Određivanje indikacija za bakteriološke, virološke, serološke studije u dešifrovanju etiologije oki i evaluaciji rezultata. Virološka istraživanja Šta je smisao istraživanja

Arhiva sajtova Internet Archive Wayback Machine Vrlo često napad crnih PR ljudi dolazi neočekivano za vas. U ovom slučaju, po prvi put se suočavate s potrebom da pomno proučavate neprijatelja. Ako ste i pretpostavili takav razvoj događaja (na primjer, u

4.9. Sigurnosna kopija sa vremenskom mašinom

4.9. Pravljenje rezervne kopije pomoću Time Machine-a Mac OS X Leopard vam omogućava da redovno pravite rezervnu kopiju računara pomoću aplikacije Time Machine. Nakon odgovarajućih postavki, aplikacija će automatski

4.9.2. Napravite svoju prvu rezervnu kopiju pomoću Time Machine-a

4.9.2. Kreiranje prve sigurnosne kopije pomoću Time Machine-a Prije nego počnete kreirati svoju prvu sigurnosnu kopiju, morate ili umetnuti eksterni disk ili imati rezervnu particiju tvrdog diska izdvojenu samo za pravljenje rezervne kopije.

4.9.4. Koristeći vremensku mašinu

4.9.4. Korištenje Time Machine-a Nakon što napravite potrebna podešavanja Time Machine-a i kreirate brojne sigurnosne kopije, možete početi tražiti i vraćati ranije verzije vaših datoteka. Za ovo: 1. Otvorite Finder prozor i odaberite datoteku koju trebate vratiti.2. Ako a

metode za proučavanje biologije virusa i njihovu identifikaciju. U virologiji se široko koriste metode molekularne biologije, uz pomoć kojih je bilo moguće utvrditi molekularnu strukturu virusnih čestica, kako one prodiru u ćeliju i karakteristike reprodukcije virusa, primarnu strukturu virusnih nukleinskih kiselina. i proteini. Razvijaju se metode za određivanje redoslijeda sastavnih elemenata virusnih nukleinskih kiselina i proteinskih aminokiselina. Postaje moguće povezati funkcije nukleinskih kiselina i proteina koji su njima kodirani sa nukleotidnom sekvencom i utvrditi uzroke unutarćelijskih procesa koji igraju važnu ulogu u patogenezi virusne infekcije.

Virološke metode istraživanja također se temelje na imunološkim procesima (interakcija antigena s antitijelima), biološkim svojstvima virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, enzimska aktivnost), karakteristikama interakcije virusa sa ćelijom domaćinom ( priroda citopatskog efekta, stvaranje intracelularnih inkluzija itd.).

U dijagnostici virusnih infekcija, u uzgoju, izolaciji i identifikaciji virusa, kao i u pripremi vakcinalnih preparata, široko se koristi metoda kulture tkiva i ćelija. Koriste se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane i diploidne ćelijske kulture. Primarne kulture se dobijaju raspršivanjem tkiva proteolitičkim enzimima (tripsin, kolagenaza). Izvor ćelija mogu biti tkiva i organi (češće bubrezi) ljudskih i životinjskih embrija. Suspenzija stanica u hranjivom mediju stavlja se u takozvane madrace, boce ili Petrijeve zdjelice, gdje se, nakon pričvršćivanja na površinu posude, stanice počinju razmnožavati. Za infekciju virusom obično se koristi stanični monosloj. Hranljiva tečnost se odvodi, virusna suspenzija se unosi u određenim razblaženjima, a nakon kontakta sa ćelijama dodaje se sveža hranljiva podloga, obično bez seruma.

Ćelije iz većine primarnih kultura mogu se subkulturisati i nazivaju se sekundarnim kulturama. Daljnjim prolazom ćelija formira se populacija ćelija sličnih fibroblastima, sposobnih za brzu reprodukciju, od kojih većina zadržava originalni set hromozoma. To su takozvane diploidne ćelije. Serijskom kultivacijom ćelija dobijaju se stabilne kontinuirane ćelijske kulture. Tokom pasaža pojavljuju se brzo dijeleće se homogene ćelije sa heteroploidnim skupom hromozoma. Stabilne ćelijske linije mogu biti jednoslojne i suspenzijske. Jednoslojne kulture rastu u obliku kontinuiranog sloja na staklenoj površini, suspenzijske kulture rastu u obliku suspenzija u različitim posudama uz korištenje miješalica. Postoji preko 400 ćelijskih linija koje potiču od 40 različitih životinjskih vrsta (uključujući primate, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, insekte) i ljudi.

Komadi pojedinih organa i tkiva (kulture organa) mogu se uzgajati u vještačkim hranjivim podlogama. Ove vrste kultura čuvaju strukturu tkiva, što je posebno važno za izolaciju i prolaz virusa koji se ne razmnožavaju u nediferenciranim kulturama tkiva (na primjer, koronavirusi).

U inficiranim ćelijskim kulturama virusi se mogu otkriti promjenom ćelijske morfologije, citopatskim djelovanjem, koje može biti specifično, pojavom inkluzija, određivanjem virusnih antigena u ćeliji i u tečnosti kulture; određivanje bioloških svojstava virusnog potomstva u tečnosti kulture i titracija virusa u kulturi tkiva, pilećih embriona ili osetljivih životinja; otkrivanjem pojedinačnih virusnih nukleinskih kiselina u ćelijama molekularnom hibridizacijom ili klastera nukleinskih kiselina citokemijskom metodom pomoću fluorescentne mikroskopije.

Izolacija virusa je naporan i dugotrajan proces. Provodi se kako bi se utvrdio tip ili varijanta virusa koji cirkulira među populacijom (na primjer, da bi se identificirala serovarijanta virusa gripe, divljeg ili vakcinalnog soja virusa dječje paralize, itd.); u slučajevima kada je potrebno sprovesti hitne epidemiološke mere; kada se pojave novi tipovi ili varijante virusa; ako je potrebno, potvrdite preliminarnu dijagnozu; za indikaciju virusa u objektima okoline. Prilikom izolacije virusa uzima se u obzir mogućnost njihove perzistencije u ljudskom organizmu, kao i pojava mješovite infekcije uzrokovane sa dva ili više virusa. Genetski homogena populacija virusa dobijena iz jednog viriona naziva se virusni klon, a proces njegovog dobijanja naziva se kloniranje.

Za izolaciju virusa, infekcije osjetljivih laboratorijskih životinja, koriste se pileći embriji, ali se najčešće koristi kultura tkiva. Prisutnost virusa se obično utvrđuje specifičnom degeneracijom ćelije (citopatski efekat), formiranjem simplasta i sincicija, detekcijom intracelularnih inkluzija, kao i specifičnim antigenom otkrivenim imunofluorescencijom, hemadsorpcijom, hemaglutinacijom (kod hemaglutinirajućih virusa) itd. . Ovi znakovi se mogu otkriti tek nakon 2-3 prolaza virusa.

Za izolaciju niza virusa, kao što su virusi gripe, koriste se pileći embriji, za izolaciju nekih Coxsackie virusa i niza arbovirusa koriste se novorođeni miševi. Identifikacija izoliranih virusa provodi se serološkim testovima i drugim metodama.

Prilikom rada s virusima određuje se njihov titar. Titracija virusa se obično provodi u kulturi tkiva, određujući najveće razrjeđenje tekućine koja sadrži virus, pri čemu dolazi do degeneracije tkiva, formiranja inkluzija i virusa specifičnih antigena. Metoda plaka može se koristiti za titriranje brojnih virusa. Plakovi ili negativne kolonije virusa su žarišta virusom uništenih ćelija jednoslojne kulture tkiva pod prevlakom agar. Brojanje kolonija omogućava kvantitativnu analizu infektivne aktivnosti virusa na osnovu toga da jedna čestica infektivnog virusa formira jedan plak. Plakovi se identifikuju bojenjem kulture vitalnim bojama, obično neutralnom crvenom; plakovi ne adsorbiraju boju i stoga su vidljivi kao svjetlosne mrlje na pozadini obojenih živih stanica. Titar virusa izražava se kao broj jedinica koje formiraju plak u 1 ml.

Pročišćavanje i koncentracija virusa se obično provodi diferencijalnim ultracentrifugiranjem nakon čega slijedi centrifugiranje u gradijentima koncentracije ili gustoće. Za pročišćavanje virusa koriste se imunološke metode, ionsko-izmjenjivačka hromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska dijagnostika virusnih infekcija uključuje otkrivanje patogena ili njegovih komponenti u kliničkom materijalu; izolacija virusa iz ovog materijala; serodijagnostika. Izbor laboratorijske dijagnostičke metode u svakom pojedinačnom slučaju ovisi o prirodi bolesti, periodu bolesti i mogućnostima laboratorije. Savremena dijagnostika virusnih infekcija bazira se na ekspresnim metodama koje vam omogućavaju da dobijete odgovor nekoliko sati nakon uzimanja kliničkog materijala u ranim stadijumima bolesti, uključujući elektronsku i imunološku elektronsku mikroskopiju, kao i imunofluorescenciju, metodu molekularne hibridizacije. , otkrivanje antitela IgM klase itd.

Elektronska mikroskopija negativno obojenih virusa omogućava diferencijaciju virusa i određivanje njihove koncentracije. Upotreba elektronske mikroskopije u dijagnostici virusnih infekcija ograničena je na one slučajeve kada je koncentracija virusnih čestica u kliničkom materijalu dovoljno visoka (10 5 u 1 ml i više). Nedostatak metode je nemogućnost razlikovanja virusa koji pripadaju istoj taksonomskoj grupi. Ovaj nedostatak se eliminiše upotrebom imunološke elektronske mikroskopije. Metoda se zasniva na stvaranju imunoloških kompleksa kada se virusnim česticama doda specifični serum, a istovremeno dolazi do koncentracije virusnih čestica, što omogućava njihovu identifikaciju. Metoda se također koristi za otkrivanje antitijela. U svrhu ekspresne dijagnostike vrši se elektronski mikroskopski pregled ekstrakata tkiva, fecesa, tečnosti iz vezikula i sekreta iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se široko koristi za proučavanje morfogeneze virusa; njene mogućnosti se proširuju upotrebom obilježenih antitijela.

Metoda molekularne hibridizacije, zasnovana na detekciji nukleinskih kiselina specifičnih za virus, omogućava otkrivanje pojedinačnih kopija gena i nema premca u smislu osjetljivosti. Reakcija se zasniva na hibridizaciji komplementarnih lanaca DNK ili RNK (sonde) i formiranju dvolančanih struktura. Najjeftinija sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena radioaktivnim prekursorima (obično radioaktivnim fosforom). Upotreba kolorimetrijskih reakcija je obećavajuća. Postoji nekoliko varijanti molekularne hibridizacije: tačkasta hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Antitijela klase lgM pojavljuju se ranije od antitijela klase G (3-5. dana bolesti) i nestaju nakon nekoliko sedmica, pa njihovo otkrivanje ukazuje na nedavnu infekciju. Antitijela IgM klase se otkrivaju imunofluorescencijom ili enzimskim imunotestom korištenjem anti-μ antiseruma (anti-IgM seruma teškog lanca).

Serološke metode u virologiji zasnivaju se na klasičnim imunološkim reakcijama (vidi Imunološke metode istraživanja) : reakcije fiksacije komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka neutralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radijalna hemoliza, imunofluorescencija, enzimski imunotest, radioimunotest. Razvijene su mikrometode za mnoge reakcije, a njihove tehnike se kontinuirano usavršavaju. Ove metode se koriste za identifikaciju virusa pomoću skupa poznatih seruma i za serodijagnostiku kako bi se utvrdilo povećanje antitijela u drugom serumu u odnosu na prvi (prvi serum se uzima u prvim danima nakon bolesti, drugi - nakon 2-3 sedmice). Dijagnostička vrijednost nije manja od četverostrukog povećanja antitijela u drugom serumu. Ako otkrivanje antitijela lgM klase ukazuje na nedavnu infekciju, tada antitijela lgC klase perzistiraju nekoliko godina, a ponekad i doživotno.

Za identifikaciju pojedinačnih antigena virusa i antitijela na njih u složenim smjesama bez prethodnog pročišćavanja proteina, koristi se imunoblotiranje. Metoda kombinuje frakcionisanje proteina korišćenjem elektroforeze u poliakrilamidnom gelu sa naknadnim imunotestom proteina enzimskim imunotestom. Odvajanje proteina smanjuje zahtjeve za hemijskom čistoćom antigena i omogućava identifikaciju pojedinačnih parova antigen-antitijelo. Ovaj zadatak je relevantan, na primjer, u serodijagnostici HIV infekcije, gdje su lažno pozitivne reakcije imunoeseja enzima uzrokovane prisustvom antitijela na ćelijske antigene, koja su prisutna kao rezultat nedovoljnog pročišćavanja virusnih proteina. Identifikacija antitela u serumu pacijenata na unutrašnje i spoljašnje virusne antigene omogućava određivanje stadijuma bolesti, au analizi populacija - varijabilnost virusnih proteina. Imunobloting kod HIV infekcije koristi se kao potvrdni test za otkrivanje pojedinačnih virusnih antigena i antitijela na njih. Prilikom analize populacija, metoda se koristi za određivanje varijabilnosti virusnih proteina. Velika vrijednost metode je u mogućnosti analize antigena sintetiziranih korištenjem rekombinantne DNK tehnologije, utvrđivanja njihove veličine i prisutnosti antigenskih determinanti.

20) Glavna strukturna komponenta viriona (kompletne virusne čestice) je nukleokapsid, tj. proteinski omotač (kapsid) koji obuhvata virusni genom (DNK ili RNK). Nukleokapsid većine porodica virusa okružen je lipoproteinskom ovojnicom. Između ovojnice i nukleokapsida kod nekih virusa (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- i retrovirusa) nalazi se neglikozilirani matriksni protein, koji virionima daje dodatnu krutost. Virusi većine porodica imaju omotač koji igra važnu ulogu u infektivnosti. Virioni stiču vanjski sloj ovojnice kada nukleokapsid pupanjem prodre u ćelijsku membranu. Virus kodira proteine ​​omotača, a lipidi su posuđeni iz ćelijske membrane. Glikoproteini obično u obliku dimera i trimera formiraju peplomere (izbočine) na površini viriona (orto-, paramiksovirusi, rabdo-, filo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirusi). Glikozilirani fuzioni proteini povezani su s peplomerima i igraju ključnu ulogu u ulasku virusa u ćeliju. Kapsidi i ovojnice viriona formiraju se od mnogih kopija jedne ili više vrsta proteinskih podjedinica kao rezultat procesa samosastavljanja. Interakcija u sistemu protein-protein, zbog slabih hemijskih veza, dovodi do ujedinjenja simetričnih kapsida. Razlike u virusima u obliku i veličini viriona zavise od oblika, veličine i broja strukturnih proteinskih podjedinica i prirode interakcije između njih. Kapsid se sastoji od mnogih morfološki izraženih podjedinica (kapsomera) sastavljenih od virusnih polipeptida na strogo definisan način, u skladu sa relativno jednostavnim geometrijskim principima. Proteinske podjedinice, povezujući se jedna s drugom, formiraju kapside dvije vrste simetrije: izometrijske i spiralne. Struktura nukleokapsida virusa s ovojnicom slična je strukturi nukleokapsida virusa bez ovojnice. Na površini omotača virusa razlikuju se morfološki izražene glikoproteinske strukture - peplomeri. Sastav superkapsidne membrane uključuje lipide (do 20-35%) i ugljikohidrate (do 7-8%), koji su ćelijskog porijekla. Sastoji se od dvostrukog sloja ćelijskih lipida i proteina specifičnih za virus koji se nalaze izvan i unutar lipidnog biosloja. Vanjski sloj superkapsidne membrane predstavljen je jednim ili više tipova peplometara (izbočina), koji se sastoje od jednog ili više molekula glikoproteina. Nukleokapsid virusa sa omotačem se često naziva jezgrom, dok se središnji dio viriona koji sadrži nukleinsku kiselinu naziva nukleoidom. Kapsomeri (peplomeri) se sastoje od strukturnih jedinica izgrađenih od jednog ili više homolognih ili heterolognih polipeptidnih lanaca (proteinskih podjedinica). klasifikacija virusa Izometrijski kapsidi nisu kugle, već pravilni poliedri (ikosaedri). Njihove linearne dimenzije su identične duž osi simetrije. Prema Kasparu i Klugu (1962), kapsomeri u kapsidima su raspoređeni prema ikosaedarskoj simetriji. Takvi kapsidi se sastoje od identičnih podjedinica koje formiraju ikosaedar. Imaju 12 vrhova (uglova), 30 lica i 20 površina u obliku jednakokračnih trokuta. U skladu sa ovim pravilom, kapsid virusa poliovirusa i virusa slinavke i šapa formira se od 60 proteinskih strukturnih jedinica, od kojih se svaka sastoji od četiri polipeptidna lanca. Ikosaedar optimalno rješava problem pakovanja ponavljajućih podjedinica u strogu kompaktnu strukturu s minimalnim volumenom. Samo neke konfiguracije strukturnih podjedinica mogu formirati površine, vrhove i lica virusnog ikosaedra. Na primjer, strukturne podjedinice adenovirusa formiraju heksagonalne kapsomere (heksone) na površinama i licu, i pentagonalne kapsomere (peptone) na vrhovima. Kod nekih virusa oba tipa kapsomera formiraju isti polipeptidi, a kod drugih različiti polipeptidi. Budući da se strukturne podjedinice različitih virusa razlikuju jedna od druge, čini se da su neki virusi više heksagonalni, drugi više sferični. Svi poznati virusi kralježnjaka koji sadrže DNK, osim virusa velikih boginja, kao i mnogi virusi koji sadrže RNK (7 porodica) imaju tip kubične simetrije kapsida. Reovirusi, za razliku od drugih virusa kralježnjaka, imaju dvostruki kapsid (vanjsku i unutrašnju), svaki se sastoji od morfoloških jedinica. Virusi sa spiralnim tipom simetrije imaju oblik cilindrične filamentne strukture, njihova genomska RNK ima oblik spirale i nalazi se unutar kapside. Svi životinjski virusi spiralne simetrije okruženi su lipoproteinskom ovojnicom. Helične nukleokapside karakteriziraju dužina, promjer, korak spirale i broj kapsomera po okretu spirale. Dakle, kod Sendai virusa (paramiksovirus), nukleokapsid je spirala dužine oko 1 μm, prečnika 20 nm i korak spirale od 5 nm. Kapsida se sastoji od približno 2400 strukturnih jedinica, od kojih je svaka protein molekulske težine 60 kD. Postoji 11-13 podjedinica po okretu heliksa. Kod virusa sa spiralnom nukleokapsidnom simetrijom, savijanje proteinskih molekula u spiralu osigurava maksimalnu interakciju između nukleinske kiseline i proteinskih podjedinica. Kod ikosaedarskih virusa, nukleinska kiselina je umotana unutar viriona i stupa u interakciju s jednim ili više polipeptida koji se nalaze unutar kapside.

Antireceptori (receptori) Virusni- površinski virion proteini, na primjer, hemaglutinin, koji se na komplementaran način vezuju za odgovarajući receptor osjetljive ćelije.

21) Imunološke metode u virološkim istraživanjima.

Serološki testovi se razlikuju po svojoj sposobnosti da otkriju pojedinačne klase antitijela. Test aglutinacije, na primjer, dobar je u otkrivanju IgM antitijela, ali je manje osjetljiv za otkrivanje IgG antitijela. Testovi fiksacije komplementa i hemolize, koji zahtijevaju komplement, ne otkrivaju antitijela koja se ne vežu za komplement, kao što su IgA antitijela i IgE antitijela. U reakciji neutralizacije virusa učestvuju samo antitijela usmjerena protiv antigenskih determinanti površine viriona povezane s patogenošću. Osetljivost I. m. i. nadmašuje sve druge metode za proučavanje antigena i antitijela, a posebno radioimuni test i enzimski imunotest omogućavaju hvatanje prisustva proteina u količinama mjerenim u nanogramima, pa čak i u pikogramima. Uz pomoć I. m. i. odredite grupu i provjerite sigurnost krvi (hepatitis B i HIV infekcija). Kod transplantacije tkiva i tijela I. m. omogućavaju određivanje kompatibilnosti tkiva i testiranje metoda suzbijanja inkompatibilnosti. U sudskoj medicini Castellanijeva reakcija se koristi za određivanje specifičnosti vrste proteina, a reakcija aglutinacije za određivanje krvne grupe.

Imunološke metode se široko koriste u laboratorijskoj dijagnostici zaraznih bolesti. Etiologija bolesti se utvrđuje i na osnovu povećanja antitela na uzročnik u krvnom serumu rekonvalescenta u odnosu na uzorak uzet u prvim danima bolesti. Na osnovu I. m. i. proučavaju imunitet stanovništva u odnosu na masovne infekcije, kao što je gripa, a takođe procjenjuju efikasnost preventivnih vakcinacija.

U zavisnosti od njihovog mehanizma i računa rezultata I. m. i. mogu se podijeliti na reakcije zasnovane na fenomenu aglutinacije; reakcije zasnovane na fenomenu padavina; reakcije koje uključuju komplement; reakcija neutralizacije; reakcije hemijskim i fizičkim metodama.

Reakcije zasnovane na fenomenu aglutinacije. Aglutinacija je lijepljenje stanica ili pojedinačnih čestica - nosilaca antigena uz pomoć imunološkog seruma na ovaj antigen.

Test bakterijske aglutinacije korištenjem odgovarajućeg antibakterijskog seruma jedan je od najjednostavnijih seroloških testova. Različitim razrjeđenjima ispitivanog krvnog seruma dodaje se suspenzija bakterija i nakon određenog kontaktnog vremena na t°37° bilježi se pri kojem najvećem razrjeđenju krvnog seruma dolazi do aglutinacije. Reakcija aglutinacije bakterija koristi se za dijagnosticiranje mnogih zaraznih bolesti: bruceloze, tularemije, trbušnog tifusa i paratifusa, bacilarne dizenterije i tifusa.

Reakcija pasivne, ili indirektne, hemaglutinacije (RPGA, RNGA). Koristi eritrocite ili neutralne sintetičke materijale (na primjer, čestice lateksa), na čijoj površini se adsorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni.

Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpeljni encefalitisa, krimske hemoragijske groznice i dr.), kao i za određivanje određenih hormona, za utvrđivanje preosjetljivosti pacijenta na lijekove i hormone, poput penicilina i inzulina.

Test inhibicije hemaglutinacije (HITA) zasniva se na fenomenu prevencije (inhibicije) imunološkog seruma hemaglutinacije eritrocita virusima, a koristi se za otkrivanje i titriranje antivirusnih antitijela. Služi kao glavna metoda serodijagnostike gripe, malih boginja, rubeole, zaušnjaka, krpeljnog encefalitisa i drugih virusnih infekcija čiji uzročnici imaju hemaglutinirajuća svojstva. na primjer, za serodijagnostiku krpeljnog encefalitisa, dvostruka razrjeđenja pacijentovog seruma u otopini alkalnog boratnog pufera se sipaju u jažice panela. Zatim se dodaje određena količina, obično 8 AJ (aglutinirajuće jedinice), antigena krpeljnog encefalitisa, a nakon 18 sati izlaganja na t ° 4 °, dodaje se suspenzija guščjih eritrocita pripremljena u kiseloj otopini fosfatnog pufera. Ako u krvnom serumu pacijenta postoje antitijela na virus krpeljnog encefalitisa, tada se antigen neutralizira i ne dolazi do aglutinacije eritrocita.

Reakcije zasnovane na fenomenu padavina. Precipitacija nastaje kao rezultat interakcije antitijela sa rastvorljivim antigenima. Najjednostavniji primjer precipitacijske reakcije je formiranje neprozirne precipitacijske trake u epruveti na granici naslaganja antigena na antitijelo. U širokoj upotrebi su različite vrste reakcija precipitacije u polutečnom agaru ili agaroznim gelovima (Ouchterlon dvostruka imunodifuzijska metoda, radijalna imunodifuzijska metoda, imunoelektroforeza), koje su i kvalitativne i kvantitativne. Kao rezultat slobodne difuzije u gelu antigena i antitijela u zoni njihovog optimalnog omjera nastaju specifični kompleksi - precipitacijske trake, koje se otkrivaju vizualno ili bojenjem. Karakteristika metode je da svaki par antigen-antitijelo formira individualni precipitacijski pojas, a reakcija ne ovisi o prisutnosti drugih antigena i antitijela u sistemu koji se proučava.

Reakcije koje uključuju komplement, koji se koristi kao svježi serum zamorca, zasnivaju se na sposobnosti podkomponente Clq komplementa, a zatim i drugih komponenti komplementa da se vežu za imunološke komplekse.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) omogućava titraciju antigena ili antitela prema stepenu fiksacije komplementa kompleksom antigen-antitelo. Ova reakcija se sastoji od dvije faze: interakcije antigena sa testnim krvnim serumom (test sistem) i interakcije hemolitičkog seruma sa eritrocitima ovna (indikatorski sistem). Uz pozitivnu reakciju, dolazi do fiksacije komplementa u ispitivanom sistemu, a zatim, kada se dodaju eritrociti osjetljivi na antitijela, hemoliza se ne opaža. Reakcija se koristi za serodijagnostiku sifilisa (Wassermannova reakcija), virusnih i bakterijskih infekcija.

Reakcija neutralizacije zasniva se na sposobnosti antitijela da neutraliziraju određene specifične funkcije makromolekularnih ili topljivih antigena, kao što su aktivnost enzima, bakterijski toksini i patogenost virusa. Reakcija neutralizacije toksina može se procijeniti biološkim učinkom, na primjer, titriraju se serumi protiv tetanusa i botulinuma. Mješavina toksina i antiseruma koja se daje životinjama ne uzrokuje njihovu smrt. U virologiji se koriste različite varijante reakcije neutralizacije. Kada se virusi pomiješaju s odgovarajućim antiserumom i ova mješavina se daje životinjama ili ćelijskim kulturama, neutralizira se patogenost virusa i životinje ne obolijevaju, a stanice kultura ne podliježu uništavanju.

Reakcije pomoću kemijskih i fizičkih oznaka. Imunofluorescencija se sastoji u upotrebi fluorohromom obeleženih antitela, tačnije, imunoglobulinske frakcije IgG antitela. Antitelo obeleženo fluorohromom formira kompleks antigen-antitelo sa antigenom, koji postaje dostupan za posmatranje pod mikroskopom u UV zracima koji pobuđuju luminescenciju fluorohroma. Reakcija direktne imunofluorescencije koristi se za proučavanje ćelijskih antigena, otkrivanje virusa u inficiranim stanicama i otkrivanje bakterija i rikecija u razmazima.

Metoda indirektne imunofluorescencije se više koristi. baziran na detekciji kompleksa antigen-antitijelo korištenjem luminiscentnog seruma anti-lgG antitijela i koristi se za otkrivanje ne samo antigena, već i titracije antitijela.

Imunoenzimske, ili enzimske imunološke, metode se zasnivaju na upotrebi antitijela konjugiranih s enzimima, uglavnom peroksidazom hrena ili alkalnom fosfatazom. Kao i imunofluorescencija, enzimski imunotest se koristi za otkrivanje antigena u ćelijama ili za titriranje antitela na ćelijama koje sadrže antigen.

Radioimunološka metoda temelji se na korištenju radioizotopske oznake antigena ili antitijela. To je najosetljivija metoda za određivanje antigena i antitela, koja se koristi za određivanje hormona, lekova i antibiotika, za dijagnostiku bakterijskih, virusnih, rikecija, protozoa, za proučavanje proteina krvi, tkivnih antigena.

Imunobloting se koristi za otkrivanje antitijela na pojedinačne antigene ili "prepoznavanje" antigena iz poznatih seruma. Metoda se sastoji od 3 faze: odvajanje bioloških makromolekula (na primjer, virusa) na pojedinačne proteine ​​pomoću elektroforeze na poliakrilamidnom gelu; prenošenje izdvojenih proteina iz gela na čvrsti nosač (blot) nanošenjem poliakrilamidne gel ploče na aktivirani papir ili nitrocelulozu (elektroblotiranje); detekcija željenih proteina na supstratu korišćenjem direktnog ili indirektnog enzimskog imunoeseja. Kao dijagnostička metoda, imunobloting se koristi za HIV infekciju. Dijagnostička vrijednost je otkrivanje antitijela na jedan od proteina vanjskog omotača virusa.

22) Tipovi simetrije virusa (kubični, spiralni, mješoviti). Interakcija proteina i nukleinskih kiselina u pakovanju genoma virusa.

Ovisno o interakciji kapside s nukleinskom kiselinom, virusne čestice se mogu podijeliti u nekoliko tipova simetrije:

1). Tip kubične simetrije.

Kubični kapsidi su ikosideri sa otprilike 20 trokutastih površina i 12 vrhova. Oni formiraju strukturu koja liči na sfernu formaciju, ali u stvari je poliedar. U nekim slučajevima, posebne formacije lipoproteina koje se nazivaju šiljci su pričvršćene za vrhove takvih ikosaedarskih poliedara. Uloga ovih šiljaka se vjerovatno svodi na interakciju viriona ili virusnih čestica s odgovarajućim područjima ćelija domaćina koja su osjetljiva na njih. Sa kubičnom simetrijom, virusna nukleinska kiselina je čvrsto spakovana (smotana u kuglu), a proteinski molekuli je okružuju, formirajući poliedar (ikosaedar). Ikosaedar je poliedar sa dvadeset trokutastih lica kubične simetrije i približno sfernog oblika. Ikosaedrski virusi uključuju herpes simplex virus, reoviruse itd.

2). Tip spiralne simetrije. Spiralni kapsidi su nešto jednostavniji. One. Kapsomeri koji čine kapsid pokrivaju spiralni NK i formiraju prilično stabilnu proteinsku školjku ovih virusa. A kada se koriste elektronski mikroskopi visoke rezolucije i odgovarajuće metode pripreme, mogu se vidjeti spiralne strukture na virusima. Sa spiralnom simetrijom kapside, virusna nukleinska kiselina formira spiralnu (ili spiralnu) figuru, šuplju iznutra, a proteinske podjedinice (kapsomeri) su također naslagane oko nje u spiralu (cijevasta kapsida). Primjer virusa sa spiralnom simetrijom kapside je virus mozaika duhana, koji je u obliku štapa, a njegova dužina je 300 nm s promjerom od 15 nm. Sastav virusne čestice uključuje jedan RNA molekul veličine oko 6000 nukleotida. Kapsid se sastoji od 2000 identičnih proteinskih podjedinica raspoređenih u spiralu.

3). Mješoviti ili složeni tip simetrije. U pravilu se ova vrsta simetrije nalazi uglavnom među bakterijskim virusima. A klasični primjeri su oni fagi, E. coli ili umjereni fagi. To su složene formacije koje imaju glavu sa unutrašnjim nukleinskim sadržajem, razne vrste dodataka, repni proces i uređaj različitog stepena složenosti. A svaka komponenta takvih čestica je obdarena specifičnom funkcijom koja se ostvaruje u procesu interakcije između virusa i ćelije. Drugim riječima, složena vrsta simetrije je kombinacija kubične simetrije, glava je ikoziderni poliedar, a štapićaste formacije su repni procesi. Iako među bakterijskim virusima postoje i prilično jednostavno organizirani virioni, koji su primitivni nukleokapsidi, sfernog ili kubičnog oblika. Bakterijski virusi su složeniji od biljnih i životinjskih virusa.

24) Interakcija faga sa ćelijom. Virulentni i umjereni fagi.

Adsorpcija.

Interakcija počinje vezivanjem virusnih čestica na površinu ćelije. Proces postaje moguć u prisustvu odgovarajućih receptora na površini ćelije i antireceptora na površini virusne čestice.

Virusi koriste ćelijske receptore dizajnirane za transport esencijalnih supstanci: hranljive čestice, hormone, faktore rasta, itd.

Receptori: proteini, ugljikohidratna komponenta proteina i lipida, lipidi. Specifični receptori određuju dalju sudbinu virusne čestice (transport, dostava u područja citoplazme ili jezgra). Virus se može vezati za nespecifične receptore i čak prodrijeti u ćeliju. Međutim, ovaj proces ne uzrokuje infekciju.

U početku se formira jedna veza između antireceptora i receptora. Ova veza je krhka i može puknuti. Za formiranje ireverzibilne adsorpcije potrebno je viševalentno vezivanje. Stabilno vezivanje nastaje zbog slobodnog kretanja receptorskih molekula u membrani. Tokom interakcije virusa sa ćelijom, uočava se povećanje fluidnosti lipida i formiranje receptorskih polja u području interakcije između virusa i ćelije. Receptori brojnih virusa mogu biti prisutni samo u ograničenom skupu ćelija domaćina. Ovo određuje osjetljivost organizma na ovaj virus. Dakle, virusna DNK i RNK imaju sposobnost da inficiraju širi spektar ćelija domaćina.

Antireceptori se mogu naći u jedinstvenim virusnim organelama: strukture izraslina u T-bakteriofaga, vlakna u adenovirusima, šiljci na površini virusnih membrana, korona u koronavirusima.

Penetracija.

2 mehanizma - endocitoza receptora i fuzija membrane.

Endocitoza receptora:

Uobičajeni mehanizam za ulazak hranjivih i regulatornih supstanci u ćeliju. Javlja se u specijalizovanim područjima - gdje postoje posebne jame prekrivene klatrinom, specifični receptori se nalaze na dnu jame. Jamice osiguravaju brzu invaginaciju i formiranje vakuola prekrivenih klatrinom (ne prođe više od 10 minuta od trenutka adsorpcije, u jednoj minuti može se formirati do 2000 vakuola). Vakuole se spajaju s većim citoplazmatskim vakuolama i formiraju receptorosome (koji više ne sadrže klatrin), koji se zauzvrat spajaju s lizosomima.

Fuzija virusnih i ćelijskih membrana:

Kod virusa sa omotačem, fuzija je posredovana tačkastim interakcijama virusnog proteina sa lipidima stanične membrane, što rezultira integracijom ovojnice virusnog lipoproteina sa ćelijskom membranom. Kod virusa bez omotača, jedan od površinskih proteina također stupa u interakciju s lipidima stanične membrane i unutrašnja komponenta prolazi kroz membranu (kod paramiksovirusa, F-protein; kod ortomiksovirusa, HA2 hemaglutinirajuća podjedinica). Na konformaciju površinskih proteina utiče pH.

Skinuti se.

U tom procesu nestaje infektivna aktivnost, često se javlja osjetljivost na nukleaze i javlja se otpornost na antitijela. Krajnji proizvod skidanja su nukleinske kiseline vezane za unutrašnji virusni protein. Faza svlačenja takođe ograničava mogućnost infekcije (virusi se ne mogu svući u svakoj ćeliji). Svlačenje se dešava u specijalizovanim delovima ćelije: lizosomima, Golgijevom aparatu i perinuklearnom prostoru.

Svlačenje se dešava kao rezultat niza reakcija. Na primjer, kod picornavirusa svlačenje se nastavlja formiranjem srednjih subvirusnih čestica veličine od 156 do 12S. Kod adenovirusa u citoplazmi i nuklearnim porama i ima najmanje 3 stadijuma:

Formiranje subvirusnih čestica veće gustoće od viriona;

Formiranje jezgara u kojima nedostaju 3 virusna proteina;

Formiranje kompleksa DNK-protein u kojem je DNK kovalentno vezana za terminalni protein.

Karakterizacija virulentnih i umjerenih faga.

Kada je bakterija inficirana fagom dolazi do tzv. litičke infekcije, odnosno infekcija se završava lizom ćelije domaćina, ali to je karakteristično samo za tzv. virulentne fage čija interakcija sa ćelijom dovodi do smrti ćelije i stvaranja potomstva faga.

Istovremeno, prema interakcijama faga sa ćelijom razlikuju se sljedeće faze: miješanje faga sa staničnom kulturom (mnoštvo infekcije je 1 fag na 10 stanica), a koncentracija mora biti dovoljno visoka da fagi mogu kontaktirati ćelije. Da bi se izbjegla ponovna infekcija - nakon infekcije u trajanju od najviše 5 minuta, kada se fagi adsorbiraju - ova mješavina stanica sa fagom se razrjeđuje. Postoji latentni period tokom kojeg se broj faga ne povećava, zatim vrlo kratak izlazni period, kada se broj čestica faga naglo povećava, kada se ćelija lizira i fagno potomstvo se oslobađa, a zatim broj faga ostaje na nivou isti nivo, jer ne dolazi do ponovne infekcije. Na osnovu ove krive mogu se razlikovati ove faze: vegetativni period "rasta" (latentni period), period izlaska i izračunati prinos faga po 1 inficiranoj ćeliji. Tokom latentnog perioda, u bakterijama se ne može naći ništa što bi ličilo na čestice faga i nije moguće izolovati infektivni princip iz takvih ćelija u latentnom periodu. Samo zrele čestice faga mogu inficirati bakterije. Dakle, virulentni fagi uvijek uzrokuju smrt bakterija i proizvode infekciju, koja se otkriva u stvaranju novih virusnih čestica sposobnih da inficiraju sljedeće i druge osjetljive stanice.

Za razliku od virulentnih, infekcija umjerenim fagima ne dovodi do lize bakterijskih stanica, već se ostvaruje formiranje posebnog stanja koegzistencije faga sa bakterijskom ćelijom. Ta koegzistencija se izražava u činjenici da je određeni početak faga prisutan u bakterijskoj ćeliji bez ikakvih nepovoljnih uslova za to i čuva se iz generacije u generaciju. U određenim fazama takve koegzistencije, fag se aktivira u ćeliji i ulazi u stanje litičkog ciklusa razvoja, uzrokujući ćelijsku lizu i oslobađanje fagnog potomstva. Takvi fagi se nazivaju lizogeni ili umjereni fagi, a stanje umjerenog postojanja s fagom je lizogenija, a bakterije koje sadrže takav latentni fag nazivaju se lizogene bakterije. Termin lizogene bakterije proizašao je iz činjenice da su nekada otkrivene kulture u kojima se spontano pojavio fag, a taj bakteriofag se počeo smatrati kontaminacijom kulture, odnosno bakterijskim virusom koji ulazi u kulturu, a takve kulture su nazvane lizogene, odnosno stvaraju lizu.

Virusi se, za razliku od bakterija, razmnožavaju samo u živim stanicama. S tim u vezi, uzgoj virusa se može vršiti na nivou tijela eksperimentalne životinje (pileći embrion kao organizam u razvoju naziva se pokusnim životinjama) ili žive ćelije uzgojene izvan tijela, tj. na nivou ćelijske kulture.

Upotreba laboratorijskih životinja. Jedna od metoda za izolaciju i kultivaciju virusa je inficiranje laboratorijskih životinja. Koriste se za izolaciju virusa koji ne izazivaju razvoj citopatskih promjena u ćelijskim kulturama i koji se ne razmnožavaju u pilećim embrionima. Korištenje laboratorijskih životinja također omogućava identifikaciju prirode virusne infekcije prema kompleksu kliničkih simptoma. Kao laboratorijske životinje najčešće se koriste bijeli miševi, hrčci, zamorci i zečevi, ovisno o svrsi rada i vrsti virusa koji se proučava. Od većih životinja koriste se majmuni raznih vrsta i neke druge životinje. Od ptica koristite piliće, guske, patke. Posljednjih godina, novorođene životinje (osjetljivije na viruse), "sterilne životinje" (vađene iz maternice i držane u sterilnim uvjetima uz korištenje sterilnog zraka i sterilizirane hrane) i životinje čistih linija s poznatim naslijeđem (samooplodne ili linearne životinje) su u prodaji. češće koristi.

U eksperiment se uzimaju samo zdrave životinje, po mogućnosti iz jednog rasadnika i jedne serije. U isto vrijeme se mjeri i tjelesna temperatura, jer postoje dnevne fluktuacije. Ispitni materijal se primjenjuje uzimajući u obzir tropizam virusa na određena tkiva. Dakle, za izolaciju neutrotropnih virusa materijal se ubrizgava u mozak, za izolaciju pneumotropnih virusa - kroz nos (pod laganom eterskom anestezijom).

Kod laboratorijskih životinja, nakon infekcije materijalom koji sadrži virus, važno je blagovremeno i ispravno, aseptično, uzeti materijal za dalja istraživanja. Rezultati izolacije virusa smatraju se pozitivnim ako životinja razvije simptome infekcije nakon odgovarajućeg perioda inkubacije.

Upotreba pilećih embriona. U tkivima embrija, njegovim membranama, žumančanoj vrećici mogu se razmnožavati mnogi patogeni ljudski i životinjski virusi. U ovom slučaju je važna selektivnost virusa na određeno tkivo: virusi velikih boginja se dobro razmnožavaju i akumuliraju u stanicama horion-alantoične membrane, virus zaušnjaka u amnionu, virusi gripe u amnionu i alantoisu i virus bjesnoće. u kesici žumanca.

Uzgoj virusa u razvoju embrija ima niz prednosti u odnosu na druge metode: gusta školjka prilično pouzdano štiti unutrašnji sadržaj od mikroba; kod zaraze pilećih embrija dobija se veći prinos materijala koji sadrži virus nego kod drugih metoda uzgoja; metoda infekcije pilećih embrija je jednostavna i dostupna svim virološkim laboratorijama; embriji imaju dovoljnu održivost i otpornost na patogene vanjskih faktora. Međutim, pileći embriji nisu uvijek slobodni od latentnih virusnih i bakterijskih infekcija. Teško je uočiti dinamiku patoloških promjena koje se javljaju u embriju nakon infekcije virusom. Obdukcija inficiranih embrija često ne otkriva vidljive promjene, a virus otkriva hemaglutinacijskim testom i drugim metodama. Kod inficiranih embriona nemoguće je pratiti porast titra antitijela. Metoda nije prikladna za sve viruse.

Za virološke studije koriste se embrioni starosti 7-12 dana, koji se dobijaju sa farmi peradi. Embrije možete uzgajati u konvencionalnom termostatu, na čijem dnu se postavljaju posude s vodom za vlaženje zraka. Temperatura u termostatu treba da bude 37°C, a vlažnost 60-65%. Odabrati velika, čista (ali neoprana), oplođena jaja od bijelih pilića, čuvana ne duže od 10 dana na temperaturi od 5-10°C. Oplođena jajašca prepoznaju se po prisutnosti zametnog diska, koji, kada je proziran ovoskopom, izgleda kao tamna mrlja.

Prilikom rada s virusima mogu se koristiti različite metode inficiranja embrija, ali najpraktičnija primjena je primjena virusa na horion-alantoičnu membranu, unošenje u alantoičnu, amnionsku šupljinu i žumančanu vreću.

(Sl. 10.5). Izbor metode ovisi o biološkim svojstvima virusa koji se proučava.

Rice. 10.5.

Prije infekcije, vitalnost embrija se utvrđuje ovoskopom. Živi embriji su pokretni, jasno je vidljivo pulsiranje žila membrana. Prilikom paljenja jednostavnom olovkom na ljusci označite granice zračne vrećice ili lokaciju embrija, što je određeno njegovom sjenom na ljusci.

Pileći embrioni se inficiraju u boksu pod strogo aseptičnim uslovima korišćenjem instrumenata sterilisanih kuhanjem.

Kada se inficiraju na horion-alantoičnoj membrani, najpogodniji su embrioni stari 12 dana. Za infekciju u alantoičnoj šupljini koriste se embrioni od 10-11 dana starosti, u amnionskoj šupljini - embrioni od 7-11 dana, u žumančanoj vrećici - embrioni od 7 dana.

Jaja sa zaraženim embrionima stavljaju se na postolje sa tupim krajem prema gore. Temperaturni režim i period inkubacije zavise od bioloških svojstava inokulisanog virusa. Vijabilnost embriona se prati svakodnevno pod ovoskopom. Embrioni koji su umrli prvog dana nakon infekcije usled povrede se ne ispituju.

Prije sakupljanja materijala, embrioni se hlade na 4 °C 18-20 sati kako bi se suzile suze i spriječilo krvarenje na obdukciji. Embrioni se otvaraju u kutiji u skladu sa pravilima asepse.

Alantoična tečnost se usisava pipetom, sterilnost se kontroliše inokulacijom u šećernu ili mesno-peptonsku juhu, proverava prisustvo virusa u reakciji hemaglutinacije i čuva na 4°C u smrznutom stanju.

Za dobijanje amnionske tečnosti prvo se aspirira alantoična tečnost, zatim se pincetom zahvati plodna membrana, lagano se podiže, a plodova voda se isisava Pasterovom pipetom.

Prilikom proučavanja promjena na horion-alantoičnoj membrani, ona se reže makazama i sav sadržaj se izlije kroz rupu u Petrijevu posudu. Horion-alantoična membrana ostaje unutar ljuske i uklanja se pincetom u Petrijevu posudu s fiziološkim rastvorom. Ovdje se pere, ispravlja i proučava priroda žarišnih lezija na tamnoj pozadini.

Da bi se dobila amnionska membrana, amnionska vrećica u kojoj je embrion zatvorena se isječe i oslobađa od embrija, gleda se na lezije.

Da bi se dobila žumančana membrana, reže se horion-alantois, isisava alantoična i amnionska tečnost, pincetom se uklanja fetus, odvaja se pupčanom vrpcom, hvata se žumančana kesa i stavlja u Petrijevu posudu. Kontrola steriliteta, pregled prisutnosti lezija. Žumance se, ako je potrebno, može ukloniti štrcaljkom bez uklanjanja žumančane vrećice.

Hemaglutinacijskim testom utvrđuje se prisutnost virusa u alantoičnoj i amnionskoj tekućini inficiranog embrija. Tečnosti iz embriona pozitivnih na hemaglutinaciju nakon testiranja na sterilnost se skupljaju i titriraju u proširenom testu hemaglutinacije.

U prisustvu male količine virusa ili nemogućnosti njegovog otkrivanja u ispitivanom materijalu, provode se uzastopni pasaži na pilećim embrionima. Ako se nakon tri naredna pasaža na embrionima virus ne otkrije u materijalu za ispitivanje, rezultat se smatra negativnim.

Upotreba ćelijskih kultura. Uzgoj ćelija van tela zahteva ispunjenje niza uslova. Jedna od njih je striktno poštovanje sterilnosti tokom rada, jer su hranljive podloge odličan hranljivi supstrat i za bakterije i gljivice. Ćelije tkiva su vrlo osjetljive na soli teških metala. Stoga se kvalitetu različitih sastojaka koji čine fiziološke otopine i hranjive podloge, kao i metodama obrade pribora i gumenih čepova koji se koriste u ćelijskoj kulturi, treba dati izuzetan značaj.

Jedan od preduslova za uspešan rad sa ćelijama je visok kvalitet destilovane vode (proverava se dva puta nedeljno). Za rad sa ćelijama koristi se bidestilirana ili deionizirana voda. Najbolji destilatori su uređaji od stakla ili legiranog čelika: ioni teških metala, koji su toksični za ćelije, ne ispiru se iz takve opreme. Dejonizovana voda se dobija na posebnim instalacijama, gde se voda prečišćava od soli tokom njenog uzastopnog prolaska kroz kolone sa anjonskim izmenjivačem i kationskim izmenjivačem.

Prilikom kultivacije ćelija posebno se visoki zahtjevi postavljaju na pripremu i sterilizaciju posuda i čepova. U mnogim slučajevima, njihovo nepravilno pranje i sterilizacija uzrokuje da se ćelije ne pričvršćuju za staklo ili brza degeneracija ćelijskog monosloja.

Za rast i reprodukciju ćelija izvan organizma potreban je složen skup fizičko-hemijskih faktora: određena temperatura, koncentracija vodikovih jona, neorganskih jedinjenja, ugljenih hidrata, aminokiselina, proteina, vitamina, kiseonika i ugljen-dioksida, dakle , za uzgoj virusa u ćelijskim kulturama koriste se složeni hranljivi mediji. Prema prirodi komponenti koje čine njihov sastav, ovi mediji se dijele u dvije grupe.

• 1. Mediji, koji su mješavine fizioloških otopina (Hanks, Earl, itd.) i prirodnih komponenti (serum krvi životinja i ljudi, hidrolizat albumina). Količina svake od ovih komponenti u različitim formulacijama medija je različita.
• 2. Sintetička i polusintetička podloga koja se sastoji od fizioloških rastvora (Earl, Hanks, itd.) sa dodatkom aminokiselina, vitamina, koenzima i nukleotida (Eagle media, 199 itd.). U sintetičkim medijima, ćelije mogu postojati u održivom stanju kratko vrijeme (do 7 dana). Da bi se duže održale u održivom stanju, kao i da bi se stvorili bolji uslovi za rast i reprodukciju ćelija, sintetičkim podlogama dodaje se životinjski krvni serum (krava, telad itd.).

Za izolaciju virusa mogu se koristiti različite metode uzgoja stanica izvan tijela. Međutim, trenutno su jednoslojne kulture primarno tripsiniziranih i transplantiranih staničnih linija dobile najveću praktičnu primjenu. Jednoslojne ćelijske kulture uzgajaju se u staklenim posudama-madracima ravnih stijenki kapaciteta 1 l, 250 i 100 ml ili u konvencionalnim bakteriološkim epruvetama tretiranim na odgovarajući način.

Pri korištenju primarnih tripsiniziranih staničnih kultura, suština metode leži u razaranju međustaničnih veza u tkivima proteolitičkim enzimima i odvajanju stanica kako bi na površini stakla nastao monosloj. Kao izvor za dobijanje ćelija mogu poslužiti tkiva i organi ljudskih i životinjskih embriona, zaklanih životinja i ptica, kao i oni koji su ekstrahovani od ljudi tokom operacije. Koristiti normalna i maligna degenerirana tkiva, epitelna, fibroblastična i mješovita. Sposobnost reprodukcije ćelija ekstrahovanih iz tela usko je povezana sa stepenom diferencijacije tkiva. Što je tkivo manje diferencirano, to je intenzivnija sposobnost njegovih ćelija da proliferiraju in vitro. Stoga je stanice embrionalnog i tumorskog tkiva mnogo lakše kultivirati izvan tijela nego normalne stanice odraslih životinja.

Dnevne kulture se posmatraju pod malim povećanjem mikroskopa kako bi se utvrdila priroda njihovog rasta. Ako ćelije ne proliferiraju, izgledaju okrugle, zrnaste, tamne i ljušte se od stakla, stakleno posuđe je loše obrađeno ili su sastojci u mediju za kulturu toksični.

Zajedno sa primarnim tripsiniziranim tkivima, presađene ćelijske kulture se široko koriste za kultivaciju virusa; ćelijske kulture sposobne za neograničeno razmnožavanje izvan tijela. Najčešće se koriste ćelijske kulture dobivene iz normalnih i kancerogenih ljudskih tkiva. HeLa ćelijska linija dobijena iz tumora grlića materice, Hep-2 iz karcinoma larinksa, KV iz tkiva raka usne šupljine postala je široko poznata. Takve ćelijske kulture se pripremaju i od normalnih životinjskih tkiva - bubrega majmuna, zeca i svinjskog embriona (tabela 10.1).

Za ponovno zasijavanje presađenih ćelija, hranljivi medij se isisava pipetom i izlije. Formirani tanak sloj ćelija uništava se rastvorom tripsina, a tako oslobođene ćelije se prenose u novu posudu sa svežim hranljivim rastvorom, gde se ponovo formira monosloj ćelija.

Indikator prisustva virusa u zaraženim kulturama ćelija može biti:

• a) razvoj specifične degeneracije ćelija;
• b) detekcija intracelularnih inkluzija;
• c) detekcija specifičnog antigena imunofluorescencijom;
• d) pozitivna reakcija hemadsorpcije;
• e) pozitivna reakcija hemaglutinacije;
• e) formiranje plakova.

Tabela 10.1

Spisak najčešće korišćenih ćelijskih kultura

Da bi se otkrila specifična degeneracija u inficiranim kulturama, ćelije se svakodnevno pregledavaju pod malim povećanjem mikroskopa. Mnogi virusi, razmnožavajući se u ćelijama, uzrokuju njihovu degeneraciju, tj. imaju citopatogeno dejstvo (CPA) (slika 10.6).

Rice. 10.6.

Vrijeme razvoja i priroda citopatskih promjena u inficiranim ćelijskim kulturama određuju se svojstva i doza inokuliranog virusa, kao i svojstva i uslovi uzgoja ćelija. Neki virusi izazivaju CPP u prvoj sedmici nakon infekcije (boginje, dječja paraliza, Coxsackie B, itd.), drugi - nakon 1-2 sedmice. nakon infekcije (adenovirusi, virusi parainfluence, ECHO, itd.).

Virusi uzrokuju citopatske promjene tri glavna tipa: stvaranje višejezgrenih divovskih stanica i simplasta, koji su rezultat fuzije citoplazme mnogih stanica; degeneracija okruglih ćelija koja je rezultat gubitka međustaničnih veza i zaokruživanja ćelija; razvoj žarišta ćelijske proliferacije, koji se sastoje od nekoliko slojeva ćelija.

Tokom reprodukcije nekih virusa u ćelijskim kulturama, unutarćelijske inkluzije se formiraju u citoplazmi ili jezgru zahvaćenih ćelija. Ćelijske kulture za otkrivanje inkluzija uzgajaju se na staklenim pločama u epruvetama, zaražene virusom, a nakon određenih perioda inkubacije pripremaju se preparati bojenjem konvencionalnim bojama.

Za detekciju specifičnog antigena u inficiranim kulturama ćelija, preparati se pripremaju na isti način kao za detekciju inkluzija korišćenjem MFA.

Metoda plaka se zasniva na formiranju u monosloju ćelija inficiranih virusom ispod agar premaza izmjenjenih područja koja se sastoje od degenerisanih (mrtvih) ćelija. Ova područja, nazvana plakovi, su kolonije virusa, obično formirane od jedne virusne čestice.

U nedostatku citopatskih promjena, intracelularnih inkluzija, formiranja plaka, negativnih reakcija hemadsorpcije i hemaglutinacije u ćelijskim kulturama inficiranim ispitivanim materijalom, izvode se dva sljedeća pasaža. U nedostatku ovih promjena u konačnom prolazu, rezultat izolacije virusa smatra se negativnim.

Za otkrivanje virusa u infektivnom materijalu mogu se koristiti sljedeće metode.

mikroskopski:

• a) viroskopija;
• b) detekcija intracelularnih inkluzija.

imunološki:

• a) imunološka elektronska mikroskopija;
• b) imunofluorescencija;
• c) hemaglutinacija;
• d) hemadsorpcija.

Identifikacija virusa se provodi imunološkim metodama, uključujući sljedeće reakcije:

• a) inhibicija hemaglutinacije;
• b) kašnjenja hemadsorpcije;
• c) vezivanje komplementa;
• d) neutralizacija;
• e) precipitacija u agar gelu.

mikroskopske metode. Svjetlosnim mikroskopom mogu se otkriti samo veliki virusi veći od 150 nm. Prepoznavanje manjih virusa moguće je samo pomoću elektronskog mikroskopa. Svjetlo, fazni kontrast i fluorescentna mikroskopija mogu se koristiti za otkrivanje velikih virusa.

Tokom virusnih infekcija, u inficiranim ćelijama se razvijaju neobične inkluzije. Neke infekcije su praćene stvaranjem inkluzija u citoplazmi zahvaćenih stanica (bjesnilo, vakcina protiv velikih boginja), druge - u citoplazmi i jezgru (ospice, prirodne i vodene boginje, adenovirusne bolesti). Inkluzije imaju različitu prirodu, strukturu, oblik i veličinu od 0,25 do 25 mikrona. Prema savremenim podacima, kod nekih infekcija inkluzije su mesto razmnožavanja virusa i predstavljaju njegove akumulacije okružene ćelijskim supstancama, dok su kod drugih proizvod degeneracije ćelije.

Inkluzije se mogu otkriti u obojenim otiscima organa i tkiva, struganjima ćelija, histološkim presecima zahvaćenog tkiva i preparatima kulture ćelija inficiranih virusom. Bojanje se često vrši prema metodi Romanovsky-Giemsa. Za bojenje ovom metodom, preparati se fiksiraju u mješavini Dubosque - Brazil - Bouin, koja se sastoji od pikrinske kiseline, formalina, alkohola, octene kiseline. Intracelularne inkluzije kod većine virusnih infekcija su oksifilne i boje se ružičasto ili lila prema Romanovsky-Giemsa metodi.

Imunološke metode za dijagnosticiranje virusnih infekcija. Posljednjih godina ove metode su postale vodeće u laboratorijskoj dijagnostici virusnih infekcija. To je uglavnom zbog ekonomskih razloga, jer su klasične metode virološke analize prilično skupe. Osim toga, trajanje studija korištenjem viroloških metoda (nedjelje), čak i ako su prilično efikasne, čini ih retrospektivnim.

Imunološke metode se koriste kako za otkrivanje virusnih antigena u različitim biosupstratima i objektima okoliša, tako i za serodijagnostiku - otkrivanje antitijela na virusne antigene u serumu krvi bolesnih ljudi i laboratorijskih životinja. Osim toga, imunološke metode istraživanja su neophodne za identifikaciju viriona.

U interakciji s tijelom, virusi izazivaju stvaranje antitijela, koja, adsorbirajući se na virione, sprječavaju prodiranje viriona u stanice i razvoj citopatskog djelovanja (CPE); neutraliziraju smrtonosni učinak virusa tijekom njihove reprodukcije u pilećim embrionima i životinjama; inaktiviraju virion hemaglutinine i neuraminidazu, sprečavajući reakciju hemaglutinacije (RGA) i reakciju hemadsorpcije (RGads) na ćelijama zahvaćenim virusom. Ova antitijela koja neutraliziraju virus također uzrokuju aglutinaciju i precipitaciju virusnih čestica, a nastali imunološki kompleksi vezuju komplement. Stoga se za identifikaciju viriona koristi klasična reakcija neutralizacije (PH) na ćelijskim kulturama, pilećim embrionima i životinjama i njene modifikacije: reakcija inhibicije hemaglutinacije (HITA); reakcija inhibicije hemadsorpcije (RTGads). Iste reakcije se koriste u serodijagnostici virusnih infekcija za otkrivanje antitijela koja neutraliziraju virus u serumu pacijenata prema poznatom virusnom antigenu (diagnosticum).

Metoda imunoelektronske mikroskopije (IEM). Elektronska mikroskopija trenutno igra važnu ulogu u proučavanju virusa. Upravo podaci elektronske mikroskopije služe kao osnova za savremenu klasifikaciju virusa.

Nova faza u razvoju elektronskog mikroskopskog proučavanja virusa je upotreba tehnika imunoelektronske mikroskopije. Ovom metodom omogućeno je ne samo direktno otkrivanje virusa, već i njihova identifikacija, kao i brza serotipizacija virusnih sojeva i titracija antitijela na njih. IEM je dobio veliki značaj za određivanje lokalizacije virusnih antigena unutar ćelija makroorganizma.

Nesumnjiva prednost IEM-a je njegova visoka osjetljivost u odnosu na konvencionalne metode elektronske mikroskopije.

Kada virusni antigen ili virusna komponenta dođe u kontakt sa homolognim antiserumom, formira se kompleks antitijelo-antigen. Ovaj fenomen je osnova tehnike koja se koristi za otkrivanje i identifikaciju virusnih antigena ili antitijela na njih. Upravo se ovi kompleksi antigena s antitijelima nakon negativnog bojenja mogu uočiti u elektronskom mikroskopu. U kliničkoj dijagnostici, antigenski materijal ne zahtijeva temeljito pročišćavanje. Dakle, ako se otkrije virus gripe, može se ispitati nepročišćena alantoična tekućina. Trenutno se vjeruje da je gotovo svaka vrsta kliničkog materijala prikladna za IEM. U dijagnostičke svrhe mogu se koristiti obični nefrakcionisani serumi, kao i serumi rekonvalescenta. Treba napomenuti da odnos količina antigena i antitela ima veliki uticaj na konačne rezultate. Sa viškom antigena, uočava se obilje čestica; aglomerata će u ovom slučaju biti malo. Uz višak antitijela, virusne čestice su okružene svojim debelim slojem, gotovo je nemoguće otkriti male strukturne detalje viriona; agregata je takođe malo. Sa optimalnim omjerom antigena i antitijela, agregati su uvećani uz dobru sliku detalja viriona. Iz gore navedenih razmatranja, poželjno je koristiti imunološki serum u nekoliko razrjeđenja.

Noseći film napravljen od paladija nanosi se na potpornu rešetku. Kada se koriste niske koncentracije paladija i da bi se poboljšala svojstva adsorpcije supstrata, on je ojačan ugljikom. Da bi se to postiglo, ugalj se raspršuje na gotovi suhi film-supstrat na elektronskom mikroskopskoj mreži u vakuumu. Debljina filma-podloge i ojačavajućeg karbonskog sloja značajno utiču na kontrast i sliku finih detalja objekta. Svaki istraživač pojedinačno određuje specifičnu debljinu supstratnih filmova i sloja ugljika, na osnovu činjenice da je ugljik elektronski transparentniji od paladija.

Virusi i antitijela na njih imaju nisku elektronsku gustoću. Zbog toga se biološki objekti ne mogu detektovati pomoću elektronskog mikroskopa bez prethodnog tretmana. Virusi se vizualiziraju tehnikom negativnog kontrasta (ili negativne mrlje). Za negativno bojenje virusa i kompleksa virus-antitijelo koriste se različite soli teških metala. Kontrastna sredstva (atomi teških metala) prodiru u hidrofilna područja objekata i zamjenjuju vodu u njima. Kao rezultat, povećava se elektronska gustoća objekta i postaje moguće promatrati ga u elektronskom mikroskopu.

Direktna IEM metoda je našla najveću primjenu u praksi. Suspenzija virusa se pomiješa s nerazrijeđenim antiserumom. Nakon snažnog miješanja, smjesa se inkubira 1 h na t

37°C, a zatim preko noći na 4°C. Sljedećeg dana, smjesa se centrifugira kako bi se istaložili imuni kompleksi. Talog se resuspenduje u kapi destilovane vode i podvrgava negativnom kontrastu.

Prilikom procjene rezultata IEM-a, proizvodi interakcije između antigena i antitijela u elektronskom mikroskopu mogu imati drugačiji izgled (jedna virusna čestica prekrivena antitijelima u cijelosti ili djelomično; aglomerati virusnih čestica). Aglomerati mogu zauzimati različitu površinu, imati drugačiji izgled i sadržavati različit broj čestica. Stoga je, uz eksperimentalne, potrebno proučavati kontrolne preparate (sa puferskim rastvorom ili heterolognim antiserumom).

Kriterijum za procenu rezultata dobijenih primenom IEM-a je prisustvo ili odsustvo klastera virusnih čestica agregiranih imunološkim serumom u preparatima. Prisustvo aglomerata antigena i specifičnih antiserumskih antitijela znak je pozitivne reakcije. Ipak, treba uzeti u obzir mogućnost nespecifične agregacije antigenskih čestica pod uticajem centrifugiranja velikom brzinom. Iz tog razloga, mnogi autori preporučuju razmatranje rezultata na uslovnoj skali od 0 do 4+. Zasniva se na proceni stepena pokrivenosti agregiranih čestica serumskim antitelima.

Metode hemaglutinacije i hemadsorpcije. Mnogi virusi imaju sposobnost aglutinacije eritrocita strogo određenih vrsta sisara i ptica. Dakle, virusi gripa i zaušnjaka aglutiniraju eritrocite pilića, zamoraca i ljudi; virus krpeljnog encefalitisa - eritrociti ovaca; Virusi japanskog encefalitisa - eritrociti jednodnevnih pilića i gusaka; adenovirusi - eritrociti pacova, miševa, majmuna. Kao testni materijal u reakciji hemaglutinacije (HA) koriste se alantoična i amnionska tekućina, suspenzija horion-alantoične membrane pilećih embriona, suspenzije i ekstrakti iz kultura ćelija ili organa životinja zaraženih virusima. Reakcija hemaglutinacije može se postaviti metodom kapanja na staklo iu proširenom redu u epruvetama ili bunarčićima od polistirenskih ploča. Prva metoda je indikativna.

Budući da je specifičan za grupu, RGA ne omogućava određivanje vrste virusa. Oni se identifikuju pomoću testa inhibicije hemaglutinacije (HITA). Za njegovu formulaciju koriste se poznati imunološki antivirusni serumi. U svako razrjeđenje dodaje se jednaka količina tekućine koja sadrži virus. Kontrola je suspenzija virusa.

Smjesa se drži u termostatu, a zatim se dodaje suspenzija eritrocita. Nekoliko minuta kasnije određuje se titar neutralizirajućeg seruma, tj. njegovo maksimalno razrjeđenje, što je uzrokovalo kašnjenje u aglutinaciji eritrocita.

U serološkoj dijagnostici virusnih bolesti preporučuje se RTGA da se radi sa parnim serumima, od kojih se jedan dobije na početku bolesti, a drugi nakon 1-2 sedmice ili više. Četvorostruko povećanje titra antitijela u drugom serumu potvrđuje predloženu dijagnozu.

Reakcija hemadsorpcije (RGads) se koristi za indikaciju u inficiranim kulturama ćelija na virus sa hemaglutinirajućom aktivnošću. Suština reakcije leži u činjenici da se eritrociti osjetljivi na hemaglutinirajuće djelovanje virusa adsorbiraju na površini ćelija inficiranih virusima. Na primjer, pileći eritrociti se adsorbiraju na stanice inficirane virusom variola; virus malih boginja - eritrociti majmuna; adenovirusi - majmuni i pacovi itd.

Reakcija neutralizacije (PH). Reproducirajući se u ćelijskim kulturama, virusi uzrokuju različite vrste CPD-a, izražene u zaokruživanju, naboranju, smanjenju ili, obrnuto, povećanju veličine stanica, njihovom spajanju i formiranju simplasta, uništavanju citoplazme i jezgra. Konačno, u monosloju ćelija inficiranih virusima, kao rezultat njihovog uništavanja određenih dijelova ćelijskog sloja, mogu se pojaviti „sterilne mrlje“ ili plakovi, koji su klon virusne čestice, što omogućava ne samo izolovati virus, ali i odrediti njegov titar.

Vrlo je teško identificirati virus prema prirodi plakova, pa se stoga pribjegava određivanju PH izolovanog virusa poznatim serumima koji neutraliziraju virus. U tu svrhu, virus dobijen od pacijenta akumulira se u ćelijskoj kulturi i njegova različita razrjeđenja se miješaju s nerazrijeđenim antivirusnim serumom.

Mješavina virusa i seruma može zaraziti pileće embrije ili osjetljive životinje. U takvim slučajevima neutralizirajuća aktivnost antitijela najčešće je određena neutralizacijom virusnih hemaglutinina u tekućinama embrija i eliminacijom smrtonosnog djelovanja virusa na embrije i životinje. Istovremeno se izračunava indeks neutralizacije, koji izražava maksimalan broj smrtonosnih doza virusa koji je neutraliziran ovim serumom, u poređenju sa rezultatima kontrolnog eksperimenta, uzetim kao jedan.

Slično, pomoću PH, virusi izolirani iz materijala pacijenata identificiraju se kada inficiraju pileće embrije i životinje. Da bi se to postiglo, serumima koji neutraliziraju virus dodaju se tekućine embrija i suspenzije zahvaćenih organa životinja koje sadrže virus. Nakon određenog vremena inkubacije, ćelijske kulture, pileći embrioni i životinje se inficiraju mješavinama.

U serodijagnostici virusnih infekcija utvrđuje se dinamika porasta titra antitijela koja neutraliziraju virus za poznati virus. Istovremeno, PH se postavlja parnim serumima uzetim od pacijenata na početku i na kraju bolesti. Dijagnostika će biti 4 puta povećanje titra imunoglobulina u drugom od njih.

PH se zasniva na sposobnosti specifičnih antitijela da se dovoljno snažno vežu za virusnu česticu. Kao rezultat interakcije između virusa i antitijela, infektivna aktivnost virusa je neutralizirana zbog blokade antigenskih determinanti odgovornih za vezu virusne čestice s osjetljivim stanicama. Kao rezultat toga, virus gubi sposobnost razmnožavanja u osjetljivom biološkom sistemu in vitro ili in vivo.

Rezultati PH postaju očigledni nakon što se mješavina virusa i njegovih homolognih antitijela, nakon određenog izlaganja, unese u osjetljivi biološki sistem (kultura ćelija tkiva, pileći embrion, osjetljivo životinjsko tijelo), gdje se virus može razmnožavati i uzrokovati mjerljive promjene koje će se djelomično ili potpuno potisnuti u prisustvu antitijela.

U PH su uključene tri komponente:

• 1) virus;
• 2) serum koji sadrži antitela;
• 3) biološki objekat (laboratorijske životinje, razvoj pilećih embrija, kulture tkiva), čiji izbor zavisi od vrste virusa sa kojim se sprovodi istraživanje.

PH se koristi ili za identifikaciju izoliranog patogena ili za otkrivanje i titriranje antitijela u serumu. U prvom slučaju koriste se serumi posebno imuniziranih laboratorijskih životinja ili oporavljenih ljudi. U drugom slučaju se koriste serumi uzeti u početnom stadijumu bolesti iu periodu rekonvalescencije.

Antitijela koja neutraliziraju viruse u serumu oporavljenih osoba, za razliku od antihemaglutinina ili antitijela za fiksiranje komplementa, opstaju godinama, a kod nekih virusnih infekcija (na primjer, ospica) čak i doživotno. To u pojedinim slučajevima omogućava korištenje bazena seruma mnogih rekonvalescenata kao referentnog lijeka, koji je nakon punjenja u ampule i liofilizacije dugo vremena pogodan za dijagnostički rad.

Za identifikaciju izoliranih patogena koriste se unaprijed pripremljeni hiperimuni serumi raznih životinja: zečeva, bijelih pacova i miševa, zamoraca, majmuna, ovaca, konja itd. Aktivnost hiperimunih seruma na PH ovisi o načinu imunizacije životinja.

Prije postavljanja svakog eksperimenta neutralizacije, virus se prethodno titrira, određujući konačno razrjeđenje koje uzrokuje oštećenje kulture tkiva ili infekciju laboratorijskih životinja (ili pilećih embrija). Titar virusa se izražava kao 50% doza (TCID50 - 50% infektivna doza za kulturu tkiva).

Molekularno-genetičke dijagnostičke metode u virološkoj praksi. Metode molekularne biologije razvijene su 50-ih godina. XX vijek. Oni su postali mogući zahvaljujući činjenici da u genomu svakog virusa postoje jedinstvene nukleotidne sekvence specifične za vrstu, otkrivanjem kojih se može identificirati bilo koji infektivni agens. Ove metode su najvažnije u identifikaciji mikroorganizama koje je dugotrajno ili ih je teško uzgajati konvencionalnim metodama. Sedamdesetih godina prošlog vijeka, detekcija DNK sonde korištena je za otkrivanje infektivnog agensa ili mutacije, na temelju hibridizacije specifičnih oligonukleotidnih sondi obilježenih radioaktivnim izotopom (ili fluorohromom) sa izolovanim uzorkom DNK. Analiza hibridizacije koristi sposobnost nukleinskih kiselina da pod određenim uslovima formiraju specifične komplekse sa nukleinskim kiselinama koje imaju sekvence komplementarne njima. Metoda otkrivanja infektivnih patogena hibridizacijom DNK pokazala se izuzetno napornom, dugotrajnom i skupom. Osim toga, njegova osjetljivost je nedovoljna za identifikaciju mikroorganizama u kliničkim materijalima kao što su izmet i urin.

Hibridizacija DNK zamijenjena je metodom koja oponaša prirodnu replikaciju DNK i omogućava vam da otkrijete i više puta kopirate određeni DNK fragment koristeći termofilnu DNK polimerazu. Lančana reakcija polimerazom (PCR) je elegantna tehnika koja oponaša prirodnu replikaciju DNK i omogućava da se određeni dio DNK detektuje i više puta kopira pomoću termofilne DNK polimeraze.

Zbog svojih visokih dijagnostičkih kvaliteta, PCR je općepriznat dodatak tradicionalnim metodama koje se koriste u virologiji: razmnožavanje virusa u ćelijskoj kulturi, imunološka detekcija virusnih antigena i elektronska mikroskopija. Značajna prednost ove metode je mogućnost otkrivanja virusa u latentnim infekcijama (citomegalovirus, virus herpesa) i virusa koje je teško ili još nije moguće kultivirati (virus humane imunodeficijencije, Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, virus hepatitisa Vidr). Izgledi za proučavanje bolesti kao što su Creutzfeldt-Jakobova bolest, Alchajmerova bolest i multipla skleroza povezani su sa PCR metodom.

Etiološka dijagnostika virusnih bolesti vrši se virološkim, virološkim, serološkim i molekularno genetskim metodama. Posljednje tri metode mogu se koristiti kao ekspresne dijagnostičke metode.

Virološka dijagnostička metoda.

Krajnji cilj metode je identifikacija virusa do vrste ili serološke varijante. Virološka metoda uključuje nekoliko faza:

1) odabir materijala za istraživanje;

2) preradu materijala koji sadrži virus;

3) kontaminacija osetljivih živih sistema materijalom;

4) indikacija virusa u živim sistemima;

5) titracija izolovanih virusa;

6) identifikacija virusa u imunološkim reakcijama.

1. Izbor materijala za istraživanje .

Provodi se u ranim stadijumima bolesti, uz poštovanje pravila koja sprečavaju kontaminaciju materijala stranom mikroflorom i infekciju medicinskog osoblja. Kako bi se spriječila inaktivacija virusa tokom transporta, materijal se stavlja u virusni transportni medij (VTS) koji se sastoji od uravnoteženog rastvora soli, antibiotika i serumskog albumina. Materijal se transportuje u posebnom kontejneru sa termo izolacijom i zatvorenim plastičnim vrećama koje sadrže led. Po potrebi materijal se čuva na -20˚C. Svaki uzorak materijala za istraživanje treba biti označen i označen imenom pacijenta, vrstom materijala, datumom uzorkovanja, detaljnom kliničkom dijagnozom i drugim podacima.

Ovisno o prirodi bolesti, materijal za studiju može biti:

1) bris iz nosnog dela ždrela i bris iz ždrela;

2) cerebrospinalna tečnost;

3) feces i rektalni brisevi;

6) tečnost iz seroznih šupljina;

7) bris iz konjuktive;

8) sadržaj vezikula;

8) materijal presjeka.

Za ispiranje orofarinksa koristi se 15-20 ml VTS. Pacijent pažljivo ispire VTS grlo u trajanju od 1 minute i skuplja ispiranje u sterilnu bočicu.

Bris sa stražnje strane ždrijela uzima se sterilnim pamučnim štapićem, pritiskajući lopaticom na korijen jezika. Bris se stavlja u 2-3 ml VTS, ispere i iscijedi.

Cerebrospinalna tečnost se dobija lumbalnom punkcijom. 1-2 ml cerebrospinalne tečnosti stavlja se u sterilnu posudu i dostavlja u laboratoriju.

Uzorci fekalija se uzimaju u roku od 2-3 dana u sterilne bočice. Od dobijenog materijala pomoću Hankovog rastvora priprema se 10% suspenzija. Suspenzija se centrifugira na 3000 o/min, skupi se supernatant, dodaju se antibiotici i stavi u sterilnu posudu.

Krv dobijena venepunkcijom u zapremini od 5-10 ml defibrinira se dodatkom heparina. Puna krv se ne zamrzava i ne dodaju se antibiotici. Da bi se dobio serum, uzorci krvi se inkubiraju na 37°C 60 minuta.

Tečnost iz seroznih šupljina dobija se punkcijom u količini od 1-2 ml. Tečnost se koristi odmah ili se čuva zamrznuta.

Bris konjunktive se uzima sterilnim brisom i stavlja u VTS, nakon čega se materijal centrifugira i zamrzava.

Sadržaj vezikula se aspirira špricom sa tankom iglom i stavlja u VTS. Materijal se šalje u laboratoriju u obliku osušenih razmaza na stakalcima ili u zatvorenim sterilnim kapilarama ili ampulama.

Materijal za preseke uzima se što je ranije moguće, poštujući pravila asepse. Za prikupljanje svakog uzorka koriste se odvojeni setovi sterilnih instrumenata. Količina odabranih maramica je 1-3 g, koje se stavljaju u sterilne bočice. Prvo se uzimaju uzorci ekstrakavitarnih organa (mozak, limfni čvorovi, itd.). Prije otvaranja trbušne šupljine uzimaju se tkiva grudnog koša. Dobijeni uzorci tkiva se melju u malter uz dodatak sterilnog peska i sterilnog rastvora natrijum hlorida, nakon čega se materijal centrifugira. Supernatant se sakuplja u bočice, dodaju se antibiotici. Materijal za virološka istraživanja koristi se odmah ili se čuva na -20°C.

2. Obrada materijala koji sadrži virus.

Provodi se kako bi se materijal oslobodio od prateće bakterijske mikroflore. Za to se koriste fizičke i hemijske metode.

Fizičke metode:

1) filtriranje kroz razne bakterijske filtere;

2) centrifugiranje.

Hemijske metode:

1) tretman materijala etrom u slučajevima izolacije virusa koji nemaju superkapsid;

2) dodavanje mješavine heptana i freona u materijal;

3) uvođenje antibiotika (penicilin - 200-300 U / ml; streptomicin - 200-500 μg / ml; nistatin - 100-1000 U / ml).

3. Infekcija osjetljivih živih sistema materijalom.

1) laboratorijske životinje;

2) pileći embrioni;

3) kulture organa;

4) kultura tkiva.

laboratorijske životinje. Koriste se bijeli miševi, zamorci, hrčci, zečevi itd. Bijeli miševi su najosjetljiviji na veliki broj vrsta virusa. Način infekcije životinja određen je tropizmom virusa na tkiva. Infekcija u mozgu koristi se za izolaciju neurotropnih virusa (virusi bjesnila, poliovirusi itd.). Intranazalna infekcija se provodi kada se izoluju uzročnici respiratornih infekcija. Široko korištene intramuskularne, intravenske, intraperitonealne, potkožne i druge metode infekcije. Bolesne životinje se eutanaziraju etrom, otvaraju i uzima se materijal iz organa i tkiva.

pilećih embriona. Široko dostupan i jednostavan za korištenje. Nanesite pileće embrione u dobi od 5 do 14 dana. Prije infekcije, pileći embriji se ovoskopiraju: utvrđuje se njihova održivost, na ljusci se označava granica zračne vrećice i lokacija embrija ("tamno oko" embrija). Rad sa pilećim embrionima obavlja se u sterilnoj kutiji sa sterilnim instrumentima (pinceta, špriceva, makaze, koplja, itd.). Nakon završetka fragmenta rada, instrumenti se potapaju u 70% etil alkohol i spaljuju prije sljedeće manipulacije. Prije infekcije, ljuska pilećeg embrija obriše se zapaljenim alkoholnim tamponom i alkoholnom otopinom joda. Volumen test materijala koji se ubrizgava u embrion je 0,1-0,2 ml. Najmanje 4 pileća embriona koriste se za izolaciju virusa iz jednog materijala.