Studija biomaterijala IF metodom. ELISA test krvi - opis metode, prednosti i nedostaci, interpretacija rezultata. Indikacije za analizu

Trenutno se koristi veliki broj različitih sorti i modifikacija ELISA-e. Različite varijante enzim-vezanog imunosorbentnog testa (ELISA) postale su široko rasprostranjene.

ELISA u čvrstoj fazi je predložena 1971. Osnovni principi čvrste faze ELISA, bez obzira na modifikacije, su sljedeći:

• 1. U 1. fazi reakcije, antigeni ili antitela se adsorbuju na čvrstu fazu. U ovom slučaju, reagensi koji nisu vezani za čvrstu fazu lako se uklanjaju ispiranjem.
• 2. Test uzorak se inkubira u senzibiliziranim jažicama. Pozitivne kontrolne jažice sadrže standardne reagense. U tom slučaju na površini čvrste faze nastaju imuni kompleksi. Nevezane komponente se uklanjaju pranjem.
• 3. Kada se doda antitijelo-enzim ili konjugat antigen-enzim i veže se za imobilizirani imuni kompleks, aktivno mjesto enzima ostaje dostupno za naknadnu interakciju sa supstratom. Inkubacija supstrata u jažice sa imobilisanim konjugatom dovodi do razvoja reakcije boje. Ova reakcija se može zaustaviti u željenoj fazi, težina bojenja se može procijeniti vizualno ili optičkom gustoćom. Važan korak u bilo kojoj varijanti analize čvrste faze je postupak ispiranja nevezanih reagensa. Važno je ne samo isprati komponente pričvršćene na čvrstu fazu, već i ukloniti reagense iz cijele dubine sloja. Uzorci se mogu ispirati automatski sa mašinom za pranje ili ručno sa višekanalnom pipetom. Za provođenje ELISA testa potrebno je:
  • · koriste se polistirenske tablete ili druge opcije čvrste faze;
  • otopina za pranje;
  • konjugat (antigeni ili antitela obeleženi enzimima);
  • mješavina korištenih supstrata;
  • stop rastvor (Stop reagens - rastvor za zaustavljanje reakcije);
  • Uzorci koji se koriste za pozitivnu i/ili negativnu kontrolu;
  • standardni antigen (za izgradnju kalibracione krive);
  • jednokanalne i višekanalne pipete;
  • · perilica;
  • optički uređaj za određivanje optičke gustine test rastvora (ELISA čitač, čitač koji sekvencijalno fotometrira sve jažice);
  • · 5-100 µl proučavanog biološkog materijala.

Direktna ELISA

1. Antigeni ili antitela (test materijal) se adsorbuju u jažice panela. Često u direktnoj ELISA-i, antigen imobiliziran na čvrstoj fazi su ćelije i drugi antigeni u obliku čestica.

Kontrola. Kao kontrola koriste se jažice sa adsorbovanim uzorkom pozitivne kontrole, koji obavezno sadrži željeni antigen, i negativni kontrolni uzorak, koji očigledno ne sadrži test antigen. U prisustvu pročišćenog standardnog antigena, reakcija se izvodi u nekoliko razblaženja tako da se može konstruisati kalibraciona kriva.

• 2. „Blokirajte slobodna mjesta vezivanja koja su ostala na čvrstoj fazi sa kazeinom BSA, itd. (da spriječite nespecifičnu sorpciju konjugata na čvrstoj fazi).
• 3. Enzimima obeležena antitela ili antigeni (konjugat) se dodaju u jažice i inkubiraju. Vezivanje konjugata za čvrstu fazu će se desiti samo ako su obe komponente sistema komplementarne. Nakon inkubacije s konjugatom, jažice se isperu, čime se uklanja nevezani dio konjugata.

• 4. Supstrat specifičan za korišćeni enzim se zatim dodaje u jažice i inkubira. Kada se postigne optimalni nivo bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija enzima se zaustavlja.
• 5. Obračunavanje reakcije. Prvo se vizualno uzimaju u obzir rezultati reakcije. Za precizniji prikaz rezultata, intenzitet bojenja se procjenjuje na ELISA čitaču s odgovarajućim svjetlosnim filterom. Na osnovu rezultata analize izgrađen je graf zavisnosti optičke gustoće od koncentracije. ELISA apsorpciona imobilizacija antitijela
• a) za otkrivanje antigena; b) za otkrivanje antitela.

Indirektna ELISA.

Ova varijanta ELISA obično se koristi za otkrivanje specifičnih antitijela. Standardni antigen se adsorbuje u jažice panela i inkubira sa uzorcima seruma ili drugog biološkog materijala dobijenog od pacijenta (likvor, pljuvačka, itd.). Specifična antitela vezana za antigen na čvrstoj fazi detektuju se upotrebom antiglobulinskog konjugata. U zavisnosti od svrhe analize, koriste se različiti antiglobulinski reagensi koji otkrivaju antitela svih izotipova, ili specifična za pojedine klase i podklase imunoglobulina. Glavna prednost metode je univerzalnost konjugata. Isti konjugat se može koristiti za otkrivanje ljudskih antitijela na širok spektar antigena u bilo kojem uzorku. Reakcija je metodički jednostavna.

Glavne faze indirektne ELISA za otkrivanje antitijela:

• 1. Antigen se adsorbuje na čvrstoj fazi, a zatim ispere sa nevezanih komponenti.
• 2. Blokirajte slobodne vezne stranice. Opran.

• 3. Ispitni materijal se dodaje u jažice, inkubira i zatim ispere. Paralelno se stavljaju uzorci sa pozitivnim i negativnim kontrolama.
• 4. Dodati antiglobulinski konjugat u radnom razblaženju, inkubirati, isprati nevezane komponente.
• 5. Podloga se unosi, inkubira. Nakon postizanja optimalnog nivoa bojenja u jažicama pozitivne kontrole, reakcija se zaustavlja dodavanjem stop rastvora.
• 6. Izmjerite količinu produkta reakcije na ELISA čitaču.

U optimalnim uslovima ispitivanja, metoda je vrlo specifična i osjetljiva. Omogućava vam da otkrijete nanogramske količine antitijela u serumu ispitivanih pacijenata. Za postizanje zadovoljavajućih rezultata neophodna je standardizacija reagensa i metodologija. Ova varijanta ELISA se takođe može koristiti za testiranje monoklonskih antitela.

"Sendvič" - varijanta ELISA za detekciju antigena.

Antigeni otkriveni korištenjem ove ELISA varijante moraju imati nekoliko epitopa sposobnih da vežu antitijela, ili moraju imati ponovljene, prostorno odvojene epitope iste specifičnosti.

Prilikom izvođenja ove varijante ELISA-e, visoko specifična poli- ili monoklonska antitijela adsorbirana na čvrstoj fazi se inkubiraju sa test uzorkom. Nakon postupka ispiranja, u jažice se dodaju enzimski obilježena antitijela (konjugat) na isti antigen, a zatim se sprovode sve ostale faze reakcije. Efikasnost formiranja specifičnog kompleksa u svakoj fazi analize zavisi od konstante vezivanja reakcije antigen-antitelo.

Glavne faze analize:

• 1. Monoklonska antitijela ili afinitetno pročišćena poliklonska antitijela su imobilizirana na čvrstoj fazi.
• 2. Test uzorak se unosi u jažice panela, uzorak pozitivne kontrole i negativan kontrolni uzorak se stavljaju paralelno u različitim razblaženjima. Inkubirano i oprano.
• 3. Enzimima obeležena monoklonska ili poliklonska antitela (konjugat) se dodaju u jažice. Pranje se vrši nakon inkubacije.
• 4. Podloga se unosi, inkubira. Reakcija se zaustavlja kada se postigne optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.
• 5. Obračun rezultata na ELISA čitaču.

Glavna prednost metode je njena visoka osjetljivost, koja prevazilazi mogućnosti drugih ELISA shema.

Competitive ELISA.

Ova opcija analize zasniva se na konkurenciji obeleženih (konjugat) i neobeleženih (test) antitela za vezivanje za antigen adsorbovan na čvrstoj fazi. Količina enzima vezanog za čvrstu fazu smanjit će se proporcionalno sadržaju slobodnih antitijela u smjesi. Za određivanje antigena koristi se ista opcija, ali se u ovom slučaju željeni antigen natječe sa obilježenim, standardnim antigenom za vezivanje za antitijela imobilizirana na površini čvrste faze.

Konkurentska metoda zahtijeva minimalan broj operacija, nisku potrošnju reagensa i može se lako automatizirati. Kada se provodi kompetitivna ELISA za detekciju antitijela, bolje je koristiti označena monoklinska antitijela, tada se konkurencija konjugata sa test uzorkom javlja za jedan epitop antigena adsorbiranog na čvrstoj fazi. Ova ELISA varijanta se koristi za određivanje različitih jedinjenja, kao što su humani imunoglobulini, kancer-embrionalni antigen, insulin, itd. Omogućava otkrivanje antitela na dijagnostički značajne epitope infektivnih agenasa.

Glavne faze analize za otkrivanje antigena:

• 1. Monoklonska antitela specifična za antigen koji se detektuju imobilizuju se na čvrstoj fazi.
• 2. Dodajte antigen označen enzimom i test uzorak u poznatoj koncentraciji u jažice panela. Izvršite inkubaciju i pranje. Paralelno, pozitivne i negativne kontrole se postavljaju u susjedne jažice. Za izgradnju kalibracije koristeći standardni neobilježeni antigen u različitim razrjeđenjima.
• 3. Dodajte supstrat, inkubirajte, zaustavite reakciju kada se razvije optimalno bojenje u jažicama pozitivne kontrole.
• 4. Obračunavanje reakcije na ELISA čitaču.

U ovom slučaju, količina antigena u uzorku za testiranje je obrnuto proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

inhibitorna ELISA.

U ovoj varijanti ELISA, antigen prisutan u uzorku za testiranje vezuje se za monoklonska antitela obeležena enzimima i inhibira njihovu interakciju sa standardnim antigenom imobilisanim na čvrstoj fazi. Prisustvo u uzorku čak i tragova antigena specifičnog za konjugat će inhibirati vezivanje obilježenih antitijela za imobilizirani antigen. Stepen inhibicije je direktno proporcionalan sadržaju antigena u rastvoru. Za kvantitativnu analizu, kalibraciona kriva se gradi korišćenjem serijskih razblaženja standardnog antigena. Glavne faze inhibitorne ELISA za detekciju antigena (slika 6).

• 1. Adsorbirajte standardni antigen u jažice panela. Odaberite radno razrjeđenje označenih antitijela titracijom.
• 2. Konjugat je prethodno inkubiran na radnom razblaženju sa razblaženjima test uzorka, standardnog antigena i pozitivnih kontrolnih uzoraka.
• 3. Smjesa se prenosi u otvore panela. Da bi se kontrolisalo 100% vezivanje, samo obeležena antitela se dodaju u nekoliko jažica, bez inhibitornog antigena. Paneli se inkubiraju, a zatim peru.
• 4. Dodajte supstrat.
• 5. Zabilježite rezultate.

Koncentracija antigena koja se treba odrediti u uzorku za testiranje obrnuto je proporcionalna enzimskoj aktivnosti na čvrstoj fazi.

ELISA se može koristiti ne samo za određivanje rastvorljivog antigena ili antitijela, već i stanica koje proizvode različite proteine.

Enzimska imunofarba metoda (ELISPOT).

1983. ELISA tehnologija je prilagođena za otkrivanje limfoidnih ćelija koje luče antitela ili antigene (npr. citokine) in vitro. Metoda se zove ELISPOT (enzimski imunotest ili spot metoda). Glavni princip metode:

• 1. Na površini polistirenske jažice (koristeći ploče za ćelijsku kulturu sa 24 jažice) adsorbuju se antigeni ili antitela, koja služe kao reagensi za „hvatanje“.
• 2. Dodaju se proučavane limfoidne ćelije, kultivisane nekoliko sati na 37°C, dajući im mogućnost da zauzmu određeno mesto i vrše sekretornu funkciju. Antitijela ili antigeni koje luče takve ćelije hvataju se reagensima adsorbiranim na čvrstoj fazi.
• 3. Ćelije se uklanjaju pomoću rastvora za pranje sa deterdžentom za liziranje ćelija.
• 4. Mesta akumulacije sekretornih produkata prikazana su dodavanjem antitela povezanih sa enzimom (antiglobulinski reagens).
• 5. Doda se mješavina supstrat-agaroza (korišteni supstrati se moraju otopiti u agarozi i formirati nerastvorljive produkte reakcije), na površini čvrste faze se formiraju smeđe ili plave mrlje (u zavisnosti od upotrijebljenih enzima i supstrata), otkrivajući područja gdje se stanice nalaze. bili locirani.
• * Dobijene mrlje se broje pod mikroskopom, to će biti broj ćelija koje luče.

Nitrocelulozna membrana se može koristiti kao čvrsta faza.U ovom slučaju postoji niz prednosti: zbog visokog adsorpcionog kapaciteta NCM-a potrebna je znatno manja količina antigena koji se koristi kao reagens za „hvatanje“, osim toga, nema potrebe za uključivanjem agaroze u supstrat.

Istovremenim određivanjem broja sekretirajućih ćelija i ukupne količine izlučenog antigena ili antitijela u jažici, što je moguće pri korištenju drugačijeg supstrata, moguće je odrediti količinu izlučene tvari po jednoj ćeliji.

Ova metoda je našla široku primjenu za procjenu broja ćelija koje luče antigen zarobljen adsorbovanim antitelima, koristi se za određivanje broja ćelija koje luče citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-y, TNF-a) .

Sistemi za pojačavanje signala.

Kada se koriste antitijela visokog afiniteta, osjetljivost pojedinačnih varijanti ELISA je vrlo visoka i teoretski omogućava otkrivanje pojedinačnih molekula antigena, ali u praksi je osjetljivost ograničena brojnim faktorima: aktivnost enzima, intenzitet signala i metode obračuna signala. . Sistemi za pojačavanje signala omogućavaju povećanje osjetljivosti različitih ELISA varijanti. Razmotrite neke od ovih sistema:

Zasnovan na interakciji avidin-biotin.

Molekuli biotinskog koenzima (m.m. 244 Da) konjugiraju se s antitijelima korištenjem biotinil-N-hidroksisukcimida. Mali molekul biotina se lakše vezuje za imunoglobulin ili drugi protein bez narušavanja njegovih imunoloških ili enzimskih svojstava. Enzim je u ovom slučaju vezan za glikoprotein bjelanjka avidin. Afinitet vezivanja avidina za biotin je vrlo visok (konstanta disocijacije kompleksa je 10-15 mol), konjugat avidin-enzim je čvrsto fiksiran na kompleksu antigen-antitijelo-biotin. Nakon dodavanja odgovarajućeg supstrata, produkt reakcije se određuje spektrofotometrijski ili intenzitetom luminiscencije.

Jedna molekula avidina sastoji se od četiri identične podjedinice i može stupiti u interakciju sa četiri molekula biotina, što mu omogućava da se koristi kao molekul za povezivanje između dva spoja koji sadrže biotin. U ovom slučaju, enzim je također biotiniliran, a avidin djeluje kao most, povezujući dva molekula koji sadrže ostatke biotina. Rezultirajućem kompleksu antigen-antitijelo-biotin dodaje se slobodni avidin, a zatim biotinilirani enzim. Snimite reakciju.

Protein avidin se može nespecifično sorbirati na drugim molekulima; stoga se sve više koristi drugi protein koji vezuje biotin, streptavidin, koji se nalazi u bakteriji Streptomyces avidinii. Streptavidin takođe formira jak kompleks sa biotinom i sastoji se od četiri identične podjedinice.

Upotreba avidin-biotin kompleksa omogućava značajno povećanje osjetljivosti ELISA-e, budući da se desetine molekula biotina mogu vezati za jedan AT molekul tokom sinteze konjugata. Dobivanje konjugata (antitijela i enzima s biotinom) je prilično jednostavno i praćeno je minimalnim promjenama njihove imunološke i enzimske aktivnosti. Konjugati enzima sa biotinom mogu se koristiti kao univerzalni reagensi.

Upotreba hemiluminiscentnih reakcija.

Hemiluminiscentne reakcije se mogu koristiti za dobijanje signala u ELISA testu, uz povećanje osetljivosti metode i skraćivanje vremena analize. Peroksidaza hrena se široko koristi kao oznaka u ELISA testu, a različite hemiluminiscentne reakcije se također mogu koristiti za njeno otkrivanje. Hemiluminiscentne reakcije temelje se na sposobnosti luminola da svijetli kada se oksidira vodikovim peroksidom. U direktnoj analizi, enzimska reakcija proizvodi vodikov peroksid i oksidira luminol; ovu reakciju katalizira peroksidaza hrena. Da bi se pojačao signal, koriste se različiti spojevi, na primjer, luciferin, fenoli, u ovom slučaju se intenzitet luminiscencije povećava 10-100 puta, u nekim slučajevima i 500 puta (pojačana hemiluminiscentna analiza). Luminescentni signal je vrlo stabilan, njegov nivo dostiže maksimum za 30 s (za poređenje: reakcija u boji sa OPD kao indikatorom se u potpunosti razvija tek za 30 min).

U indirektnoj analizi sa luminolom ili njegovim derivatima, antitijelo se obilježava. Takva oznaka u slobodnom stanju može se oksidirati vodikovim peroksidom uz oslobađanje svjetlosti. Ako je formirao kompleks, gubi sposobnost oksidacije.

Zasnovan na kaskadnim sistemima.

Da bi se povećala osetljivost ELISA, mogu se koristiti enzimski kaskadni sistemi. U ovom slučaju, prvi enzim vezan za antitijela rezultira reducibilnim supstratom za drugi enzimski sistem. Drugi enzimski sistem može biti supstrat-ciklični ili redoksiciklični. U ovom slučaju, fosfo-glukoizomeraza, aldolaza, alkalna fosfataza mogu poslužiti kao oznake enzima. Konačni produkt reakcije se određuje vizualno ili spektrofotometrijski.

ELISA sistemi amplifikacije postižu visoku osjetljivost. Takvi ELISA sistemi se koriste za određivanje nivoa hormona.

Enzimski imunosorbentni test (ELISA) provodi se za sveobuhvatnu procjenu zaštitnih funkcija tijela. Tokom studije utvrđuje se broj i svojstva imunih ćelija, prisustvo potrebnih antitijela. ELISA test krvi se radi za dijagnosticiranje infektivnih, hematoloških, autoimunih bolesti, primarnih i sekundarnih imunodeficijencija. Razmotrite šta je test krvi pomoću ELISA-e i koje indikacije postoje za ovu studiju.

Šta je to

ELISA test krvi je laboratorijska metoda koja otkriva antitijela ili antigene u uzorku krvi. Ova studija se koristi za otkrivanje nivoa imunoglobulina, imunoloških kompleksa, hormona.

Indikacije za analizu

Za imenovanje ELISA testa krvi postoje sljedeće indikacije:

• dijagnoza spolno prenosivih infekcija - ureaplazma, mikoplazma, klamidija, trihomonas, sifilis;
• dijagnostika virusnih bolesti - citomegalovirus, herpes, hepatitis, Epstein-Barr virus;
• određivanje nivoa hormona;
• dijagnostika onkoloških bolesti;
• utvrđivanje imunodeficijencije;
• dijagnosticiranje alergija;
• preoperativni sveobuhvatni pregled prije transplantacije organa;
• procjena efikasnosti terapije.

Princip metode

Princip rada metode enzimskog imunoeseja zasniva se na određivanju specifičnih proteina-antitijela u krvi - imunoglobulina. Imunoglobuline proizvodi ljudski imuni sistem kada antigeni (strani mikroorganizmi) uđu u tijelo. Ovi imuni molekuli se vežu za razne infektivne agense u tijelu i neutraliziraju ih.

Imunoglobulini imaju važnu karakteristiku – specifičnost. Zbog toga se mogu vezati za specifični antigen, formirajući kompleks antigen-antitijelo. Tokom ELISA testa krvi, ovaj kompleks se određuje kvalitativno i kvantitativno.

Postoji pet klasa imunoglobulina. Ali obično se definišu tri klase - imunoglobulini A, M, G. Ova antitela se akumuliraju u telu u različito vreme od trenutka infekcije.

• Imunoglobulini klasa M (IgM) pojavljuju se u krvi najprije petog dana od trenutka infekcije. U tijelu su 5-6 sedmica, a zatim nestaju iz krvotoka. IgM antitela ukazuju na akutni period bolesti ili pogoršanje bolesti u njenom hroničnom toku.
• Otprilike 3-4 sedmice nakon infekcije, imunoglobulini se pojavljuju u krvi klasa G (IgG). Mogu postojati u ljudskoj krvi nekoliko mjeseci ili čak godina. Prema dekodiranju ELISA testa krvi, ako se u dva uzorka krvi uzetih uzastopno dvije sedmice kasnije poveća količina IgG imunoglobulina, govore o trenutnoj infekciji ili reinfekciji - ponovnoj infekciji istom infekcijom.
• Imunoglobulini klasa A (IgA) mogu se otkriti ovom metodom istraživanja 2-4 sedmice nakon infekcije ili egzacerbacije zarazne bolesti. Od toga samo 20% cirkuliše u krvi, ostatak luče sluzokože. IgA antitijela nestaju iz krvotoka 2-8 sedmica nakon uništenja infektivnih agenasa. Nestanak ovih imunoglobulina znači lijek za infekciju. Ako se nakon prestanka bolesti utvrdi prisustvo IgA antitijela u krvi, onda je bolest prešla u hroničnu fazu.

Priprema za analizu

Ljudska krv se najčešće koristi za provođenje ELISA testa krvi. Ali možete pregledati i sadržaj staklastog tijela, cerebrospinalne tekućine, amnionske tekućine.

Uzorak krvi za istraživanje uzima se od pacijenta iz kubitalne vene. Preporučuje se davanje krvi na prazan želudac (od trenutka posljednjeg obroka treba proći najmanje 12 sati). Potrebno je reći ljekaru da li pacijent uzima lijekove, jer neki od njih mogu promijeniti rezultat analize. Na pouzdanost rezultata studije utiče upotreba alkohola i droga.

Dešifrovanje

Forma rezultata ove analize pokazuje pozitivan (+) ili negativan (-) rezultat za svaku klasu imunoglobulina.

Razmotrite tumačenje mogućeg dekodiranja ELISA testa krvi.

• Negativan rezultat IgM, IgG, IgA - nedostatak imuniteta na infekciju.
• Negativan IgM, IgA i pozitivan IgG rezultat - imunitet nakon infekcije ili vakcinacije.
• Negativni ili pozitivni IgG, IgA i pozitivni IgM je akutna infekcija.
• Pozitivan rezultat IgM, IgG, IgA je egzacerbacija hronične zarazne bolesti.
• Negativan rezultat IgM i negativan ili pozitivan rezultat IgG, IgA je kronična infekcija.
• Negativan IgM rezultat i nema IgG, IgA - oporavak.

Prednosti metode

ELISA test krvi ima mnoge prednosti. Mogu se razlikovati glavne:

• relativno visoka tačnost (osetljivost);
• mogućnost rane dijagnoze;
• sposobnost praćenja dinamike zaraznog procesa;
• visok nivo unifikacije, što omogućava masovna istraživanja;
• kratak vremenski period potreban za dobijanje rezultata analize;
• udobnost u radu;
• automatizacija svih faza analize;
• relativno niska cijena.

Nedostaci

Nedostatak ELISA metode je što ponekad daje lažno negativne ili lažno pozitivne rezultate. Uz tehničke greške tokom istraživanja, uzrok lažnih rezultata može biti i reumatoidni faktor kod pacijenta, prisustvo hroničnih bolesti (kod kojih se stvaraju antitijela), poremećaji metabolizma i uzimanje određenih lijekova.

• ascariasis;
• trihineloza - analiza se provodi nekoliko puta, maksimalni nivo antitijela se određuje 4-12 tjedana nakon infekcije;
• cisticerkoza;
• tenijaza;
• fascioliaza - antitijela se određuju u akutnoj fazi bolesti;
• opisthorhijaza - provesti diferencijalnu dijagnozu između kroničnih i akutnih oblika bolesti;
• giardijaza;
• visceralna i kožna lišmanijaza;
• amebijaza;
• toksoplazmoza.

4.2 4.20 od 5 (5 glasova)

Lista standardnih dijagnostičkih mjera koje se koriste za zarazne bolesti uključuje enzimski imunotest. Ako je ELISA za sifilis pozitivna, nemojte odmah paničariti.

Razmotrimo detaljnije karakteristike ove istraživačke tehnike i principe za dešifrovanje rezultata dobijenih u različitim kategorijama pacijenata.

Enzimski imunotest je jedna od najčešćih metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti. Spada u kategoriju treponemskih testova, odnosno može se koristiti za utvrđivanje prisutnosti u tijelu pacijenta uzročnika sifilisa - blijede treponeme.

ELISA-om se otkriva sifilis zbog otkrivanja antitijela na treponemu. Oni se nalaze u krvi pacijenta, a njihova vrsta i količina ovise o stadiju i obliku bolesti, što vam omogućava da dobijete važne informacije o trenutnom stanju zdravlja ljudi.

Prednosti i nedostaci

ELISA se vrlo često propisuje kod sumnje na sifilis ili druge zarazne bolesti. To je zbog činjenice da vam analiza omogućava da se identificira tačan tip i stadij bolesti, a njegova pouzdanost ostaje na visokom nivou - vjerojatnost greške na temelju rezultata višestrukih studija iznosi samo 1%, primarna ELISA ima tačnost od oko 90%.

Upotreba visokokvalitetnih reagensa i moderne opreme omogućava nam da maksimalno povećamo točnost indikatora.

Općenito, prednosti metode su:

1. Visoka tačnost rezultata. Vjerovatnoća primanja lažnih podataka je vrlo mala.
2. Minimiziranje ljudskog faktora uticaja. Moderna oprema za provođenje ELISA-e isključuje ljudski utjecaj na rezultate studije zbog automatizacije procesa.
3. Detekcija specifičnih antitijela. Nemoguće je pobrkati antigene jedne vrste s drugima, pa analiza pokazuje tačan rezultat za određenu dijagnozu.
4. Ispravljanje najmanjih odstupanja od norme. Čak i najmanja koncentracija patoloških agenasa neće proći nezapaženo.

Ne zaboravite na slabosti ove metode. ELISA ima sljedeće nedostatke:

1. Visoka cijena. Visoka cijena je posljedica mnogih faktora, posebno potrebe za dobrom opremom, visokokvalitetnim reagensima i stručnjacima s dovoljnim nivoom obuke.
2. Potreba za preliminarnom dijagnozom. Morate znati koje antigene tražiti, jer bez dodatnih podataka neće biti moguće postaviti tačnu dijagnozu.
3. Vjerovatnoća lažno pozitivnog rezultata. Neka tjelesna stanja i drugi faktori mogu iskriviti konačne podatke.

Indikacije za provođenje

Liječnik može propisati enzimski imunotest za dijagnosticiranje ne samo sifilisa, već i niza drugih zaraznih bolesti.

Ako uzmemo u obzir situaciju direktno sa infekcijom treponeme, razlog za pregled može biti:

• pojava vanjskih simptoma bolesti (šankr, sifilički osip, guma, itd.);
• značajno smanjenje imuniteta;
• identifikacija ili sumnja na sifilis kod seksualnog partnera, rođaka i članova porodice;
• pozitivna reakcija tokom drugih testova;
• prepoznavanje drugih bolesti koje mogu biti povezane sa sifilisom;
• lična želja osobe da bude ispitana.

Metode izvođenja

ELISA se može provesti na različite načine. U svakom slučaju odabire se najprikladnija opcija.

Prije svega, postoji podjela metoda na:

1. Kvalitativno. Otkriva se prisutnost infekcije ili virusa u tijelu pacijenta.
2. Kvantitativno. Određuje koncentraciju antitijela na patogeni agens u ljudskom tijelu, što ukazuje na stadij i intenzitet razvoja bolesti.

Postoji i klasifikacija metoda za provođenje ELISA-e prema principu reprodukcije potrebne reakcije.

Postoje 3 opcije:

1. Pravo. Obilježena antitijela se ubrizgavaju u priložene uzorke krvi.
2. Indirektno sa antigenima. Adsorbirani antigeni se preliminarno stavljaju u ćelije polistirenske ploče namijenjene za ELISA. Zatim im se dodaju antitijela virusa, što izaziva stvaranje imunoloških kompleksa potrebnih za daljnju procjenu rezultata.
3. Indirektno sa antitelima. Kod spolno prenosivih bolesti ova metoda se često koristi. Uključuje preliminarnu sorpciju antitijela, tek onda se antigeni dodaju na ploču.

Pravila uzorkovanja materijala

Kako bi se smanjili rizici od dobijanja lažnih rezultata, potrebno je pravilno darovati krv za analizu.

Prije podvrgavanja ELISA testu, moraju se poštovati neka ograničenja:

• izbjegavajte intenzivan fizički i emocionalni stres;
• prestati pušiti i piti alkohol najmanje 1 do 3 dana unaprijed;
• nekoliko dana morate prijeći na pravilnu prehranu;
• poželjno je da žene kontroliraju fazu menstrualnog ciklusa, jer hormoni mogu iskriviti rezultate;
• poslednji obrok treba da bude 8-10 sati pre davanja krvi;
• 10 dana, lijekovi koji mogu utjecati na rezultate studije su isključeni.

Za ELISA, venska krv se uzima iz kubitalne vene, mora se uzeti ujutro na prazan želudac. Općenito, primjenjuju se standardna pravila za pripremu za uzimanje uzoraka venske krvi. U zavisnosti od prisustva bolesti koja se testira, mogu se uvesti dodatni zahtjevi za preliminarnu pripremu pacijenta.

Metodologija

Upute za provođenje ELISA-e su prilično jednostavne:

1. Pacijent uzima krv iz vene.
2. Uzeti materijal se priprema i dijeli na uzorke na posebnoj paleti s finim mrežama.
3. Antigeni se miješaju sa antitijelima prema odabranoj metodi.
4. Reakcija se procjenjuje. Uzorci se upoređuju sa kontrolnim uzorcima, vrši se kvalitativna i kvantitativna procjena rezultata.
5. Podaci se unose u posebnu tabelu uz primjenu kvantitativnih indikatora (ukupna antitijela).
6. Liječnik dešifruje rezultate. Ako je potrebno, propisuje se odgovarajući tretman.

Nakon pregleda pacijentu se daje dokument sa rezultatima. Ima oblik tablice s odgovarajućim oznakama nasuprot svake vrste imunoglobulina na raskrižju s nazivima zaraznih bolesti.

Dešifrovanje

Samo stručnjak će moći ispravno dešifrirati rezultate analiza. Teško je sami odgonetnuti, na primjer, šta znači rezultat ELISA k = 1 4. Sifilis se može javiti i u različitim oblicima, što takođe utiče na konačne podatke.

Rezultati ukazuju na 3 vrste imunoglobulina:

1. IgM. Dozvolite da se odredi period infekcije sifilisom. Pozitivan rezultat ukazuje na pogoršanje bolesti. Njihov nedostatak može ukazivati ​​na remisiju kroničnih patologija ili latentni oblik bolesti.
2. IgA. Označava bolest koja je od infekcije prošlo više od mjesec dana. To je također znak akutne faze bolesti, kako sa običnim patologijama, tako i sa uznapredovalim hroničnim.
3. IgG. To je znak vršnog perioda bolesti, odnosno njenog pogoršanja. Kod sifilisa se pozitivna reakcija pojavljuje neko vrijeme nakon liječenja. Kod nekih vrsta bolesti može biti znak razvijenog imuniteta.

Te tvari tijelo proizvodi određenim redoslijedom, što je dodatni znak bolesti. Kvalitativnim testovima utvrđuje se samo prisustvo imunoglobulina u krvi svake vrste.

To se izražava u promjeni boje materijala uključenih u analizu. Kvantitativni pokazatelji su pomoćni, oni preciznije opisuju situaciju. Odnos antigena i antitela ukazuje na težinu bolesti i intenzitet odgovora organizma.

Šta da radim

Ako pacijent stvarno ima sifilis, pozitivna ELISA se apsolutno uvijek otkriva, nemoguće je ne primijetiti prisutnost treponema u takvoj studiji. Ne očajavajte, bolest dobro reagira na liječenje, posebno u početnim fazama.

Šta učiniti ako je rezultat testa pozitivan:

• podvrgnuti dodatnim pregledima prema indikacijama ljekara;
• uzeti kurs antibiotske terapije prema odabranoj shemi;
• fokus na jačanje imunološkog sistema;
• obavijestite svog seksualnog partnera o bolesti;
• ubuduće redovno podvrgnuti preventivnoj dijagnostici do odjave u ambulanti (nakon 5 godina u nedostatku pozitivnih rezultata testa).

Nema potrebe odgađati bolovanje i plašiti se objavljivanja rezultata. Dijagnoza je šifrirana i ostaje tajna, samo ako postoji opasnost od zaraze drugih osoba, potrebno je o problemu obavijestiti rodbinu i seksualnog partnera kako bi se podvrgli potrebnim pregledima.

Lažno pozitivan rezultat i njegovi uzroci

Ponekad se bilježe rezultati drugih testova i ELISA je lažno pozitivna na sifilis. Zato je preporučljivo provesti 2-3 pomoćne metode i nakon nekog vremena ponoviti enzimski imunotest.

Takve nepreciznosti su rijetke, uglavnom su posljedica sljedećih faktora:

• trudnoća;
• hronične bolesti;
• nedavna vakcinacija;
• povreda.

Lažno pozitivni rezultati se dijele na akutne i kronične, ovisno o prirodi faktora koji ih je izazvao.

Glavni su predstavljeni u tabeli:

U prisustvu takvih zdravstvenih problema, test na sifilis može pokazati pozitivan rezultat, ali to je samo posljedica proizvodnje proteina u tijelu za borbu protiv bolesti. Međutim, ELISA ih prepoznaje kao antigene.

Zdravo dijete do jedne i pol godine može imati lažno pozitivne rezultate ELISA-e ako je žena bila zaražena sifilisom tokom trudnoće. Prije ove dobi, krv još nema vremena da se potpuno obnovi, pa u njoj mogu biti prisutna majčina antitijela. Izuzetak je situacija s otkrivanjem IgM imunoglobulina.

Više o značajkama enzimskog imunoeseja i njegovoj metodologiji možete saznati gledajući video u ovom članku.

ELISA ili enzimski imunotest je moderan način određivanja mnogih patologija, uključujući i one infektivne prirode. Studija se izvodi u laboratoriji. Glavni cilj tehnike je otkrivanje antitijela, njihovo prisustvo ukazuje na prodor patogenih agenasa u tijelo. Moderna medicina koristi ELISA analizu za dijagnosticiranje mnogih bolesti i identifikaciju spojeva trećih strana.

ELISA analiza: kada i kako se provodi

Koristeći ELISA metodu, stručnjaci mogu otkriti prisustvo specifičnih antitijela (imunoglobulina) u krvnom serumu i odrediti antigene. Imunoglobulini nastaju kao rezultat složenih neuronskih procesa koje provode zaštitne funkcije tijela. Oni su prirodna reakcija imunog sistema na prodor stranih agenasa. Za svaki tip patogena proizvode se specifična antitijela.

Važno: prisustvom određenih kompleksa, metoda imunološkog testa enzima omogućava vam da identificirate vrstu patogena u ljudskom tijelu.

Dijagnoza ELISA-om se vrši radi otkrivanja sljedećih bolesti:

• herpes;
• virusni tip hepatitisa;
• Epstein-Barr virus (herpes tip 4);
• citomegalovirus.

Test krvi otkriva glavne patogene bakterije koje izazivaju razvoj sifilisa, ureaplazmoze i trihomonijaze. Stručnjaci analizom utvrđuju antitijela na 600 vrsta alergena. U pripremi za transplantaciju organa prikladno je provesti enzimski imunotest.

Važno: u nekim slučajevima, ELISA je dodatna metoda za određivanje onkologije u ljudskom tijelu.

Analiza se vrši isključivo u laboratoriji. Za istraživanje, venska krv se uzima iz kubitalne vene. Rezultati analize bit će dostupni sljedećeg dana. Kako bi dobili pouzdane informacije, stručnjaci preporučuju pridržavanje pravila za pripremu za ELISA:

• jedan dan prije studije potrebno je napustiti upotrebu začinjene i dimljene hrane;
• alkohol je zabranjen;
• krv se daje ujutro na prazan želudac;
• prije studije potrebno je isključiti svaki fizički i emocionalni stres;
• preporučljivo je prestati pušiti.

Koje se patologije otkrivaju enzimskim imunološkim testom

Koristeći enzimski imunotest, stručnjak određuje različite klase imunoglobulina, čije prisustvo ukazuje na razvoj patoloških procesa u tijelu. Dakle, glavni indikatori ELISA-e su IgM i IgG. Prisustvo IgM imunoglobulina ukazuje na razvoj akutnog patološkog procesa. Indikator IgG u krvi tipičan je za fazu oporavka.

Kroz analizu ELISA, stručnjaci identificiraju niz opasnih bolesti. To uključuje:

Važno: ELISA test je propisan za potvrdu sifilisa kada se davanjem krvi za RV dobije pozitivan rezultat.

Pravovremena dijagnoza vam omogućava da pratite učinkovitost terapije i, ako je potrebno, prilagodite je.

Dešifriranje analize: pozitivan i negativan odgovor

Tumačenje rezultata ELISA-e vrši specijalista, na osnovu dobijenih podataka. Odgovor može biti pozitivan ili negativan.

Pozitivna ELISA

Rezultat se smatra pozitivnim ako su imunoglobulini klase IgG i IgM otkriveni u krvi tokom studije. Prisutnost predstavljenih komponenti ukazuje na razvoj sljedećih bolesti:

• sifilis;
• virusni tip hepatitisa;
• CMVI (citomegalovirus);
• herpes;
• vodene kozice;
• bolesti izazvane stafilokokom i streptokokom;
• klamidija.

S razvojem sifilisa, specifična antitijela se nalaze u krvi 14 dana nakon infekcije. Prema njihovom broju, specijalista određuje težinu tijeka bolesti. Aktivna terapija sifilisa eliminira sve bakterije nakon 6 mjeseci. Ako se ne liječi, tijelu će biti potrebno najmanje 1,5 godina da se potpuno oporavi.

ELISA analiza otkriva hepatitis virusnog tipa čak iu periodu inkubacije, prije nego što se pojave prvi simptomi.

CMVI je česta patologija koja se javlja kod svake treće osobe. Za stanovništvo ne predstavlja opasnost, infekcija se javlja u maternici.

Normalno, u ljudskom tijelu nema antitijela na virus herpesa. Kada se otkriju, uobičajeno je dijagnosticirati akutnu fazu bolesti.

Sa razvojem vodenih kozica, specifični IgM imunoglobulini se nalaze u ljudskoj krvi. Oni mogu ostati u tijelu 2 godine, nakon potpunog eliminacije patologije.

Za određivanje bolesti uzrokovanih streptokokom i stafilokokom, dvostruki test za ELISA dopušta. Kada se ponovo pregleda, nivo specifičnih antitijela se brzo povećava.

Na razvoj hlamidije ukazuje visok nivo imunoglobulina - 1:8 i više. Indikator može varirati ovisno o progresiji bolesti.

Pažnja: za potvrdu razvoja određenog patološkog procesa, specijalist propisuje dodatne laboratorijske i instrumentalne studije. Sveobuhvatna studija vam omogućava da prepišete efikasan režim liječenja.

Negativna ELISA

S negativnim rezultatom, specifični imunoglobulini klase IgM nisu otkriveni u ljudskoj krvi. Možda prisustvo IgG, antitijela mogu ostati u tijelu nakon bolesti, bakterijskog i virusnog tipa. U nekim slučajevima njihovo prisustvo u krvnom serumu traje decenijama.

Pažnja: samo iskusni stručnjak može ispravno dešifrirati rezultate analize.

Samoproučavanje odgovora u većini slučajeva dovodi do pokušaja postavljanja dijagnoze i propisivanja pogrešnog liječenja, bez sudjelovanja liječnika. Takav utjecaj se smatra idealnim za daljnje napredovanje patološkog procesa.