékoztató jellegű.

Mivel csoportspecifikus, az RGA nem teszi lehetővé a vírusfajták meghatározását. Ezeket a hemagglutinációs gátlási teszt (HITA) segítségével azonosítják. Formulációjához ismert immun vírusellenes szérumokat használnak. Minden hígításhoz azonos mennyiségű vírust tartalmazó folyadékot adunk. A védekezés a vírus felfüggesztése.

A keveréket termosztátban tartjuk, majd vörösvértest-szuszpenziót adunk hozzá. Néhány perccel később meghatározzuk a semlegesítő szérum titerét, azaz. maximális hígítása, ami késleltette az eritrocita agglutinációt.

A vírusos betegségek szerológiai diagnosztikájában az RTGA-t páros szérummal javasolt elvégezni, amelyek közül az egyiket a betegség kezdetén, a másikat 1-2 hét vagy több hét elteltével nyerik. Az antitesttiter négyszeres növekedése a második szérumban megerősíti a javasolt diagnózist.

A hemadszorpciós reakciót (RGads) arra használják, hogy fertőzött sejttenyészetekben hemagglutináló aktivitással rendelkező vírust jelezzenek. A reakció lényege abban rejlik, hogy a vírusok hemagglutináló hatására érzékeny eritrociták adszorbeálódnak a vírussal fertőzött sejtek felszínén. Például csirke eritrociták adszorbeálódnak a variola vírussal fertőzött sejteken; kanyaró vírus - majmok eritrocitái; adenovírusok - majmok és patkányok stb.

Semlegesítési reakció (PH). A sejttenyészetekben szaporodva a vírusok különböző típusú CPD-t okoznak, amely lekerekítésben, ráncosodásban, a sejtméret csökkenésében vagy éppen ellenkezőleg, a sejtméret növekedésében, fúziójában és szimplasztok képződésében, a citoplazma és a sejtmag elpusztításában nyilvánul meg. Végül egy vírussal fertőzött sejtrétegben a sejtréteg egyes szakaszainak elpusztítása következtében „steril foltok” vagy plakkok jelenhetnek meg, amelyek a vírusrészecske klónjai, ami lehetővé teszi, hogy ne csak a vírus izolálása, hanem annak titerének meghatározása is.

A plakkok természetéből adódóan nagyon nehéz azonosítani a vírust, ezért az izolált vírus pH-értékének beállításához folyamodnak ismert vírussemlegesítő szérumokkal. Ebből a célból a betegtől kapott vírust sejttenyészetben halmozzák fel, és különböző hígításait hígítatlan vírusellenes szérummal keverik össze.

Vírusok és szérumok keveréke megfertőzheti a csibeembriókat vagy az érzékeny állatokat. Ilyen esetekben az antitestek közömbösítő aktivitását leggyakrabban az embriófolyadékban lévő vírusos hemagglutininek semlegesítése, valamint a vírus embriókra és állatokra kifejtett halálos hatásának megszüntetése határozza meg. Ezzel egyidejűleg kiszámítják a neutralizációs indexet, amely kifejezi a szérum által semlegesített vírus halálos dózisainak maximális számát, összehasonlítva a kontrollkísérlet eredményeivel, egynek véve.

Hasonlóképpen, a PH használatával a betegek anyagából izolált vírusokat azonosítják, amikor csirkeembriókat és állatokat fertőznek meg. Ehhez vírustartalmú embriófolyadékot és az állatok érintett szerveinek szuszpenzióit adják a vírussemlegesítő szérumokhoz. Egy bizonyos inkubációs idő után a sejttenyészeteket, a csibeembriókat és az állatokat keverékekkel fertőzik meg.

A vírusfertőzések szerodiagnózisában meghatározzák egy ismert vírus vírussemlegesítő antitestek titerének növekedésének dinamikáját. Ugyanakkor a PH-t a betegektől a betegség kezdetén és végén vett páros szérumokkal állítják be. A diagnosztika az immunglobulinok titerének 4-szeres növekedése lesz a másodikban.

A PH a specifikus antitestek azon képességén alapul, hogy elég erősen kötődjenek egy vírusrészecskéhez. A vírus és az antitest közötti kölcsönhatás eredményeként a vírus fertőző aktivitása semlegesül a vírusrészecskének az érzékeny sejtekkel való kapcsolatáért felelős antigéndeterminánsok blokkolása miatt. Ennek eredményeként a vírus in vitro vagy in vivo elveszíti szaporodási képességét egy érzékeny biológiai rendszerben.

A PH eredményei azt követően válnak nyilvánvalóvá, hogy a vírus és homológ antitesteinek keveréke időzített expozíciót követően egy érzékeny biológiai rendszerbe (szövetsejttenyészet, csibeembrió, fogékony állati test) kerül, ahol a vírus szaporodhat és mérhető mennyiséget okozhat. olyan változások, amelyek részben vagy teljesen elnyomják az antitestek jelenlétét.

A PH-nak három összetevője van:

• 1) vírus;
• 2) antitesteket tartalmazó szérum;
• 3) biológiai objektum (laboratóriumi állatok, fejlődő csirkeembriók, szövettenyészetek), amelynek kiválasztása attól függ, hogy milyen vírussal kíván kutatást végezni.

A PH-t vagy izolált kórokozó azonosítására, vagy antitestek kimutatására és titrálására használják a szérumokban. Az első esetben speciálisan immunizált laboratóriumi állatok vagy gyógyult emberek szérumát használják fel. A második esetben a betegség kezdeti szakaszában és a lábadozási időszakban vett szérumokat használjuk.

A felépült emberek szérumában a vírussemlegesítő antitestek – az antihemagglutininekkel vagy a komplementkötő antitestekkel ellentétben – hosszú évekig fennmaradnak, egyes vírusfertőzésekben (például kanyaró) pedig akár életen át is fennmaradnak. Ez bizonyos esetekben lehetővé teszi számos lábadozó szérumkészletének referencia gyógyszerként való felhasználását, amely ampullákba töltés és liofilizálás után hosszú ideig alkalmas diagnosztikai munkára.

Az izolált kórokozók azonosításakor különféle állatok előre elkészített hiperimmun szérumait használják: nyulak, fehér patkányok és egerek, tengerimalacok, majmok, juhok, lovak stb. A hiperimmun szérumok PH aktivitása az állatok immunizálásának módjától függ.

Minden egyes semlegesítési kísérlet elvégzése előtt a vírust előtitrálják, meghatározva a végső hígítást, amely szövettenyészet-károsodást vagy laboratóriumi állatok (vagy csirkeembriók) fertőzését okozza. A vírustitert 50%-os dózisban fejezzük ki (TCID50 - 50%-os fertőző dózis szövettenyészetnél).

Molekuláris genetikai diagnosztikai módszerek a virológiai gyakorlatban. A molekuláris biológia módszereit az 50-es években fejlesztették ki. XX század. Ez annak köszönhető, hogy minden vírus genomjában egyedi, fajspecifikus nukleotidszekvenciák találhatók, amelyek kimutatásával bármely fertőző ágens azonosítható. Ezek a módszerek a legfontosabbak a hosszú távú vagy hagyományos módszerekkel nehezen tenyészthető mikroorganizmusok azonosításában. Az 1970-es években a DNS-próba-detektálást egy fertőző ágens vagy mutáció kimutatására használták, amely radioaktív izotóppal (vagy fluorokrómmal) jelölt specifikus oligonukleotid próbák izolált DNS-mintával történő hibridizálásán alapult. A hibridizációs elemzés a nukleinsavak azon képességét használja fel, hogy bizonyos körülmények között specifikus komplexeket képezzenek azokkal komplementer szekvenciákkal rendelkező nukleinsavakkal. A fertőző kórokozók DNS-hibridizációval történő kimutatásának módszere rendkívül munkaigényes, időigényes és költségesnek bizonyult. Ezenkívül érzékenysége nem elegendő a mikroorganizmusok azonosításához olyan klinikai anyagokban, mint a széklet és a vizelet.

A DNS-hibridizációt egy olyan módszer váltotta fel, amely utánozza a DNS természetes replikációját, és lehetővé teszi egy bizonyos DNS-fragmens detektálását és ismételt másolását termofil DNS-polimeráz segítségével. A polimeráz láncreakció (PCR) egy elegáns technika, amely utánozza a természetes DNS-replikációt, és lehetővé teszi egy adott DNS-darab detektálását és ismételt másolását termofil DNS-polimeráz segítségével.

Magas diagnosztikai tulajdonságainak köszönhetően a PCR általánosan elismert kiegészítője a virológiában alkalmazott hagyományos módszereknek: vírusszaporítás sejttenyészetben, vírusantigének immunológiai kimutatása és elektronmikroszkópia. Jelentős előnye ennek a módszernek, hogy képes kimutatni a vírusokat látens fertőzésekben (citomegalovírus, herpesz vírus) és a nehezen vagy még nem tenyészthető vírusokat (humán immunhiány vírus, Epstein-Barr vírus, humán papillomavírus, Vidr hepatitis vírus). A PCR-módszerrel olyan betegségek tanulmányozásának kilátásai vannak, mint a Creutzfeldt-Jakob-kór, az Alzheimer-kór és a sclerosis multiplex.

A vírusos betegségek etiológiai diagnózisát virológiai, virológiai, szerológiai és molekuláris genetikai módszerekkel végzik. Az utolsó három módszer expressz diagnosztikai módszerként használható.

Virológiai diagnosztikai módszer.

A módszer végső célja a vírusok azonosítása egy fajhoz vagy szerológiai változathoz. A virológiai módszer több szakaszból áll:

1) kutatási anyagok kiválasztása;

2) vírustartalmú anyagok feldolgozása;

3) érzékeny élő rendszerek anyaggal való szennyeződése;

4) vírusok kimutatása élő rendszerekben;

5) izolált vírusok titrálása;

6) vírusok azonosítása az immunreakciókban.

1. A kutatás anyagának kiválasztása .

Ezt a betegség korai szakaszában végzik, figyelemmel azokra a szabályokra, amelyek megakadályozzák az anyag idegen mikroflórával való szennyeződését és az egészségügyi személyzet fertőzését. A vírus szállítás közbeni inaktivációjának megelőzése érdekében az anyagot vírusszállító közegbe (VTS) helyezik, amely kiegyensúlyozott sóoldatból, antibiotikumokból és szérumalbuminból áll. Az anyagot egy speciális, hőszigetelt konténerben szállítják, és jeget tartalmazó zárt műanyag zacskókban. Ha szükséges, az anyagot -20°C-on tároljuk. Minden kutatási anyagmintát fel kell címkézni és fel kell tüntetni a beteg nevével, az anyag típusával, a mintavétel dátumával, a részletes klinikai diagnózissal és egyéb információkkal.

A betegség természetétől függően a vizsgálat anyaga lehet:

1) tampont a garat orrrészéből és egy tampont a garatból;

2) cerebrospinális folyadék;

3) széklet és végbéltamponok;

6) savós üregekből származó folyadék;

7) kenet a kötőhártyáról;

8) a hólyagok tartalma;

8) metszetanyag.

Az oropharynx kiöblítéséhez 15-20 ml VTS-t kell használni. A páciens gondosan öblíti a VTS torkát 1 percig, és az öblítést egy steril injekciós üvegbe gyűjti.

A garat hátsó részéről egy steril vattacsomóval kenetet veszünk, spatulával a nyelv gyökerét megnyomva. A tampont 2-3 ml VTS-be helyezzük, leöblítjük és kinyomkodjuk.

A cerebrospinális folyadékot lumbálpunkcióval nyerik. 1-2 ml liquort steril edénybe helyezünk, és a laboratóriumba szállítjuk.

A székletmintákat 2-3 napon belül steril fiolákban veszik. A kapott anyagból Hank-oldattal 10%-os szuszpenziót készítünk. A szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót összegyűjtjük, antibiotikumot adunk hozzá és steril edénybe helyezzük.

Az 5-10 ml térfogatú vénapunkcióval nyert vért heparin hozzáadásával defibrináljuk. A teljes vér nem fagy le, és nem adnak hozzá antibiotikumot. A szérum előállításához a vérmintákat 37 °C-on 60 percig inkubáljuk.

A savós üregekből származó folyadékot szúrással nyerik 1-2 ml mennyiségben. A folyadékot azonnal felhasználják vagy fagyasztva tárolják.

A kötőhártyáról steril tamponnal kenetet veszünk, és a VTS-be helyezzük, majd az anyagot centrifugáljuk és lefagyasztjuk.

A vezikulumok tartalmát vékony tűvel ellátott fecskendővel szívják fel és helyezik a VTS-be. Az anyagot üveglemezeken szárított kenet formájában vagy lezárt steril kapillárisokban vagy ampullákban küldik a laboratóriumba.

A metszetanyag felvétele a lehető legkorábban, az aszepszis szabályainak betartásával történik. Minden egyes minta begyűjtéséhez külön steril műszerkészletet használnak. A kiválasztott szövetek mennyisége 1-3 g, amelyeket steril fiolákba helyezünk. Először az extracavitáris szervekből (agy, nyirokcsomók stb.) vesznek mintát. A mellüreg szöveteit a hasüreg kinyitása előtt veszik. A kapott szövetmintákat mozsárban őröljük steril homok és steril nátrium-klorid oldat hozzáadásával, majd az anyagot centrifugáljuk. A felülúszót fiolákba gyűjtjük, és antibiotikumokat adunk hozzá. A virológiai kutatáshoz szükséges anyagokat azonnal felhasználják vagy -20°C-on tárolják.

2. Vírustartalmú anyagok feldolgozása.

Ezt azért végzik, hogy az anyagot megszabadítsák a kísérő bakteriális mikroflórától. Ehhez fizikai és kémiai módszereket alkalmaznak.

Fizikai módszerek:

1) szűrés különböző baktériumszűrőkön;

2) centrifugálás.

Kémiai módszerek:

1) az anyag éterrel történő kezelése olyan vírusok izolálása esetén, amelyek nem tartalmaznak szuperkapszidot;

2) heptán és freon keverékének hozzáadása az anyaghoz;

3) antibiotikumok bevezetése (penicillin - 200-300 U / ml; sztreptomicin - 200-500 μg / ml; nystatin - 100-1000 U / ml).

3. Érzékeny élőrendszerek anyaggal való fertőzése.

1) laboratóriumi állatok;

2) csirkeembriók;

3) szervkultúrák;

4) szövettenyésztés.

laboratóriumi állatok. Fehér egereket, tengerimalacokat, hörcsögöket, nyulakat stb. használnak. A fehér egerek a legérzékenyebbek számos vírustípusra. Az állatok fertőzésének módját a vírus szövetekre gyakorolt ​​tropizmusa határozza meg. Az agyi fertőzést neurotróp vírusok (veszettségvírusok, poliovírusok stb.) izolálására használják. Az intranazális fertőzés akkor történik, ha a légúti fertőzések kórokozóit izolálják. Széles körben alkalmazott intramuszkuláris, intravénás, intraperitoneális, szubkután és egyéb fertőzési módszerek. A beteg állatokat éterrel elaltatják, felnyitják, és anyagot vesznek a szervekből és szövetekből.

csirkeembriók. Széles körben elérhető és könnyen használható. 5-14 napos csirkeembriókat alkalmazzon. A fertőzés előtt a csirkeembriókat ovoszkóppal vizsgálják: meghatározzák életképességüket, a héjon megjelölik a légzsák határát és az embrió helyét (az embrió „sötét szeme”). A csirkeembriókkal végzett munka steril dobozban történik steril eszközökkel (csipesz, fecskendő, olló, lándzsa stb.). A munka egy töredékének befejezése után a műszereket 70% -os etil-alkoholba merítik, és a következő manipuláció előtt elégetik. A fertőzés előtt a csirkeembrió héját égő alkoholos törlőkendővel és alkoholos jódoldattal töröljük le. Az embrióba injektált vizsgálati anyag térfogata 0,1-0,2 ml. Legalább 4 csibeembriót használnak a vírusok egy anyagból történő izolálására.