Bakterioloogiliste, viroloogiliste, seroloogiliste uuringute näidustuste määramine oki etioloogia dešifreerimisel ja tulemuste hindamine. Viroloogilised uuringud Mis on uurimistöö mõte

Saitide arhiiv Internet Archive Wayback Machine Väga sageli tuleb mustanahaliste PR-inimeste rünnak teile ootamatult. Sel juhul seisate esimest korda silmitsi vajadusega vaenlast tähelepanelikult uurida. Kui te isegi eeldasite sündmuste sellist arengut (näiteks aastal

4.9. Varundamine Time Machine'iga

4.9. Varundamine rakendusega Time Machine Mac OS X Leopard võimaldab teil regulaarselt oma arvutit varundada, kasutades rakendust Time Machine. Pärast sobivaid seadistusi käivitub rakendus automaatselt

4.9.2. Looge Time Machine abil oma esimene varukoopia

4.9.2. Looge Time Machine abil esimene varukoopia Enne esimese varukoopia loomise alustamist peate kas sisestama välise draivi või jätma vaba kõvaketta partitsiooni ainult varundamiseks.

4.9.4. Ajamasina kasutamine

4.9.4. Time Machine'i kasutamine Kui olete teinud vajalikud Time Machine'i sätted ja loonud hulga varukoopiaid, võite alustada failide varasemate versioonide otsimist ja taastamist. Selleks: 1. Ava Finderi aken ja vali fail, mida pead taastama.2. Kui a

meetodid viiruste bioloogia uurimiseks ja nende tuvastamiseks. Viroloogias kasutatakse laialdaselt molekulaarbioloogia meetodeid, mille abil oli võimalik kindlaks teha viiruseosakeste molekulaarstruktuur, kuidas need rakku tungivad ja viiruste paljunemise tunnused, viiruse nukleiinhapete esmane struktuur. ja valgud. Arendatakse meetodeid viiruse nukleiinhapete ja valkude aminohapete koostisosade järjestuse määramiseks. Võimalik on siduda nukleiinhapete ja nende poolt kodeeritud valkude funktsioone nukleotiidjärjestusega ning selgitada välja rakusiseste protsesside põhjused, mis mängivad olulist rolli viirusnakkuse patogeneesis.

Viroloogilised uurimismeetodid põhinevad ka immunoloogilistel protsessidel (antigeeni interaktsioon antikehadega), viiruse bioloogilistel omadustel (hemaglutinatsioonivõime, hemolüüs, ensümaatiline aktiivsus), viiruse ja peremeesraku interaktsiooni tunnustel ( tsütopaatilise toime olemus, intratsellulaarsete inklusioonide moodustumine jne).

Viirusnakkuste diagnoosimisel, viiruste kasvatamisel, isoleerimisel ja identifitseerimisel, samuti vaktsiinipreparaatide valmistamisel kasutatakse laialdaselt koe- ja rakukultuuri meetodit. Kasutatakse primaarseid, sekundaarseid, stabiilseid pidevaid ja diploidseid rakukultuure. Primaarsed kultuurid saadakse kudede dispergeerimisel proteolüütiliste ensüümidega (trüpsiin, kollagenaas). Rakkude allikaks võivad olla inimese ja looma embrüote koed ja elundid (sagedamini neerud). Rakkude suspensioon toitekeskkonnas asetatakse nn madratsitesse, pudelitesse või Petri tassidesse, kus pärast anuma pinnale kinnitumist hakkavad rakud paljunema. Viirusnakkuse korral kasutatakse tavaliselt raku monokihti. Toitevedelik kurnatakse, viirussuspensioon sisestatakse teatud lahjendustes ja pärast kokkupuudet rakkudega lisatakse värske toitainekeskkond, tavaliselt ilma seerumita.

Enamiku primaarsete kultuuride rakke saab subkultuurida ja neid nimetatakse sekundaarseteks kultuurideks. Rakkude edasise passaažiga moodustub kiireks paljunemiseks võimeline fibroblastitaoliste rakkude populatsioon, millest enamik säilitab algse kromosoomikomplekti. Need on niinimetatud diploidsed rakud. Rakkude seeriaviljelusel saadakse stabiilsed pidevad rakukultuurid. Passaažide käigus ilmuvad kiiresti jagunevad homogeensed rakud heteroploidse kromosoomikomplektiga. Stabiilsed rakuliinid võivad olla ühekihilised ja suspensioonid. Ühekihilised kultuurid kasvavad pideva kihina klaasi pinnal, suspensioonkultuurid kasvavad suspensioonidena erinevates anumates segistite abil. Seal on üle 400 rakuliini, mis pärinevad 40 erinevast loomaliigist (sh primaadid, linnud, roomajad, kahepaiksed, kalad, putukad) ja inimestelt.

Üksikute elundite ja kudede tükke (elundikultuure) saab kasvatada kunstlikus toitekeskkonnas. Seda tüüpi kultuurid säilitavad koe struktuuri, mis on eriti oluline nende viiruste isoleerimiseks ja läbipääsuks, mis ei paljune diferentseerumata koekultuurides (näiteks koroonaviirused).

Nakatunud rakukultuurides saab viirusi tuvastada raku morfoloogia muutuse, tsütopaatilise toime, mis võib olla spetsiifiline, inklusioonide ilmnemise, viiruse antigeenide määramise järgi rakus ja kultuurivedelikus; viiruse järglaste bioloogiliste omaduste kindlakstegemine kultuurivedelikus ja viiruste tiitrimine koekultuuris, tibude embrüote või tundlike loomade puhul; tuvastades rakkudes üksikuid viiruslikke nukleiinhappeid molekulaarse hübridisatsiooni või nukleiinhapete klastrite abil tsütokeemilise meetodiga, kasutades fluorestsentsmikroskoopiat.

Viiruste eraldamine on töömahukas ja pikk protsess. Seda tehakse elanikkonna seas ringleva viiruse tüübi või variandi väljaselgitamiseks (näiteks gripiviiruse serovariandi, poliomüeliidi viiruse metsik- või vaktsiinitüve tuvastamiseks jne); juhtudel, kui on vaja võtta kiireloomulisi epidemioloogilisi meetmeid; kui ilmnevad uued viiruste tüübid või variandid; vajadusel kinnitage esialgne diagnoos; viiruste näitamiseks keskkonnaobjektides. Viiruste isoleerimisel võetakse arvesse nende püsimise võimalust inimkehas, samuti kahe või enama viiruse põhjustatud seganakkuse esinemist. Ühest virionist saadud viiruse geneetiliselt homogeenset populatsiooni nimetatakse viiruse klooniks ja selle saamise protsessi nimetatakse kloonimiseks.

Viiruste isoleerimiseks kasutatakse vastuvõtlike laboriloomade nakatumist, kana embrüoid, kuid kõige sagedamini kasutatakse koekultuuri. Viiruse olemasolu määrab tavaliselt spetsiifiline raku degeneratsioon (tsütopaatiline toime), sümplastide ja süntsütia moodustumine, intratsellulaarsete inklusioonide tuvastamine, samuti spetsiifiline antigeen, mis tuvastatakse immunofluorestsentsi, hemadsorptsiooni, hemaglutinatsiooni (hemaglutineerivates viirustes) jne abil. . Neid märke saab tuvastada alles pärast 2-3 viiruse läbimist.

Mitmete viiruste, nagu gripiviirused, isoleerimiseks kasutatakse kana embrüoid, mõnede Coxsackie viiruste ja mitmete arboviiruste isoleerimiseks kasutatakse vastsündinud hiiri. Isoleeritud viiruste tuvastamine toimub seroloogiliste testide ja muude meetodite abil.

Viirustega töötamisel määratakse nende tiiter. Viiruste tiitrimine toimub tavaliselt koekultuuris, määrates viirust sisaldava vedeliku kõrgeima lahjenduse, mille korral toimub kudede degeneratsioon, moodustuvad kandmised ja viirusspetsiifilised antigeenid. Naastude meetodit saab kasutada mitmete viiruste tiitrimiseks. Naastud ehk negatiivsed viiruste kolooniad on agarkatte all oleva ühekihilise koekultuuri viiruse poolt hävitatud rakkude kolded. Kolooniate loendamine võimaldab kvantitatiivselt analüüsida viiruste nakkuslikku aktiivsust selle põhjal, et üks nakkav viirusosake moodustab ühe naastu. Naastud tuvastatakse, värvides kultuuri elutähtsate värvainetega, tavaliselt neutraalse punasega; naastud ei adsorbeeri värvainet ja on seetõttu nähtavad heledate laikudena määrdunud elusrakkude taustal. Viiruse tiitrit väljendatakse naastude moodustavate ühikute arvuna 1-s ml.

Viiruste puhastamine ja kontsentreerimine viiakse tavaliselt läbi diferentsiaalse ultratsentrifuugimisega, millele järgneb tsentrifuugimine kontsentratsiooni- või tihedusgradientides. Viiruste puhastamiseks kasutatakse immunoloogilisi meetodeid, ioonvahetuskromatograafiat, immunosorbente jne.

Viirusnakkuste laboratoorne diagnostika hõlmab patogeeni või selle komponentide tuvastamist kliinilises materjalis; viiruse isoleerimine sellest materjalist; serodiagnoos. Laboratoorse diagnostika meetodi valik sõltub igal üksikjuhul haiguse iseloomust, haiguse perioodist ja labori võimalustest. Viirusnakkuste kaasaegne diagnostika põhineb ekspressmeetoditel, mis võimaldavad saada vastuse mõne tunni jooksul pärast kliinilise materjali võtmist haiguse varajases staadiumis, sealhulgas elektron- ja immuunelektronmikroskoopia, aga ka immunofluorestsents ehk molekulaarse hübridisatsiooni meetod. , IgM klassi antikehade tuvastamine jne.

Negatiivselt värvunud viiruste elektronmikroskoopia võimaldab viiruseid eristada ja nende kontsentratsiooni määrata. Elektronmikroskoopia kasutamine viirusnakkuste diagnoosimisel on piiratud juhtudel, kui viirusosakeste kontsentratsioon kliinilises materjalis on piisavalt kõrge (10 5:1). ml ja kõrgem). Meetodi puuduseks on võimetus teha vahet samasse taksonoomilisse rühma kuuluvate viiruste vahel. See puudus kõrvaldatakse immuunelektronmikroskoopia abil. Meetod põhineb immuunkomplekside moodustamisel, kui viirusosakestele lisatakse spetsiifilist seerumit, samal ajal toimub viirusosakeste samaaegne kontsentratsioon, mis võimaldab neid tuvastada. Meetodit kasutatakse ka antikehade tuvastamiseks. Ekspressdiagnostika eesmärgil viiakse läbi koeekstraktide, väljaheidete, vesiikulite vedeliku ja ninaneelu saladuste elektronmikroskoopiline uurimine. Viiruse morfogeneesi uurimiseks kasutatakse laialdaselt elektronmikroskoopiat, selle võimalusi laiendatakse märgistatud antikehade kasutamisega.

Molekulaarse hübridisatsiooni meetod, mis põhineb viirusspetsiifiliste nukleiinhapete tuvastamisel, võimaldab tuvastada geenide üksikuid koopiaid ja sellele pole tundlikkuse poolest võrdset. Reaktsioon põhineb DNA või RNA komplementaarsete ahelate (sondide) hübridisatsioonil ja kaheahelaliste struktuuride moodustumisel. Odavaim sond on kloonitud rekombinantne DNA. Sond on märgistatud radioaktiivsete lähteainetega (tavaliselt radioaktiivse fosforiga). Kolorimeetriliste reaktsioonide kasutamine on paljutõotav. Molekulaarsel hübridisatsioonil on mitu varianti: punkthübridisatsioon, blothübridisatsioon, sandwich-hübridisatsioon, in situ hübridisatsioon jne.

LgM-klassi antikehad tekivad varem kui G-klassi antikehad (3-5. haiguspäeval) ja kaovad mõne nädala pärast, seega viitab nende avastamine hiljutisele infektsioonile. IgM klassi antikehad tuvastatakse immunofluorestsentsi või ensüümi immuunanalüüsi abil, kasutades anti-μ antiseerumit (anti-IgM raske ahela seerumid).

Seroloogilised meetodid viroloogias põhinevad klassikalistel immunoloogilistel reaktsioonidel (vt Immunoloogilised uurimismeetodid) : komplemendi sidumise reaktsioonid, hemaglutinatsiooni inhibeerimine, bioloogiline neutraliseerimine, immunodifusioon, kaudne hemaglutinatsioon, radiaalne hemolüüs, immunofluorestsents, ensüümi immunoanalüüs, radioimmunoanalüüs. Paljude reaktsioonide jaoks on välja töötatud mikromeetodid ja nende tehnikaid täiustatakse pidevalt. Neid meetodeid kasutatakse viiruste tuvastamiseks teadaolevate seerumite komplekti abil ja serodiagnostikaks, et määrata antikehade suurenemine teises seerumis võrreldes esimesega (esimene seerum võetakse esimestel päevadel pärast haigust, teine ​​- pärast haigust). 2-3 nädalat). Diagnostiline väärtus ei ole väiksem kui neljakordne antikehade suurenemine teises seerumis. Kui lgM klassi antikehade tuvastamine viitab hiljutisele infektsioonile, siis lgC klassi antikehad püsivad mitu aastat ja mõnikord kogu elu.

Viiruste individuaalsete antigeenide ja nende vastaste antikehade tuvastamiseks keerulistes segudes ilma eelneva valgu puhastamiseta kasutatakse immunoblotimist. Meetod ühendab valkude fraktsioneerimise, kasutades polüakrüülamiidgeelelektroforeesi ja sellele järgnevat valkude immuunanalüüsi ensüümi immuunanalüüsiga. Valkude eraldamine vähendab nõudeid antigeeni keemilisele puhtusele ja võimaldab tuvastada üksikuid antigeen-antikeha paare. See ülesanne on asjakohane näiteks HIV-nakkuse serodiagnostikas, kus ensüümi immuunanalüüsi valepositiivsed reaktsioonid on tingitud rakuantigeenide vastaste antikehade olemasolust, mis on tekkinud viirusvalkude ebapiisava puhastamise tulemusena. Antikehade tuvastamine patsientide seerumis sisemiste ja väliste viirusantigeenide suhtes võimaldab määrata haiguse staadiumi ja populatsioonide analüüsimisel - viirusvalkude varieeruvust. Immunoblotimist HIV-nakkuse korral kasutatakse kinnitava testina üksikute viirusantigeenide ja nendevastaste antikehade tuvastamiseks. Populatsioonide analüüsimisel kasutatakse meetodit viirusvalkude varieeruvuse määramiseks. Meetodi suur väärtus seisneb võimaluses analüüsida rekombinantse DNA tehnoloogia abil sünteesitud antigeene, määrata nende suurust ja antigeensete determinantide olemasolu.

20) Virioonide põhiline struktuurikomponent (täielikud viirusosakesed) on nukleokapsiid, s.o. valgu ümbris (kapsiid), mis ümbritseb viiruse genoomi (DNA või RNA). Enamiku viirusperekondade nukleokapsiidi ümbritseb lipoproteiini ümbris. Mõnede viiruste (orto-, paramükso-, rabdo-, filo- ja retroviirused) ümbrise ja nukleokapsiidi vahel on glükosüülimata maatriksvalk, mis annab virioonidele täiendava jäikuse. Enamiku perede viirustel on ümbris, mis mängib nakkavuses olulist rolli. Virionid omandavad ümbrise väliskihi, kui nukleokapsiid tungib pungudes läbi rakumembraani. Ümbrise valke kodeerib viirus ja lipiidid laenatakse rakumembraanilt. Tavaliselt dimeeride ja trimeeride kujul olevad glükoproteiinid moodustavad virioonide pinnal peplomeere (eendid) (orto-, paramüksoviirused, rabdo-, filo-, koroona-, bunya-, arena-, retroviirused). Glükosüülitud liitvalgud on seotud peplomeeridega ja mängivad võtmerolli viiruse rakku sisenemisel. Virioonide kapsiidid ja ümbrised moodustuvad isekoostumisprotsessi tulemusena ühte või mitut tüüpi valgu subühikute paljudest koopiatest. Nõrkade keemiliste sidemete tõttu valgu-valgu süsteemis toimuv interaktsioon viib sümmeetriliste kapsiidide ühinemiseni. Viiruste erinevused virioonide kujus ja suuruses sõltuvad struktuursete valgu subühikute kujust, suurusest ja arvust ning nendevahelise interaktsiooni iseloomust. Kapsiid koosneb paljudest morfoloogiliselt ekspresseeritud subühikutest (kapsomeeridest), mis on kokku pandud viiruse polüpeptiididest rangelt määratletud viisil, vastavalt suhteliselt lihtsatele geomeetrilistele põhimõtetele. Valgu subühikud, mis ühendavad omavahel, moodustavad kahte tüüpi sümmeetrilisi kapsiidid: isomeetrilised ja spiraalsed. Ümbrisega viiruste nukleokapsiidi struktuur on sarnane ümbriseta viiruste nukleokapsiidi struktuuriga. Viiruste ümbrise pinnal eristatakse morfoloogiliselt ekspresseeritud glükoproteiini struktuure - peplomeere. Superkapsiidmembraani koostis sisaldab lipiide (kuni 20-35%) ja süsivesikuid (kuni 7-8%), mis on rakulise päritoluga. See koosneb kahekordsest rakulipiidide ja viirusspetsiifiliste valkude kihist, mis asuvad väljaspool ja sees lipiidide biokihti. Superkapsiidmembraani välimist kihti esindavad ühte või mitut tüüpi peplomeetrit (eendit), mis koosnevad ühest või mitmest glükoproteiini molekulist. Ümbrisega viiruste nukleokapsiidi nimetatakse sageli tuumaks, samas kui nukleiinhapet sisaldavate virionide keskosa nimetatakse nukleoidiks. Kapsomeerid (peplomeerid) koosnevad ühest või mitmest homoloogsest või heteroloogsest polüpeptiidahelast (valgu subühikust) koosnevatest struktuuriüksustest. viiruste klassifikatsioon Isomeetrilised kapsiidid ei ole sfäärid, vaid korrapärased hulktahukad (ikosaeedrid). Nende lineaarsed mõõtmed on piki sümmeetriatelge identsed. Kaspari ja Klugi (1962) järgi paiknevad kapsomeerid kapsiidides ikosaeedrilise sümmeetria järgi. Sellised kapsiidid koosnevad identsetest alaühikutest, mis moodustavad ikosaeedri. Neil on 12 tippu (nurka), 30 tahku ja 20 pinda võrdhaarsete kolmnurkade kujul. Selle reegli kohaselt moodustavad polioviiruse ja suu- ja sõrataudi viiruse kapsiidi 60 valgu struktuuriüksust, millest igaüks koosneb neljast polüpeptiidahelast. Ikosaeeder lahendab optimaalselt probleemi, kuidas pakkida korduvad allüksused rangesse kompaktsesse struktuuri, mille maht on minimaalne. Ainult mõned struktuursete allüksuste konfiguratsioonid võivad moodustada viiruse ikosaeedri pindu, tippe ja tahke. Näiteks moodustavad adenoviiruse struktuursed alaühikud pindadel ja nägudel kuusnurkseid kapsomeere (heksoneid) ning tippudes viisnurkseid kapsomeere (peptoone). Mõnes viiruses moodustavad mõlemat tüüpi kapsomeerid samad polüpeptiidid, teistes aga erinevad polüpeptiidid. Kuna erinevate viiruste struktuursed alaühikud erinevad üksteisest, siis mõned viirused tunduvad olevat kuusnurksemad, teised sfäärilisemad. Kõigil teadaolevatel DNA-d sisaldavatel selgroogsete viirustel, välja arvatud rõugeviirused, samuti paljudel RNA-d sisaldavatel viirustel (7 perekonda) on kuupkapsiidi sümmeetriatüüp. Erinevalt teistest selgroogsete viirustest on reoviirustel topeltkapsiid (välimine ja sisemine), millest igaüks koosneb morfoloogilistest ühikutest. Spiraalse sümmeetriatüübiga viirustel on silindriline filamentne struktuur, nende genoomne RNA on spiraalikujuline ja asub kapsiidi sees. Kõik spiraalse sümmeetriaga loomaviirused on ümbritsetud lipoproteiini ümbrisega. Spiraalseid nukleokapsiide iseloomustavad pikkus, läbimõõt, spiraali samm ja kapsomeeride arv spiraali pöörde kohta. Seega on Sendai viiruses (paramüksoviirus) nukleokapsiid umbes 1 μm pikkune, 20 nm läbimõõduga ja 5 nm spiraali samm. Kapsiid koosneb ligikaudu 2400 struktuuriüksusest, millest igaüks on valk molekulmassiga 60 kD. Ühe spiraali pöörde kohta on 11-13 subühikut. Spiraalse nukleokapsiidi sümmeetriaga viirustes tagab valgumolekulide heeliksiks voltimine maksimaalse interaktsiooni nukleiinhappe ja valgu subühikute vahel. Ikosaeedrilistes viirustes on nukleiinhape keerdunud virionide sees ja interakteerub ühe või mitme kapsiidi sees asuva polüpeptiidiga.

Antiretseptorid (retseptorid) Viiruslik- pinnavirioni valgud, näiteks hemaglutiniin, mis seonduvad komplementaarselt tundliku raku vastava retseptoriga.

21) Immunoloogilised meetodid viroloogilistes uuringutes.

Seroloogiliste testide võime tuvastada üksikuid antikehade klasse on erinev. Näiteks aglutinatsioonitest on hea IgM antikehade tuvastamiseks, kuid on vähem tundlik IgG antikehade tuvastamiseks. Komplemendi sidumise ja hemolüüsi testid, mis nõuavad komplementi, ei tuvasta komplementi mitteseotavaid antikehi, nagu IgA antikehi ja IgE antikehi. Viiruse neutraliseerimise reaktsioonis osalevad ainult antikehad, mis on suunatud patogeensusega seotud virioni pinna antigeensete determinantide vastu. Tundlikkus I. m. ja. ületab kõiki teisi antigeenide ja antikehade uurimise meetodeid, eelkõige võimaldavad radioimmunoanalüüs ja ensüümimmunoanalüüs tuvastada valgu olemasolu nanogrammides ja isegi pikogrammides mõõdetud kogustes. I. m ja abiga. määrata rühm ja kontrollida vere ohutust (B-hepatiit ja HIV-nakkus). Kangaste ja kehade siirdamisel Ja. m. võimaldab määrata kudede ühilduvust ja testida kokkusobimatuse mahasurumise meetodeid. Kohtumeditsiinis kasutatakse Castellani reaktsiooni valgu liigispetsiifilisuse määramiseks ja aglutinatsioonireaktsiooni veregrupi määramiseks.

Nakkushaiguste laboratoorses diagnostikas kasutatakse laialdaselt immunoloogilisi meetodeid. Haiguse etioloogia selgitatakse välja ka patogeeni vastaste antikehade suurenemise põhjal taastuva inimese vereseerumis võrreldes haiguse esimestel päevadel võetud prooviga. Lähtudes I. m.-st ja. uurida elanikkonna immuunsust seoses massiliste nakkustega, nagu gripp, ning hinnata ka ennetava vaktsineerimise tõhusust.

Olenevalt nende mehhanismist ja tulemuste arvestusest I. m. ja. võib jagada reaktsioonideks, mis põhinevad aglutinatsiooni nähtusel; reaktsioonid, mis põhinevad sademe nähtusel; komplementi sisaldavad reaktsioonid; neutraliseerimisreaktsioon; reaktsioonid keemiliste ja füüsikaliste meetodite abil.

Reaktsioonid, mis põhinevad aglutinatsiooni nähtusel. Aglutinatsioon on rakkude või üksikute osakeste - antigeeni kandjate - liimimine immuunseerumi abil selle antigeeni külge.

Bakterite aglutinatsiooni test sobiva antibakteriaalse seerumi abil on üks lihtsamaid seroloogilisi teste. Testitud vereseerumi erinevatele lahjendustele lisatakse bakterite suspensioon ja pärast teatud kokkupuuteaega t ° 37 ° juures registreeritakse, millal toimub vereseerumi aglutinatsiooni kõrgeim lahjendus. Bakterite aglutinatsioonireaktsiooni kasutatakse paljude nakkushaiguste diagnoosimiseks: brutselloos, tulareemia, kõhutüüfus ja paratüüfus, bakteriaalne düsenteeria ja tüüfus.

Passiivse või kaudse hemaglutinatsiooni reaktsioon (RPGA, RNGA). See kasutab erütrotsüüte või neutraalseid sünteetilisi materjale (näiteks lateksiosakesed), mille pinnale adsorbeeritakse antigeenid (bakteriaalsed, viiruslikud, koed) või antikehad. Nende aglutinatsioon toimub sobivate seerumite või antigeenide lisamisel.

Passiivset hemaglutinatsioonireaktsiooni kasutatakse bakterite (tüüfus ja paratüüfus, düsenteeria, brutselloos, katk, koolera jne), algloomade (malaaria) ja viiruste (gripp, adenoviirusnakkused, viirushepatiit B, leetrid, puukide kaudu levivad haigused) diagnoosimiseks. entsefaliit, Krimmi hemorraagiline palavik jne), samuti teatud hormoonide määramiseks, patsiendi ülitundlikkuse tuvastamiseks ravimite ja hormoonide, näiteks penitsilliini ja insuliini suhtes.

Hemaglutinatsiooni inhibeerimise test (HITA) põhineb viiruste poolt põhjustatud erütrotsüütide hemaglutinatsiooni immuunseerumi ennetamise (inhibeerimise) nähtusel ning seda kasutatakse viirusevastaste antikehade tuvastamiseks ja tiitrimiseks. See on peamine gripi, leetrite, punetiste, mumpsi, puukentsefaliidi ja muude viirusnakkuste serodiagnostika meetod, mille põhjustajatel on hemaglutineerivad omadused. näiteks puukentsefaliidi serodiagnostikaks valatakse paneeli süvenditesse patsiendi seerumi kahekordsed lahjendused aluselises boraadi puhverlahuses. Seejärel lisatakse teatud kogus, tavaliselt 8 ühikut (aglutineerivat ühikut) puukentsefaliidi antigeeni, ja pärast 18-tunnist eksponeerimist temperatuuril t ° 4 ° lisatakse hane erütrotsüütide suspensioon, mis on valmistatud happelises fosfaatpuhverlahuses. Kui patsiendi vereseerumis on puukentsefaliidi viiruse antikehad, siis antigeen neutraliseeritakse ja erütrotsüütide aglutinatsiooni ei toimu.

Sademete nähtusel põhinevad reaktsioonid. Sadestumine toimub antikehade interaktsiooni tulemusena lahustuvate antigeenidega. Sadestamisreaktsiooni lihtsaim näide on läbipaistmatu sadestumisriba moodustumine katseklaasis antikeha antigeeni kihistumise piiril. Laialdaselt kasutatakse erinevat tüüpi sadestamisreaktsioone poolvedelagar või agaroosgeelides (Ouchterloni topeltimmunodifusiooni meetod, radiaalne immunodifusiooni meetod, immunoelektroforees), mis on nii kvalitatiivsed kui ka kvantitatiivsed. Antigeenide ja antikehade vaba difusiooni tulemusena geelis nende optimaalse suhte tsoonis moodustuvad spetsiifilised kompleksid - sademeribad, mis tuvastatakse visuaalselt või värvimisega. Meetodi eripära on see, et iga antigeen-antikeha paar moodustab individuaalse sadestumisriba ning reaktsioon ei sõltu teiste antigeenide ja antikehade olemasolust uuritavas süsteemis.

Reaktsioonid, mis hõlmavad komplementi, mida kasutatakse värske merisea seerumina, põhinevad Clq komplemendi alamkomponendi ja seejärel teiste komplemendi komponentide võimel kinnituda immuunkompleksidele.

Komplemendi sidumisreaktsioon (CFR) võimaldab tiitrida antigeene või antikehi vastavalt komplemendi sidumise astmele antigeen-antikeha kompleksi poolt. See reaktsioon koosneb kahest faasist: antigeeni interaktsioon uuritava vereseerumiga (testimissüsteem) ja hemolüütilise seerumi interaktsioon oina erütrotsüütidega (indikaatorsüsteem). Positiivse reaktsiooni korral toimub uuritavas süsteemis komplemendi sidumine ja seejärel antikehaga sensibiliseeritud erütrotsüütide lisamisel hemolüüsi ei täheldata. Reaktsiooni kasutatakse süüfilise (Wassermanni reaktsioon), viirus- ja bakteriaalsete infektsioonide serodiagnostikaks.

Neutraliseerimisreaktsioon põhineb antikehade võimel neutraliseerida makromolekulaarsete või lahustuvate antigeenide teatud spetsiifilisi funktsioone, nagu ensüümide aktiivsus, bakteriaalsed toksiinid ja viiruste patogeensus. Toksiinide neutraliseerimise reaktsiooni saab hinnata bioloogilise toime järgi, näiteks tiitritakse teetanuse- ja botuliinivastaseid seerumeid. Loomadele manustatud toksiini ja antiseerumi segu ei põhjusta nende surma. Viroloogias kasutatakse neutraliseerimisreaktsiooni erinevaid variante. Kui viiruseid segada sobiva antiseerumiga ja seda segu manustada loomadele või rakukultuuridele, neutraliseeritakse viiruste patogeensus ja loomad ei haigestu ning kultuuride rakud ei hävine.

Reaktsioonid keemiliste ja füüsikaliste märgiste abil. Immunofluorestsents seisneb fluorokroomiga märgistatud antikehade, täpsemalt IgG antikehade immunoglobuliinifraktsiooni kasutamises. Fluorokroomiga märgistatud antikeha moodustab antigeeniga antigeen-antikeha kompleksi, mis muutub mikroskoobi all jälgimiseks kättesaadavaks fluorokroomi luminestsentsi ergastavate UV-kiirte abil. Otsest immunofluorestsentsreaktsiooni kasutatakse rakuliste antigeenide uurimiseks, viiruse tuvastamiseks nakatunud rakkudes ning bakterite ja riketsia tuvastamiseks määrdumisel.

Kaudse immunofluorestsentsi meetodit kasutatakse laialdasemalt. põhineb antigeen-antikeha kompleksi tuvastamisel, kasutades luminestseeruvat anti-lgG antikeha seerumit ja seda kasutatakse mitte ainult antigeenide tuvastamiseks, vaid ka antikehade tiitrimiseks.

Immunoensüümsed ehk ensüümimmunoloogilised meetodid põhinevad ensüümidega, peamiselt mädarõika peroksidaasi või aluselise fosfataasiga konjugeeritud antikehade kasutamisel. Sarnaselt immunofluorestsentsiga kasutatakse ensüümi immuunanalüüsi antigeenide tuvastamiseks rakkudes või antikehade tiitrimiseks antigeeni sisaldavatel rakkudel.

Radioimmunoloogiline meetod põhineb antigeenide või antikehade radioisotoopmärgise kasutamisel. See on kõige tundlikum meetod antigeenide ja antikehade määramiseks, mida kasutatakse hormoonide, ravimite ja antibiootikumide määramiseks, bakteriaalsete, viiruslike, riketsiaalsete, algloomsete haiguste diagnoosimiseks, verevalkude, kudede antigeenide uurimiseks.

Immunoblotimist kasutatakse üksikute antigeenide vastaste antikehade tuvastamiseks või antigeenide "äratundmiseks" tuntud seerumitest. Meetod koosneb 3 etapist: bioloogiliste makromolekulide (näiteks viiruse) eraldamine üksikuteks valkudeks polüakrüülamiidgeelelektroforeesi abil; eraldatud valkude ülekandmine geelist tahkele alusele (blot), kandes aktiveeritud paberile või nitrotselluloosile polüakrüülamiidgeeliplaadi (elektroblotanalüüs); soovitud valkude tuvastamine substraadil otsese või kaudse ensüümi immuunanalüüsi abil. Diagnostilise meetodina kasutatakse HIV-nakkuse korral immunoblotimist. Diagnostiline väärtus on viiruse väliskesta ühe valgu vastaste antikehade tuvastamine.

22) Sümmeetrilised viiruste tüübid (kubikujulised, spiraalsed, segatud). Valkude ja nukleiinhapete koostoime viiruse genoomide pakkimisel.

Sõltuvalt kapsiidi interaktsioonist nukleiinhappega võib viiruseosakesed jagada mitmeks sümmeetriatüübiks:

1). Kuupsümmeetria tüüp.

Kuupkapsiidid on umbes 20 kolmnurkse pinna ja 12 tipuga ikosiidid. Need moodustavad kerakujulist moodustist meenutava struktuuri, kuid tegelikult on see hulktahukas. Mõnel juhul on selliste ikosaeedriliste hulktahukate tippude külge kinnitatud spetsiaalsed lipoproteiinide moodustised, mida nimetatakse naelu. Nende piikide roll on eeldatavasti taandatud virioonide või viirusosakeste interaktsioonile peremeesrakkude vastavate piirkondadega, mis on nende suhtes tundlikud. Kuubisümmeetriaga on viiruse nukleiinhape tihedalt pakitud (rullitud palliks) ja valgumolekulid ümbritsevad seda, moodustades polüeedri (ikosaeedri). Ikosaeeder on kahekümne kolmnurkse tahuga hulktahukas, millel on kuubisümmeetria ja ligikaudu sfääriline kuju. Ikosaeedriviiruste hulka kuuluvad herpes simplex viirus, reoviirused jne.

2). Spiraalse sümmeetria tüüp. Spiraalsed kapsiidid on mõnevõrra lihtsamad. Need. Kapsiidi moodustavad kapsomeerid katavad spiraalset NK-d ja moodustavad ka nende viiruste üsna stabiilse valgukihi. Ja kasutades kõrge eraldusvõimega elektronmikroskoope ja sobivaid ettevalmistusmeetodeid, võib viirustel näha spiraalseid struktuure. Kapsiidi spiraalse sümmeetriaga moodustab viiruse nukleiinhape spiraalse (või spiraalse) kuju, mis on seest õõnes ja valgu subühikud (kapsomeerid) on samuti virnastatud selle ümber spiraalina (torukujuline kapsiid). Kapsiidi spiraalse sümmeetriaga viiruse näide on tubaka mosaiikviirus, mis on pulgakujuline ja selle pikkus on 300 nm ja läbimõõt 15 nm. Viiruse osakese koostis sisaldab ühte umbes 6000 nukleotiidi suurust RNA molekuli. Kapsiid koosneb 2000 identsest valgu subühikust, mis on paigutatud heeliksisse.

3). Segatud või kompleksne sümmeetriatüüp. Reeglina leidub seda tüüpi sümmeetriat peamiselt bakteriaalsete viiruste seas. Ja klassikalised näited on need faagid, E. coli või parasvöötme faagid. Need on keerulised moodustised, millel on sisemise nukleiinisisaldusega pea, mitmesugused lisandid, sabaprotsess ja erineva keerukusega seade. Ja selliste osakeste igal komponendil on spetsiifiline funktsioon, mis realiseerub viiruse ja raku vahelise interaktsiooni protsessis. Teisisõnu on keeruline sümmeetriatüüp kuubisümmeetria kombinatsioon, pea on ikosiderpolühedron ja vardakujulised moodustised on sabaprotsessid. Kuigi bakteriaalsete viiruste hulgas on ka üsna lihtsalt organiseeritud virioone, mis on primitiivsed nukleokapsiidid, sfäärilise või kuubikujulise kujuga. Bakteriaalsed viirused on keerulisemad kui taime- ja loomaviirused.

24) Faagi interaktsioon rakuga. Virulentsed ja parasvöötme faagid.

Adsorptsioon.

Koostoime algab viiruseosakeste kinnitumisest rakupinnale. Protsess muutub võimalikuks sobivate retseptorite olemasolul raku pinnal ja antiretseptorite olemasolul viirusosakese pinnal.

Viirused kasutavad raku retseptoreid, mis on loodud oluliste ainete transportimiseks: toitaineosakesed, hormoonid, kasvufaktorid jne.

Retseptorid: valgud, valkude ja lipiidide süsivesikute komponent, lipiidid. Spetsiifilised retseptorid määravad viiruseosakese edasise saatuse (transport, kohaletoimetamine tsütoplasma või tuuma piirkondadesse). Viirus võib kinnituda mittespetsiifiliste retseptorite külge ja isegi rakku tungida. Kuid see protsess ei põhjusta infektsiooni.

Esialgu moodustub antiretseptori ja retseptori vahel üksikside. See side on habras ja võib katkeda. Pöördumatu adsorptsiooni tekkeks on vajalik mitmevalentne kinnitus. Stabiilne seondumine toimub tänu retseptori molekulide vabale liikumisele membraanis. Viiruse ja raku interaktsiooni ajal täheldatakse lipiidide voolavuse suurenemist ja viiruse ja raku vahelise interaktsiooni piirkonnas retseptoriväljade moodustumist. Paljude viiruste retseptorid võivad esineda ainult piiratud hulgal peremeesrakkudel. See määrab organismi tundlikkuse selle viiruse suhtes. Seega on viiruse DNA-l ja RNA-l võime nakatada laiemat hulka peremeesrakke.

Antiretseptoreid leidub ainulaadsetes viirusorganellides: väljakasvustruktuurid T-bakteriofaagides, kiud adenoviirustes, naelu viirusmembraanide pinnal, koroonaviirustes koronaviirus.

Tungimine.

2 mehhanismi - retseptori endotsütoos ja membraanide liitmine.

Retseptori endotsütoos:

Tavaline mehhanism toitainete ja reguleerivate ainete sisenemiseks rakku. Esineb spetsialiseeritud piirkondades – kus on spetsiaalsed klatriiniga kaetud süvendid, paiknevad kaevu põhjas spetsiifilised retseptorid. Süvendid tagavad kiire invaginatsiooni ja klatriiniga kaetud vakuoolide moodustumise (adsorptsiooni hetkest ei möödu rohkem kui 10 minutit, ühe minuti jooksul võib tekkida kuni 2000 vakuooli). Vakuoolid sulanduvad suuremate tsütoplasmaatiliste vakuoolidega, moodustades retseptorosoomid (ei sisalda enam klatriini), mis omakorda sulanduvad lüsosoomidega.

Viiruse ja rakumembraanide liitmine:

Ümbrisega viiruste puhul vahendavad sulandumist viirusvalgu punktinteraktsioonid rakumembraani lipiididega, mille tulemusena integreerub viiruse lipoproteiini ümbris rakumembraaniga. Ümbristamata viirustel interakteerub üks pinnavalkudest ka rakumembraani lipiididega ja sisemine komponent läbib membraani (paramüksoviiruste puhul F-valk; ortomüksoviiruste puhul HA2 hemaglutineeriv alaühik). Pinnavalkude konformatsiooni mõjutab pH.

Riba.

Selle protsessi käigus kaob nakkuslik aktiivsus, sageli ilmneb tundlikkus nukleaaside suhtes ja tekib resistentsus antikehade suhtes. Lahtiriietumise lõpp-produktiks on nukleiinhapped, mis on seotud viirusliku sisevalguga. Lahtiriietumise staadium piirab ka nakatumise võimalust (viirused ei suuda end igas rakus lahti riietada). Lahtiriietamine toimub raku spetsiaalsetes piirkondades: lüsosoomides, Golgi aparaadis ja perinukleaarses ruumis.

Lahtiriietumine toimub rea reaktsioonide tulemusena. Näiteks pikornaviiruste puhul toimub lahtiriietumine subviiruse vahepealsete osakeste moodustumisega, mille suurus on vahemikus 156 kuni 12S. Adenoviiruste korral tsütoplasmas ja tuumapoorides ning sellel on vähemalt 3 etappi:

Virioonidest suurema tihedusega subviraalsete osakeste moodustumine;

Tuumade moodustumine, milles puudub 3 viirusvalku;

DNA-valgu kompleksi moodustumine, milles DNA on kovalentselt seotud terminaalse valguga.

Virulentsete ja parasvöötme faagide iseloomustus.

Bakteri nakatumisel faagiga tekib nn lüütiline infektsioon, s.t nakatumine lõpeb peremeesraku lüüsiga, kuid see on iseloomulik ainult nn virulentsetele faagidele, mille interaktsioon rakuga põhjustab rakusurma ja faagi järglaste moodustumist.

Samas eristatakse faagi ja raku interaktsioonide järgi järgmisi etappe: faagi segamine rakukultuuriga (nakatumise kordsus on 1 faag 10 raku kohta) ja kontsentratsioon peab olema piisavalt kõrge, et faagid võivad rakkudega kokku puutuda. Uuesti nakatumise vältimiseks – pärast nakatamist maksimaalselt 5 minutit, kui faagid on adsorbeerunud – lahjendatakse seda rakkude segu faagiga. On varjatud periood, mille jooksul faagide arv ei suurene, siis väga lühike väljumisperiood, mil faagiosakeste arv suureneb järsult, kui rakk lüüsib ja faagi järglased vabanevad ning seejärel jääb faagide arv faagide arvu juurde. samal tasemel, sest uuesti nakatumist ei toimu. Selle kõvera põhjal saab eristada neid faase: "kasvu" vegetatiivne periood (latentse perioodi), väljumisperiood ja arvutada faagi saagis 1 nakatunud raku kohta. Varjatud perioodil ei leidu bakterites midagi, mis meenutaks faagiosakesi ning varjatud perioodil ei ole võimalik sellistest rakkudest nakkavat printsiipi isoleerida. Ainult küpsed faagiosakesed võivad baktereid nakatada. Seega põhjustavad virulentsed faagid alati bakterite surma ja tekitavad infektsiooni, mis ilmneb uute viirusosakeste tootmisel, mis on võimelised nakatama järgmisi ja teisi tundlikke rakke.

Erinevalt virulentsetest ei too parasvöötme faagidega nakatumine kaasa bakterirakkude lüüsi, vaid realiseerub faagi ja bakteriraku kooseksisteerimise eriline seisund. See kooseksisteerimine väljendub selles, et teatud faagi algus on bakterirakus olemas ilma talle ebasoodsate tingimusteta ja säilib põlvest põlve. Sellise kooseksisteerimise teatud etappidel aktiveerub faag rakus ja siseneb lüütilise arengutsükli olekusse, põhjustades raku lüüsi ja faagi järglaste vabanemist. Selliseid faage nimetatakse lüsogeenseteks või parasvöötme faagideks ja faagi mõõduka olemasolu olek on lüsogeenne ning baktereid, mis sisaldavad sellist latentse faagi, nimetatakse lüsogeenseteks bakteriteks. Mõiste lüsogeensed bakterid tulenes asjaolust, et kunagi avastati kultuurid, milles faag ilmus spontaanselt, ja seda bakteriofaagi hakati käsitlema kultuuri saastumisena, see tähendab, et kultuuri siseneb bakteriaalne viirus ja selliseid kultuure nimetati lüsogeenseteks, see tähendab, et nad tekitavad lüüsi.

Erinevalt bakteritest paljunevad viirused ainult elusrakkudes. Sellega seoses saab viiruste kultiveerimist läbi viia katselooma (kana embrüot kui arenevat organismi nimetatakse katseloomadeks) või väljaspool keha kasvanud elusraku, s.o. rakukultuuri tasemel.

Laboriloomade kasutamine. Üks viiruste eraldamise ja kultiveerimise meetodeid on laboriloomade nakatamine. Neid kasutatakse viiruste isoleerimiseks, mis ei põhjusta tsütopaatiliste muutuste teket rakukultuurides ega paljune kanaembrüodes. Laboratoorsete loomade kasutamine võimaldab tuvastada ka viirusnakkuse olemust kliiniliste sümptomite kompleksi järgi. Laboratoorsete loomadena kasutatakse kõige sagedamini valgeid hiiri, hamstreid, merisigu ja küülikuid, olenevalt töö eesmärgist ja uuritavate viiruste tüübist. Suurematest loomadest kasutatakse eri liiki ahve ja mõningaid teisi loomi. Lindudest kasutage kanu, hanesid, parte. Viimastel aastatel on sündinud vastsündinud loomi (vastuvõtlikumad viirustele), "steriilseid loomi" (emakast ekstraheeritud ja steriilsetes tingimustes, kasutades steriilset õhku ja steriliseeritud toitu) ning teadaoleva pärilikkusega puhta liini loomi (sisearetatud või lineaarsed loomad). sagedamini kasutatakse.

Katsesse võetakse ainult terved loomad, eelistatavalt ühest lasteaiast ja ühest partiist. Samal ajal mõõdetakse kehatemperatuuri, kuna selles on igapäevaseid kõikumisi. Uuritava materjali manustamisel võetakse arvesse viiruste tropismi teatud kudedele. Niisiis, neutrotroopsete viiruste eraldamiseks süstitakse materjal ajju, pneumotroopsete viiruste eraldamiseks - nina kaudu (kerge eeteranesteesia all).

Laboriloomadel on pärast viirust sisaldava materjaliga nakatumist oluline võtta materjal edasiseks uurimiseks õigeaegselt ja korrektselt ning aseptiliselt. Viiruse eraldamise tulemused loetakse positiivseks, kui loomal tekivad pärast sobivat inkubatsiooniperioodi nakkussümptomid.

Tibude embrüote kasutamine. Embrüo kudedes, selle membraanides, munakollases on paljud patogeensed inimese ja looma viirused võimelised paljunema. Sel juhul on oluline viiruste selektiivsus konkreetse koe suhtes: rõugeviirused paljunevad hästi ja akumuleeruvad koorioni-allantoismembraani rakkudesse, mumpsi viirus amnioni, gripiviirused amnioni ja allantoisi ning marutaudi viirus munakollases kotis.

Viiruste kasvatamisel arenevates embrüodes on teiste meetodite ees mitmeid eeliseid: tihe kest kaitseb üsna usaldusväärselt sisemist sisu mikroobide eest; kana embrüote nakatamisel saadakse rohkem viirust sisaldavat materjali kui teiste kasvatusmeetoditega; kanaembrüote nakatumise meetod on lihtne ja kättesaadav kõikidele viroloogilistele laboritele; embrüotel on piisav elujõulisus ja vastupidavus välistegurite patogeenide suhtes. Siiski ei ole kanaembrüod alati vabad latentsetest viirus- ja bakteriaalsetest infektsioonidest. Embrüos pärast viirusega nakatumist tekkivate patoloogiliste muutuste dünaamikat on raske jälgida. Nakatunud embrüote lahkamisel ei ilmne sageli nähtavaid muutusi ja viirus tuvastatakse hemaglutinatsioonitesti ja muude meetodite abil. Nakatunud embrüote puhul on antikehade tiitri tõusu jälgimine võimatu. Meetod ei sobi kõigi viiruste jaoks.

Viroloogilisteks uuringuteks kasutatakse 7-12 päeva vanuseid embrüoid, mis on saadud linnufarmidest. Embrüoid saab kasvatada tavalises termostaadis, mille põhja asetatakse õhu niisutamiseks veega kandikud. Termostaadi temperatuur peaks olema 37 ° C ja õhuniiskus 60-65%. Valige valgete kanade suured, puhtad (kuid pesemata) viljastatud munad, mida säilitatakse kuni 10 päeva temperatuuril 5-10 °C. Viljastatud munad tunneb ära iduketta olemasolu järgi, mis ovoskoobiga läbipaistvana näeb välja nagu tume laik.

Viirustega töötamisel saab kasutada erinevaid embrüote nakatamise meetodeid, kuid kõige praktilisem rakendus on viiruse kandmine koorioni-allantoisi membraanile, allantoisi, amnioniõõnde ja munakollase sisseviimine.

(Joon. 10.5). Meetodi valik sõltub uuritava viiruse bioloogilistest omadustest.

Riis. 10.5.

Enne nakatumist määratakse ovoskoobi abil embrüo elujõulisus. Elusembrüod on liikuvad, membraanide veresoonte pulsatsioon on selgelt nähtav. Küünlatamisel märgi lihtsa pliiatsiga karbile õhukoti piirid või embrüo asukoht, mille määrab selle vari karbil.

Kana embrüod nakatatakse karbis rangelt aseptilistes tingimustes keetmisega steriliseeritud instrumentidega.

Koorion-allantoismembraanil nakatumisel sobivad kõige paremini 12-päevased embrüod. Allantoisiõõnes nakatumiseks kasutatakse 10-11 päeva vanuseid embrüoid, amnioniõõnes - 7-11 päeva vanuseid, rebukotis - 7 päeva vanuseid embrüoid.

Nakatunud embrüotega munad asetatakse alustele tömbi otsaga. Temperatuurirežiim ja inkubatsiooniperiood sõltuvad nakatatud viiruse bioloogilistest omadustest. Embrüote elujõulisust jälgitakse iga päev ovoskoobi all. Esimesel päeval pärast nakatumist vigastuse tõttu surnud embrüoid ei uurita.

Enne materjali kogumist jahutatakse embrüoid 18-20 tundi 4 °C juures, et veresooned ahendaksid ja lahkamisel ei tekiks verejooksu. Embrüod avatakse kastis aseptika reegleid järgides.

Allantoisivedelik imetakse pipetiga, steriilsust kontrollitakse suhkru- või liha-peptoonipuljongis nakatamise teel, hemaglutinatsioonireaktsioonis kontrollitakse viiruse olemasolu ja säilitatakse külmutatuna temperatuuril 4 °C.

Lootevee saamiseks aspireeritakse esmalt allantoisi vedelik, seejärel püütakse pintsettidega kinni lootevesi, tõstetakse veidi üles ja imetakse Pasteuri pipetiga lootevesi ära.

Koorion-allantoismembraani muutuste uurimisel lõigatakse see kääridega läbi ja kogu sisu valatakse läbi augu Petri tassi. Koorion-allantoi membraan jääb kesta sisse ja eemaldatakse pintsettidega soolalahusega Petri tassi. Siin pestakse, sirgendatakse ja uuritakse fokaalsete kahjustuste olemust tumedal taustal.

Lootevee membraani saamiseks lõigatakse lootekott, millesse embrüo on suletud, ja vabastatakse embrüost ning vaadeldakse kahjustusi.

Munakollase membraani saamiseks lõigatakse koorion-allantois, imetakse ära allantois- ja lootevesi, eemaldatakse pintsettidega loode, eraldatakse nabanööriga, püütakse kinni munakollane ja asetatakse Petri tassi. Kontrollige steriilsust, vaadake kahjustuste olemasolu. Vajadusel saab munakollast eemaldada süstlaga ilma munakollast eemaldamata.

Viiruse esinemine nakatunud embrüo allantoisi- ja amniootilises vedelikus määratakse hemaglutinatsioonitestis. Pärast steriilsuse testimist embrüotest saadud vedelikud ühendatakse ja tiitritakse laiendatud hemaglutinatsioonitestis.

Kui uuritavas materjalis on vähe viirust või kui seda ei ole võimalik tuvastada, tehakse kanaembrüotel järjestikused passaažid. Kui pärast kolme järgnevat embrüo passaaži viirust uuritavas materjalis ei tuvastata, loetakse tulemus negatiivseks.

Rakukultuuride kasutamine. Rakkude kasvatamine väljaspool keha nõuab mitmete tingimuste täitmist. Üks neist on steriilsuse range järgimine töö ajal, kuna kasutatavad toitekeskkonnad on suurepäraseks toitainesubstraadiks ka bakteritele ja seentele. Koerakud on väga tundlikud raskmetallide soolade suhtes. Seetõttu tuleb erakordselt tähtsaks pidada soolalahuste ja toitekeskkonna koostisainete kvaliteeti, samuti rakukultuuris kasutatavate riistade ja kummikorkide töötlemise meetodeid.

Üks eduka töö rakkudega eeldusi on destilleeritud vee kõrge kvaliteet (kontrollitakse kaks korda nädalas). Rakkudega töötamiseks kasutatakse bidestilleeritud või deioniseeritud vett. Parimad destilleerijad on klaasist või legeerterasest valmistatud seadmed: rakkudele mürgiseid raskemetalliioone sellistest seadmetest välja ei uhu. Deioniseeritud vett saadakse spetsiaalsetes seadmetes, kus vesi puhastatakse sooladest selle järjestikuse läbimise käigus läbi anioonivaheti ja katioonivahetiga kolonnide.

Rakkude kultiveerimisel esitatakse eriti kõrged nõuded nõude ja korkide valmistamisele ja steriliseerimisele. Paljudel juhtudel põhjustab nende vale pesemine ja steriliseerimine rakkude mitte kinnitumist klaasile või raku monokihi kiiret degeneratsiooni.

Rakkude kasvuks ja paljunemiseks väljaspool keha on vaja kompleksset füüsikalis-keemiliste tegurite kogumit: teatud temperatuur, vesinikioonide kontsentratsioon, anorgaanilised ühendid, süsivesikud, aminohapped, valgud, vitamiinid, hapnik ja süsinikdioksiid, seega , kasutatakse viiruste kasvatamiseks rakukultuurides kompleksseid toitekeskkondi. Vastavalt nende koostist moodustavate komponentide olemusele jagatakse need kandjad kahte rühma.

• 1. Sööde, mis on soolalahuste (Hanks, Earl jne) ja looduslike komponentide (looma- ja inimese vereseerum, albumiini hüdrolüsaat) segud. Kõigi nende komponentide kogus erinevates söötmete koostistes on erinev.
• 2. Sünteetilised ja poolsünteetilised söötmed, mis koosnevad soolalahustest (Earl, Hanks jt), millele on lisatud aminohappeid, vitamiine, koensüüme ja nukleotiide (Eagle media, 199 jne). Sünteetilises söötmes võivad rakud eksisteerida elujõulises olekus lühikest aega (kuni 7 päeva). Nende pikemaajaliseks elujõulises seisundis hoidmiseks, samuti rakkude kasvuks ja paljunemiseks paremate tingimuste loomiseks lisatakse sünteetilistele söötmetele loomade vereseerumit (lehmad, vasikad jne).

Viiruste isoleerimiseks võib kasutada erinevaid meetodeid rakkude kasvatamiseks väljaspool keha. Kuid praegu on primaarsete trüpsiinitud ja siirdatud rakuliinide ühekihilised kultuurid saanud suurima praktilise rakenduse. Ühekihilisi rakukultuure kasvatatakse 1 l, 250 ja 100 ml mahuga lamedate seintega klaasist anumates-madratsites või tavapärastes sobival viisil töödeldud bakterioloogilistes katseklaasides.

Primaarsete trüpsiinitud rakukultuuride kasutamisel seisneb meetodi olemus rakkudevaheliste sidemete hävitamises kudedes proteolüütiliste ensüümide toimel ja rakkude eraldamises, et kasvatada klaasi pinnale monokiht. Rakkude saamise allikaks võivad olla inimeste ja loomade embrüote, tapetud loomade ja lindude, aga ka inimestelt operatsiooni käigus eraldatud koed ja elundid. Kasutage normaalseid ja pahaloomulisi degenereerunud kudesid, epiteeli, fibroblasti tüüpi ja segatud. Võime paljundada organismist eraldatud rakke on tihedalt seotud kudede diferentseerumisastmega. Mida vähem diferentseerunud on kude, seda intensiivsem on selle rakkude võime in vitro paljuneda. Seetõttu on embrüonaalsete ja kasvajakudede rakke palju lihtsam väljaspool keha kultiveerida kui täiskasvanud loomade tavalisi rakke.

Igapäevaseid kultuure vaadeldakse väikese suurendusega mikroskoobi all, et määrata nende kasvu iseloom. Kui rakud ei voha, näevad välja ümmargused, teralised, tumedad ja klaasilt ketendavad, on klaasnõud halvasti töödeldud või söötme koostisained on mürgised.

Koos primaarsete trüpsiinitud kudedega kasutatakse viiruse kasvatamiseks laialdaselt siirdatud rakukultuure; rakukultuurid, mis on võimelised piiramatult paljunema väljaspool keha. Kõige sagedamini kasutatakse rakukultuure, mis on saadud inimese normaalsetest ja vähkkasvajatest kudedest. Emakakaela kasvajast saadud HeLa rakuliin, kõri kartsinoomist Hep-2, suuõõne vähikoest KV on saanud laialdaselt tuntuks. Selliseid rakukultuure valmistatakse ka normaalsetest loomsetest kudedest – ahvi, küüliku ja sea embrüo neerudest (tabel 10.1).

Siirdatud rakkude uuesti külvamiseks imetakse toitainekeskkond pipetiga ära ja valatakse välja. Moodustunud õhuke rakukiht hävitatakse trüpsiinilahusega ning sel viisil vabanenud rakud viiakse värske toitelahusega uude anumasse, kus moodustub taas rakkude monokiht.

Viiruse esinemise indikaator nakatunud rakukultuurides võib olla:

• a) spetsiifilise raku degeneratsiooni areng;
• b) intratsellulaarsete lisandite tuvastamine;
• c) spetsiifilise antigeeni tuvastamine immunofluorestsentsi abil;
• d) positiivne hemadsorptsioonireaktsioon;
• e) positiivne hemaglutinatsiooni reaktsioon;
• e) naastude moodustumine.

Tabel 10.1

Kõige sagedamini kasutatavate rakukultuuride loetelu

Nakatunud kultuuride spetsiifilise degeneratsiooni tuvastamiseks uuritakse rakke iga päev väikese suurendusega mikroskoobi all. Paljud viirused põhjustavad rakkudes paljunemisel nende degeneratsiooni, s.t. neil on tsütopatogeenne toime (CPA) (joonis 10.6).

Riis. 10.6.

Arenguaeg ja tsütopaatiliste muutuste olemus nakatunud rakukultuurides määratakse nakatatud viiruse omaduste ja doosiga, samuti raku kasvatamise omaduste ja tingimustega. Mõned viirused põhjustavad CPP-d esimese nädala jooksul pärast nakatumist (rõuged, lastehalvatus, Coxsackie B jne), teised - 1-2 nädala pärast. pärast nakatumist (adenoviirused, paragripiviirused, ECHO jne).

Viirused põhjustavad kolme põhitüüpi tsütopaatilisi muutusi: mitmetuumaliste hiidrakkude ja sümplastide teke, mis on paljude rakkude tsütoplasma ühinemise tulemus; ümarrakkude degeneratsioon, mis tuleneb rakkudevaheliste ühenduste kadumisest ja rakkude ümardamisest; mitmest rakukihist koosnevate rakkude proliferatsioonikoldete areng.

Mõnede viiruste paljunemisel rakukultuurides tekivad mõjutatud rakkude tsütoplasmas või tuumas rakusisesed inklusioonid. Inklusioonide tuvastamiseks kasvatatakse rakukultuure klaasplaatidel katseklaasides, nakatatakse viirusega ja pärast teatud inkubatsiooniperioode valmistatakse preparaadid, värvides neid tavaliste värvainetega.

Konkreetse antigeeni tuvastamiseks nakatatud rakukultuurides valmistatakse preparaadid samamoodi nagu inklusioonide tuvastamiseks MFA abil.

Naastude meetod põhineb viirusega nakatunud rakkude monokihis moodustumisel degenereerunud (surnud) rakkudest koosnevate värvimuutustega alade agarkatte all. Need piirkonnad, mida nimetatakse naastudeks, on viiruse kolooniad, mis on tavaliselt moodustunud ühest viirusosakesest.

Tsütopaatiliste muutuste, rakusiseste inklusioonide, naastude moodustumise, hemadsorptsiooni ja hemaglutinatsiooni negatiivsete reaktsioonide puudumisel uuritava materjaliga nakatunud rakukultuurides tehakse kaks järjestikust passaaži. Nende muutuste puudumisel viimases passaažis loetakse viiruse eraldamise tulemus negatiivseks.

Viiruste tuvastamiseks nakkusohtlikus materjalis saab kasutada järgmisi meetodeid.

Mikroskoopiline:

• a) viroskoopia;
• b) intratsellulaarsete lisandite tuvastamine.

Immunoloogiline:

• a) immuunelektronmikroskoopia;
• b) immunofluorestsents;
• c) hemaglutinatsioon;
• d) hemadsorptsioon.

Viiruste tuvastamine toimub immunoloogiliste meetodite abil, sealhulgas järgmiste reaktsioonide abil:

• a) hemaglutinatsiooni pärssimine;
• b) hemadsorptsiooni viivitused;
• c) komplemendi sidumine;
• d) neutraliseerimine;
• e) sadestamine agargeelis.

mikroskoopilised meetodid. Valgusmikroskoobiga saab tuvastada ainult suuri viirusi, mis on suuremad kui 150 nm. Väiksemate viiruste äratundmine on võimalik ainult elektronmikroskoobiga. Suurte viiruste tuvastamiseks saab kasutada valgus-, faasikontrast- ja fluorestsentsmikroskoopiat.

Viirusnakkuste ajal tekivad nakatunud rakkudes omapärased kandmised. Mõne infektsiooniga kaasneb inklusioonide moodustumine mõjutatud rakkude tsütoplasmas (marutaudi, rõugete vaktsiin), teistega - tsütoplasmas ja tuumas (leetrid, looduslikud ja tuulerõuged, adenoviiruse haigused). Inklusioonid on erineva iseloomu, struktuuri, kuju ja suurusega vahemikus 0,25 kuni 25 mikronit. Kaasaegsete andmete kohaselt on mõne infektsiooni korral kandmised viiruse paljunemise koht ja kujutavad endast selle rakuainetega ümbritsetud kogunemist, samas kui teistes on need raku degeneratsiooni saadus.

Inklusioone saab tuvastada elundite ja kudede värvitud väljatrükkidel, rakkude kaapimistel, kahjustatud koe histoloogilistel lõikudel ja viirusega nakatunud rakukultuuri preparaatidel. Värvimine toimub sageli Romanovsky-Giemsa meetodil. Selle meetodiga värvimiseks fikseeritakse preparaadid Dubosque - Brasiilia - Bouin segus, mis koosneb pikriinhappest, formaliinist, alkoholist, äädikhappest. Enamiku viirusnakkuste intratsellulaarsed inklusioonid on oksüfiilsed ja värvivad Romanovsky-Giemsa meetodil roosa või lilla värvi.

Immunoloogilised meetodid viirusnakkuste diagnoosimiseks. Viimastel aastatel on need meetodid muutunud viirusnakkuste laboratoorses diagnoosimises juhtivaks. See on suuresti tingitud majanduslikest põhjustest, kuna klassikalised viroloogilise analüüsi meetodid on üsna kallid. Lisaks muudab viroloogilisi meetodeid kasutavate uuringute kestus (nädalad), isegi kui need on üsna tõhusad, need retrospektiivseks.

Immunoloogilisi meetodeid kasutatakse nii viiruse antigeenide tuvastamiseks erinevates biosubstraatides ja keskkonnaobjektides kui ka serodiagnostikas - viiruse antigeenide vastaste antikehade tuvastamisel haigete inimeste ja laboriloomade vereseerumis. Lisaks on virioonide tuvastamiseks hädavajalikud immunoloogilised uurimismeetodid.

Organismiga suheldes põhjustavad viirused antikehade moodustumist, mis virionidele adsorbeerituna takistavad virioonide tungimist rakkudesse ja tsütopaatilise toime (CPE) arengut; neutraliseerida viiruste surmav mõju nende paljunemise ajal kana embrüotele ja loomadele; inaktiveerivad virioni hemaglutiniinid ja neuraminidaasi, hoides ära hemaglutinatsioonireaktsiooni (RGA) ja hemadsorptsioonireaktsiooni (RGad) viirusest mõjutatud rakkudel. Need viirust neutraliseerivad antikehad põhjustavad ka viiruseosakeste aglutinatsiooni ja sadenemist ning tekkivad immuunkompleksid seovad komplementi. Seetõttu kasutatakse virioonide tuvastamiseks klassikalist neutraliseerimisreaktsiooni (PH) rakukultuuridel, kanaembrüotel ja loomadel ning selle modifikatsioone: hemaglutinatsiooni inhibeerimise reaktsiooni (HITA); hemadsorptsiooni pärssimise reaktsioon (RTGads). Samu reaktsioone kasutatakse viirusnakkuste serodiagnostikas, et tuvastada patsientide seerumis viirust neutraliseerivaid antikehi vastavalt teadaolevale viirusantigeenile (diagnosticum).

Immunoelektronmikroskoopia (IEM) meetod. Elektronmikroskoopia mängib praegu viiruste uurimisel olulist rolli. Just elektronmikroskoopia andmed on viiruste kaasaegse klassifikatsiooni aluseks.

Viiruste elektronmikroskoopilise uurimise arendamise uus etapp on immunoelektronmikroskoopia tehnikate kasutamine. Seda meetodit kasutades sai võimalikuks mitte ainult viiruste otsene tuvastamine, vaid ka nende tuvastamine, samuti viirustüvede kiire serotüpiseerimine ja nende vastaste antikehade tiitrimine. IEM omandas suure tähtsuse viiruse antigeenide lokaliseerimise määramisel makroorganismi rakkudes.

IEM-i vaieldamatu eelis on selle kõrge tundlikkus võrreldes tavaliste elektronmikroskoopia meetoditega.

Kui viiruse antigeen või viiruse komponent puutub kokku homoloogse antiseerumiga, moodustub antikeha-antigeeni kompleks. See nähtus on viiruse antigeenide või nendevastaste antikehade tuvastamise ja tuvastamise tehnika aluseks. Just neid antigeenide komplekse antikehadega pärast negatiivset värvimist saab jälgida elektronmikroskoobis. Kliinilises diagnostikas ei vaja antigeenne materjal põhjalikku puhastamist. Seega, kui avastatakse gripiviirus, võib puhastamata allantoisivedelikku uurida. Praegu arvatakse, et IEM-i jaoks sobib peaaegu igasugune kliiniline materjal. Diagnostilistel eesmärkidel võib kasutada nii tavalisi fraktsioneerimata seerumeid kui ka taastusravi seerumeid. Tuleb märkida, et antigeenide ja antikehade koguste suhe mõjutab lõpptulemusi suuresti. Antigeeni liia korral täheldatakse osakeste rohkust; aglomeraate on sel juhul vähe. Antikehade ülejäägi korral on viiruseosakesed ümbritsetud nende paksu kihiga, virioni väikseid struktuurseid detaile on peaaegu võimatu paljastada; agregaate on samuti vähe. Antigeeni ja antikehade optimaalse suhte korral suurendatakse agregaate virionide üksikasjade hea pildiga. Ülaltoodud kaalutlustest lähtuvalt on soovitav kasutada immuunseerumit mitmes lahjenduses.

Tugivõrele kantakse pallaadiumist tugikile. Pallaadiumi madala kontsentratsiooni kasutamisel ja substraadi adsorptsiooniomaduste parandamiseks tugevdatakse seda süsinikuga. Selleks pihustatakse kivisüsi vaakumis elektronmikroskoopilisel võrel olevale valmis kuivale kile-substraadile. Kile-substraadi ja tugevdava süsinikukihi paksusel on oluline mõju objekti peendetailide kontrastile ja kujutisele. Substraadi kilede ja süsinikukihi spetsiifilise paksuse määrab iga teadlane individuaalselt, lähtudes sellest, et süsinik on pallaadiumist elektrooniliselt läbipaistvam.

Viirustel ja nende vastastel antikehadel on madal elektrontihedus. Seetõttu ei saa bioloogilisi objekte ilma eeltöötluseta elektronmikroskoobi abil tuvastada. Viirused visualiseeritakse negatiivse kontrasti (või negatiivse peitsi) tehnikaga. Viiruste ja viirus-antikeha komplekside negatiivseks värvimiseks kasutatakse erinevaid raskmetallide sooli. Kontrastained (raskmetalliaatomid) tungivad esemete hüdrofiilsetesse piirkondadesse ja asendavad neis vett. Selle tulemusena suureneb objekti elektrontihedus ja seda on võimalik jälgida elektronmikroskoobis.

Otsene IEM-meetod on leidnud praktikas suurima rakenduse. Viiruse suspensioon segatakse lahjendamata antiseerumiga. Pärast intensiivset segamist inkubeeritakse segu 1 tund temperatuuril

37°C, seejärel üleöö temperatuuril 4°C. Järgmisel päeval tsentrifuugitakse segu immuunkomplekside sadestamiseks. Sade resuspendeeritakse tilgakeses destilleeritud vees ja kontrasteeritakse negatiivselt.

IEM-i tulemuste hindamisel võivad antigeeni ja antikeha interaktsiooni produktid elektronmikroskoobis olla erineva välimusega (üksik viirusosake, mis on täielikult või osaliselt kaetud antikehadega; viirusosakeste aglomeraadid). Aglomeraadid võivad hõivata erineva ala, olla erineva välimusega ja sisaldada erinevat arvu osakesi. Seetõttu on lisaks eksperimentaalsetele vaja uurida ka kontrollpreparaate (puhverlahuse või heteroloogse antiseerumiga).

IEM-i abil saadud tulemuste hindamise kriteeriumiks on immuunseerumiga agregeeritud viirusosakeste klastrite olemasolu või puudumine preparaatides. Antigeeni aglomeraatide ja spetsiifiliste seerumivastaste antikehade esinemine on positiivse reaktsiooni märk. Sellegipoolest tuleks arvestada antigeeniosakeste mittespetsiifilise agregatsiooni võimalusega kiire tsentrifuugimise mõjul. Sel põhjusel soovitavad paljud autorid kaaluda tulemusi tingimuslikul skaalal 0 kuni 4+. See põhineb agregeerunud osakeste seerumi antikehadega kattuvuse astme hindamisel.

Hemaglutinatsiooni ja hemadsorptsiooni meetodid. Paljudel viirustel on võime aglutineerida rangelt määratletud imetajate ja linnuliikide erütrotsüüte. Seega aglutineerivad gripi- ja mumpsiviirused kanade, merisigade ja inimeste erütrotsüüte; puukentsefaliidi viirus - lamba erütrotsüüdid; Jaapani entsefaliidi viirused - ühepäevaste kanade ja hanede erütrotsüüdid; adenoviirused - rottide, hiirte, ahvide erütrotsüüdid. Hemaglutinatsioonireaktsiooni (HA) katsematerjalina kasutatakse allantoisi- ja amnionivedelikku, kanaembrüote koorion-allantoisi membraanide suspensiooni, viirustega nakatunud loomade raku- või elundite kultuuride suspensioone ja ekstrakte. Hemaglutinatsioonireaktsiooni saab seadistada tilgutimeetodil klaasile ja laiendatud reas katseklaasides või polüstüreenplaatide süvendites. Esimene meetod on soovituslik.

Kuna RGA on rühmaspetsiifiline, ei võimalda see viiruste liike määrata. Need tuvastatakse hemaglutinatsiooni pärssimise testi (HITA) abil. Selle valmistamiseks kasutatakse tuntud immuunsüsteemi viirusevastaseid seerumeid. Igale lahjendusele lisatakse võrdne kogus viirust sisaldavat vedelikku. Kontroll on viiruse peatamine.

Segu hoitakse termostaadis, seejärel lisatakse erütrotsüütide suspensioon. Mõni minut hiljem määratakse neutraliseeriva seerumi tiiter, s.o. selle maksimaalne lahjendus, mis põhjustas erütrotsüütide aglutinatsiooni viivituse.

Viirushaiguste seroloogilises diagnostikas soovitatakse RTHA-d kasutada paarisseerumiga, millest üks saadakse haiguse alguses, teine ​​aga 1-2 nädala pärast või kauem. Antikehade tiitri neljakordne tõus teises seerumis kinnitab kavandatud diagnoosi.

Hemadsorptsioonireaktsiooni (RGad) kasutatakse nakatunud rakukultuurides hemaglutineeriva toimega viiruse näitamiseks. Reaktsiooni olemus seisneb selles, et viiruste hemaglutineeriva toime suhtes tundlikud erütrotsüüdid adsorbeeritakse viirustega nakatunud rakkude pinnal. Näiteks kana erütrotsüüdid adsorbeeritakse variolaviirusega nakatunud rakkudele; leetrite viirus - ahvide erütrotsüüdid; adenoviirused - ahvid ja rotid jne.

Neutraliseerimisreaktsioon (PH). Rakukultuurides paljunedes põhjustavad viirused erinevat tüüpi CPD-d, mis väljenduvad ümardamises, kortsumises, raku suuruse vähenemises või, vastupidi, raku suuruse suurenemises, nende sulandumises ja sümplastide moodustumises, tsütoplasma ja tuuma hävimises. Lõpuks võivad viirustega nakatunud rakkude monokihis rakukihi teatud osade hävitamise tagajärjel tekkida steriilsed laigud või naastud, mis on viiruseosakese kloon, mis võimaldab mitte ainult viiruse isoleerimiseks, aga ka selle tiitri määramiseks.

Viirust on naastude olemuse järgi väga raske tuvastada ja seetõttu kasutavad nad isoleeritud viiruse pH määramist teadaolevate viirust neutraliseerivate seerumite abil. Selleks kogutakse patsiendilt saadud viirus rakukultuuri ja selle erinevad lahjendused segatakse lahjendamata viirusevastase seerumiga.

Viiruste ja seerumite segu võib nakatada tibude embrüoid või tundlikke loomi. Sellistel juhtudel määrab antikehade neutraliseeriva aktiivsuse kõige sagedamini viiruse hemaglutiniinide neutraliseerimine embrüo vedelikes ning viiruse surmava toime kõrvaldamine embrüotele ja loomadele. Samal ajal arvutatakse neutraliseerimisindeks, mis väljendab selle seerumiga neutraliseeritud viiruse surmavate annuste maksimaalset arvu, võrreldes kontrollkatse tulemustega, võttes ühena.

Samamoodi tuvastatakse PH abil patsientide materjalist eraldatud viirused, kui need nakatavad kana embrüoid ja loomi. Selleks lisatakse viirust neutraliseerivatele seerumitele viirust sisaldavaid embrüote vedelikke ja loomade kahjustatud elundite suspensioone. Pärast teatud inkubatsiooniaega nakatatakse rakukultuurid, tibude embrüod ja loomad segudega.

Viirusnakkuste serodiagnostikas määratakse teadaoleva viiruse viirust neutraliseerivate antikehade tiitri suurenemise dünaamika. Samal ajal määratakse PH paarisseerumiga, mis on võetud patsientidelt haiguse alguses ja lõpus. Diagnostikaks on immunoglobuliinide tiitri 4-kordne tõus neist teises.

PH põhineb spetsiifiliste antikehade võimel seonduda piisavalt tugevalt viirusosakesega. Viiruse ja antikeha vahelise interaktsiooni tulemusena neutraliseeritakse viiruse nakkuslik aktiivsus antigeensete determinantide blokeerimise tõttu, mis vastutavad viiruseosakese ühendamise eest tundlike rakkudega. Selle tulemusena kaotab viirus in vitro või in vivo tundlikus bioloogilises süsteemis paljunemisvõime.

PH tulemused ilmnevad pärast seda, kui viiruse ja selle homoloogsete antikehade segu viiakse pärast ajastatud kokkupuudet tundlikku bioloogilisse süsteemi (koerakukultuur, tibu embrüo, vastuvõtlik loomakeha), kus viirus võib paljuneda ja põhjustada mõõdetavaid muutused, mis pärsivad osaliselt või täielikult antikehade juuresolekul.

PH-s on kolm komponenti:

• 1) viirus;
• 2) antikehi sisaldav seerum;
• 3) bioloogiline objekt (laboriloomad, arenevad kanaembrüod, koekultuurid), mille valik sõltub viiruse tüübist, millega uuringuid läbi viia.

PH-d kasutatakse kas isoleeritud patogeeni tuvastamiseks või antikehade tuvastamiseks ja tiitrimiseks seerumis. Esimesel juhul kasutatakse spetsiaalselt immuniseeritud laboriloomade või taastunud inimeste seerumit. Teisel juhul kasutatakse haiguse algstaadiumis ja taastumisperioodil võetud seerumeid.

Erinevalt antihemaglutiniinidest või komplementi fikseerivatest antikehadest püsivad tervenenud inimeste seerumis leiduvad viirust neutraliseerivad antikehad mitu aastat ja mõne viirusnakkuse (näiteks leetrite) korral isegi elu. See võimaldab mõnel juhul kasutada võrdlusravimina paljude taastuvate seerumite kogumit, mis pärast ampullidesse täitmist ja lüofiliseerimist sobib diagnostiliseks tööks pikka aega.

Eraldatud patogeenide tuvastamisel kasutatakse erinevate loomade: küülikute, valgete rottide ja hiirte, merisigade, ahvide, lammaste, hobuste jne eelnevalt valmistatud hüperimmuunseerumeid. Hüperimmuunseerumi aktiivsus PH suhtes sõltub loomade immuniseerimismeetodist.

Enne iga neutraliseerimiskatset tiitritakse viirust, määrates lõpliku lahjenduse, mis põhjustab koekultuuri kahjustusi või laboriloomade (või kanaembrüo) nakatumist. Viiruse tiiter väljendatakse 50% annusena (TCID50 - 50% nakkuslik doos koekultuuri puhul).

Molekulaargeneetilised diagnostikameetodid viroloogilises praktikas. Molekulaarbioloogia meetodid töötati välja 50ndatel. XX sajand. Need said võimalikuks tänu sellele, et iga viiruse genoomis on unikaalsed liigispetsiifilised nukleotiidjärjestused, mille tuvastamisega saab tuvastada mis tahes nakkustekitaja. Need meetodid on kõige olulisemad selliste mikroorganismide tuvastamisel, mida on tavapäraste meetoditega pikaajaline või raske kasvatada. 1970. aastatel kasutati DNA sondi tuvastamist nakkustekitaja või mutatsiooni tuvastamiseks, mis põhines radioaktiivse isotoobiga (või fluorokroomiga) märgistatud spetsiifiliste oligonukleotiidsondide hübridiseerimisel eraldatud DNA prooviga. Hübridisatsioonianalüüs kasutab nukleiinhapete võimet teatud tingimustel moodustada spetsiifilisi komplekse nukleiinhapetega, mille järjestused on nendega komplementaarsed. Nakkuslike patogeenide tuvastamise meetod DNA hübridisatsiooni abil osutus äärmiselt töömahukaks, aeganõudvaks ja kulukaks. Lisaks on selle tundlikkus ebapiisav mikroorganismide tuvastamiseks kliinilistes materjalides, nagu väljaheited ja uriin.

DNA hübridisatsioon on asendatud meetodiga, mis jäljendab DNA loomulikku replikatsiooni ja võimaldab tuvastada ja korduvalt kopeerida teatud DNA fragmenti kasutades termofiilset DNA polümeraasi. Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on elegantne meetod, mis jäljendab DNA loomulikku replikatsiooni ja võimaldab tuvastada ja korduvalt kopeerida teatud DNA tükki termofiilse DNA polümeraasi abil.

Tänu oma kõrgetele diagnostilistele omadustele on PCR üldtunnustatud täiendus viroloogias kasutatavatele traditsioonilistele meetoditele: viiruse paljundamine rakukultuuris, viirusantigeenide immunoloogiline tuvastamine ja elektronmikroskoopia. Selle meetodi oluliseks eeliseks on võime tuvastada viiruseid latentsetes infektsioonides (tsütomegaloviirus, herpesviirus) ja viiruseid, mida on raske või pole veel võimalik kultiveerida (inimese immuunpuudulikkuse viirus, Epstein-Barri viirus, inimese papilloomiviirus, Vidri hepatiidi viirus). PCR-meetodiga seostatakse väljavaateid selliste haiguste nagu Creutzfeldt-Jakobi tõve, Alzheimeri tõve ja hulgiskleroosi uurimisel.

Viirushaiguste etioloogiline diagnoos viiakse läbi viroloogiliste, viroloogiliste, seroloogiliste ja molekulaargeneetiliste meetoditega. Viimaseid kolme meetodit saab kasutada ekspressdiagnostika meetoditena.

Viroloogiline diagnostika meetod.

Meetodi lõppeesmärk on tuvastada viirused liigi või seroloogilise variandi järgi. Viroloogiline meetod hõlmab mitut etappi:

1) uurimistöö materjali valimine;

2) viirust sisaldava materjali töötlemine;

3) tundlike elusüsteemide saastumine materjaliga;

4) viiruste näitamine elussüsteemides;

5) isoleeritud viiruste tiitrimine;

6) viiruste tuvastamine immuunreaktsioonides.

1. Uurimistöö materjali valik .

See viiakse läbi haiguse varases staadiumis, järgides reegleid, mis takistavad materjali saastumist võõra mikroflooraga ja meditsiinitöötajate nakatumist. Viiruse inaktiveerimise vältimiseks transpordi ajal asetatakse materjal viiruse transpordikeskkonda (VTS), mis koosneb tasakaalustatud soolalahusest, antibiootikumidest ja seerumi albumiinist. Materjali transporditakse spetsiaalses soojusisolatsiooniga konteineris ja kinnistes jää sisaldavates kilekottides. Vajadusel säilitatakse materjali temperatuuril -20˚C. Iga uuritava materjali proov tuleks märgistada ja märgistada patsiendi nime, materjali tüübi, proovide võtmise kuupäeva, üksikasjaliku kliinilise diagnoosi ja muu teabega.

Sõltuvalt haiguse olemusest võib uuringu materjal olla:

1) tampooni neelu ninaosast ja tampooni neelust;

2) tserebrospinaalvedelik;

3) väljaheited ja rektaalsed tampooniproovid;

6) vedelik seroossetest õõnsustest;

7) määrdumine sidekestalt;

8) vesiikulite sisu;

8) lõikematerjal.

Orofarünksi punetuse saamiseks kasutatakse 15-20 ml VTS-i. Patsient loputab hoolikalt VTS-i kõri 1 minuti jooksul ja kogub loputusvedeliku steriilsesse viaali.

Steriilse vatitikuga võetakse määrd neelu tagumisest osast, vajutades spaatliga keelejuurele. Tampoon asetatakse 2-3 ml VTS-i, loputatakse ja pigistatakse.

Tserebrospinaalvedelik saadakse lumbaalpunktsiooniga. 1-2 ml tserebrospinaalvedelikku pannakse steriilsesse anumasse ja toimetatakse laborisse.

Steriilsetes viaalides võetakse väljaheiteproovid 2-3 päeva jooksul. Saadud materjalist valmistatakse Hanki lahuse abil 10% suspensioon. Suspensiooni tsentrifuugitakse kiirusel 3000 p/min, supernatant kogutakse, sellele lisatakse antibiootikumid ja asetatakse steriilsesse anumasse.

Veenipunktsiooniga saadud veri mahus 5-10 ml defibrineeritakse hepariini lisamisega. Täisverd ei külmutata ja antibiootikume ei lisata. Seerumi saamiseks inkubeeritakse vereproove 37 °C juures 60 minutit.

Vedelik seroossetest õõnsustest saadakse punktsiooniga koguses 1-2 ml. Vedelik kasutatakse kohe ära või hoitakse sügavkülmas.

Konjunktiivilt võetakse steriilse tampooniga määrdumine ja see asetatakse VTS-i, misjärel materjal tsentrifuugitakse ja külmutatakse.

Vesiikulite sisu aspireeritakse õhukese nõelaga süstlaga ja asetatakse VTS-i. Materjal saadetakse laborisse kuivatatud määrdena slaididel või suletud steriilsetes kapillaarides või ampullides.

Lõikematerjal võetakse võimalikult varakult, järgides aseptika reegleid. Iga proovi kogumiseks kasutatakse eraldi steriilsete instrumentide komplekte. Valitud kudede kogus on 1-3 g, mis asetatakse steriilsetesse viaalidesse. Kõigepealt võetakse proovid ekstrakavitaarsetest elunditest (aju, lümfisõlmed jne). Enne kõhuõõne avamist võetakse rindkere koed. Saadud koeproovid jahvatatakse uhmris steriilse liiva ja steriilse naatriumkloriidi lahuse lisamisega, misjärel materjali tsentrifuugitakse. Supernatant kogutakse viaalidesse, lisatakse antibiootikumid. Viroloogiliste uuringute materjali kasutatakse koheselt või säilitatakse -20°C juures.

2. Viirust sisaldava materjali töötlemine.

Seda tehakse selleks, et vabastada materjal kaasnevast bakteriaalsest mikrofloorast. Selleks kasutatakse füüsikalisi ja keemilisi meetodeid.

Füüsilised meetodid:

1) filtreerimine läbi erinevate bakterifiltrite;

2) tsentrifuugimine.

Keemilised meetodid:

1) materjali töötlemine eetriga superkapsiidita viiruste isoleerimisel;

2) heptaani ja freooni segu lisamine materjalile;

3) antibiootikumide kasutuselevõtt (penitsilliin - 200-300 U / ml; streptomütsiin - 200-500 μg / ml; nüstatiin - 100-1000 U / ml).

3. Tundlike elusüsteemide nakatamine materjaliga.

1) laboriloomad;

2) kanaembrüod;

3) elundikultuurid;

4) koekultuur.

laboriloomad. Kasutatakse valgeid hiiri, merisigu, hamstreid, küülikuid jne Valged hiired on kõige tundlikumad paljude viirustüüpide suhtes. Loomade nakatumise viisi määrab viiruse tropism kudede suhtes. Infektsiooni ajus kasutatakse neurotroopsete viiruste (marutaudiviirused, polioviirused jne) isoleerimiseks. Intranasaalne infektsioon viiakse läbi hingamisteede infektsioonide patogeenide eraldamisel. Laialdaselt kasutatav intramuskulaarne, intravenoosne, intraperitoneaalne, subkutaanne ja muud infektsioonimeetodid. Haiged loomad surmatakse eetriga, avatakse ning organitest ja kudedest võetakse materjal.

kana embrüod. Laialdaselt saadaval ja hõlpsasti kasutatav. Kandke kana embrüoid vanuses 5 kuni 14 päeva. Enne nakatumist tehakse kanaembrüod ovoskoopiga: määratakse nende elujõulisus, märgitakse koorele õhukoti piir ja embrüo asukoht (embrüo “tume silm”). Kanaembrüotega töötamine toimub steriilses kastis steriilsete instrumentidega (pintsetid, süstlad, käärid, odad jne). Pärast teose fragmendi valmimist kastetakse instrumendid 70% etüülalkoholi ja põletatakse enne järgmist manipuleerimist. Enne nakatumist pühitakse kana embrüo kest põleva alkoholiga tampooni ja alkoholi joodilahusega. Embrüosse süstitava uuritava materjali maht on 0,1-0,2 ml. Viiruste eraldamiseks ühest materjalist kasutatakse vähemalt 4 tibu embrüot.