Бактерии вид с микроскопа bacillus subtilis. Сенная палочка. Размножение. Как вырастить колонию

Савустьяненко А.В.

Ключевые слова

Bacillus subtilis / пробиотик / механизмы действия

Аннотация научной статьи по медицине и здравоохранению, автор научной работы - Савустьяненко А.В.

Бактерия B.subtilis является одним из наиболее перспективных пробиотиков , изученных в последние десятилетия. Механизмы ее пробиотического действия связаны с синтезом противомикробных веществ, усилением неспецифического и специфического иммунитета, стимуляцией роста нормальной микрофлоры кишечника и выделением пищеварительных ферментов. B.subtilis выделяет рибосомально синтезируемые пептиды, нерибосомально синтезируемые пептиды и непептидные вещества с широким спектром противомикробной активности, охватывающим грамположительные, грамотрицательные бактерии, вирусы и грибы. Резистентность к данным противомикробным веществам возникает редко. Усиление неспецифического иммунитета связано с активацией макрофагов и высвобождением из них провоспалительных цитокинов, повышением барьерной функции слизистой оболочки кишечника, выделением витаминов и аминокислот (включая незаменимые). Усиление специфического иммунитета проявляется активацией Ти В-лимфоцитов и высвобождением из последних иммуноглобулинов - IgG и IgA. B.subtilis стимулирует рост нормальной микрофлоры кишечника, в частности бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Кроме того, пробиотик увеличивает разнообразие микрофлоры кишечника. Пробиотик выделяет в просвет кишечника все основные пищеварительные ферменты: амилазы, липазы, протеазы, пектиназы и целлюлазы. В дополнение к перевариванию пищи данные ферменты разрушают антипищевые факторы и аллергенные вещества, содержащиеся в поступающей пище. Перечисленные механизмы действия делают обоснованным применение B.subtilis в составе комплексной терапии для борьбы с кишечными инфекциями; профилактики респираторных инфекций в холодное время года; профилактики антибиотикассоциированной диареи; для коррекции нарушений переваривания и продвижения пищи различного генеза (погрешности в диете, изменение рациона питания, болезни желудочно-кишечного тракта, нарушения вегетативной нервной системы и др.). B.subtilis обычно не вызывает побочные эффекты. Для данного пробиотика характерно высокое соотношение эффективности и безопасности.

Текст научной работы на тему «Механизмы действия пробиотиков на основе Bacillus subtilis»

На допомогу практикуючому лiкарю

To Help Practitioner

УДК 615.331:579.852.1

МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ BACILLUS SUBTILIS

Резюме. Бактерия B.subtilis является одним из наиболее перспективных пробиотиков, изученных в последние десятилетия. Механизмы ее пробиотического действия связаны с синтезом противо-микробных веществ, усилением неспецифического и специфического иммунитета, стимуляцией роста нормальной микрофлоры кишечника и выделением пищеварительных ферментов. B.subtilis выделяет рибосомально синтезируемые пептиды, нерибосомально синтезируемые пептиды и непептидные вещества с широким спектром противомикробной активности, охватывающим грам-положительные, грамотрицательные бактерии, вирусы и грибы. Резистентность к данным про-тивомикробным веществам возникает редко. Усиление неспецифического иммунитета связано с активацией макрофагов и высвобождением из них провоспалительных цитокинов, повышением барьерной функции слизистой оболочки кишечника, выделением витаминов и аминокислот (включая незаменимые). Усиление специфического иммунитета проявляется активацией Т- и В-лимфо-цитов и высвобождением из последних иммуноглобулинов - IgG и IgA. B.subtilis стимулирует рост нормальной микрофлоры кишечника, в частности бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium. Кроме того, пробиотик увеличивает разнообразие микрофлоры кишечника. Пробиотик выделяет в просвет кишечника все основные пищеварительные ферменты: амилазы, липазы, протеазы, пек-тиназы и целлюлазы. В дополнение к перевариванию пищи данные ферменты разрушают антипищевые факторы и аллергенные вещества, содержащиеся в поступающей пище. Перечисленные механизмы действия делают обоснованным применение B.subtilis в составе комплексной терапии для борьбы с кишечными инфекциями; профилактики респираторных инфекций в холодное время года; профилактики антибиотикассоциированной диареи; для коррекции нарушений переваривания и продвижения пищи различного генеза (погрешности в диете, изменение рациона питания, болезни желудочно-кишечного тракта, нарушения вегетативной нервной системы и др.). B.subtilis обычно не вызывает побочные эффекты. Для данного пробиотика характерно высокое соотношение эффективности и безопасности.

Ключевые слова: Bacillus subtilis, пробиотик, механизмы действия.

К пробиотикам относят «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах оказывают положительное влияние на здоровье хозяина» . В то время как применению некоторых из них (Lactobacillus, Bifidobacterium) было уделено много внимания, другие были изучены позже, и их важное лечебное действие становится ясным только сейчас. Одним из пробиотиков является грамположительная палочка Bacillus subtilis (B.subtilis).

Большинство бактерий рода Bacillus (включая B.subtilis) не опасны для человека и широко распространены в окружающей среде. Их обнаруживают в почве, воде, воздухе и пищевых продуктах (пшеница, другие зерновые культуры, хлебобулочные изделия, соевые продукты, цельное мясо, сырое и пастеризованное молоко). Как следствие, они постоянно попадают в желудочно-кишечный тракт и дыхательные пути, засевая эти отделы. Количество бацилл в кишечнике может достигать 107 КОЕ/г, что сравнимо с аналогичным показателем у Lactobacillus. В связи с этим ряд исследователей рассматривают бактерии рода Bacillus как один

из доминирующих компонентов нормальной микрофлоры кишечника .

В то же время лечебное введение В.виЫШв позволяет использовать данный микроорганизм в качестве пробиотика по четырем основным направлениям: 1) для защиты от кишечных патогенов; 2) от дыхательных патогенов; 3) для устранения дисбактериоза при антибиотикотерапии; 4) для усиления переваривания и продвижения пищи. Упрощенная схема пробиоти-ческой активности В.виЫйЪ при патологии желудочно-кишечного тракта представлена на рис. 1.

Таким образом, в научных работах последних десятилетий были сделаны значительные продвижения в выяснении спектра пробиотической активности В.виЫШв, что делает данную бактерию одним из наиболее привлекательных пробиотиков для медицинского применения. В настоящем обзоре мы представляем данные соответствующих экспериментальных и клинических исследований, позволяющих составить впечатление о терапевтическом потенциале В.виЫШв.

противомикробных веществ

Усиление неспецифического " и специфического иммунитета

Выделение 1 пищеварительных ферментов

Рисунок 1. Упрощенная схема пробиотической активности B.subtШs при патологии желудочно-кишечного тракта (на основе рисунков из )

Выживаемость вегетативных клеток ВлиЫШв в желудочно-кишечном тракте

Пробиотики на основе ВяыЫШв обычно принимают перорально в виде либо спор, либо живых бактерий (вегетативных клеток). Выживаемость спор в желудочно-кишечном тракте не вызывает сомнений в связи с их высокой устойчивостью к воздействию различных физико-химических факторов, в частности экстремальных значений рН . В то же время дискутировался вопрос о том, способны ли живые бактерии проникать дальше желудка и выполнять пробиотическую функцию.

Ситуация была прояснена при проведении рандомизированного двойного слепого плацебо-контроли-руемого исследования у здоровых добровольцев (п = 81, возраст 18-50 лет). Всем испытуемым назначали прием живых бактерий ВлыЪШв перорально в дозе 0,1 109; 1,0 109 или 10 109 КОЕ/капсула/день либо плацебо в течение 4 недель. По окончании исследования было подсчитано содержание живых бактерий в кале. Полученные цифры составили 1,1 ± 0,1 1с^10 КОЕ/г1 в плацебо-группе и 4,6 ± 0,1 КОЕ/г; 5,6 ± 0,1 к^10 КОЕ/г; 6,4 ± 0,1 КОЕ/г для трех возрастающих доз ВлыЫШв. Следовательно, была подтверждена выживаемость вегетативных клеток ВяыЫШв при прохождении желудочно-кишечного тракта. При этом эффект носил дозоза-висимый характер и достоверно превышал таковой у плацебо (р < 0,0001) .

Сходность эффектов В.эиЫШв при приеме в виде спор и вегетативных клеток

В цитируемой литературе большинство экспериментальных и клинических исследований ВяыЫШв выполнено с введением либо спор этих бактерий, либо их вегетативных клеток. В связи с этим возникает вопрос,

1 Колониеобразующие единицы (КОЕ) численно равны количеству вегетативных клеток.

должны ли полученные эффекты и терапевтические результаты рассматриваться раздельно или могут быть объединены.

Во многих работах при изучении бактерий рода Bacillus было продемонстрировано, что после перорального приема спор наблюдается их прорастание в желудочно-кишечном тракте в вегетативные клетки. Затем наблюдается повторное превращение в споры (респоруляция). Эти циклы повторяются несколько раз. В конечном счете споры с фекальными массами оказываются во внешней среде. Аналогично после перорального приема вегетативных клеток наблюдается их споруляция в желудочно-кишечном тракте. Циклы прорастания и респоруляции повторяются несколько раз до выведения из организма хозяина .

Таким образом, как бы ни принимались пробиотики на основе B.subtilis - в виде спор или вегетативных клеток, - в организме реципиента будут присутствовать обе формы бактерии, и наблюдаемые эффекты и терапевтическое действие будут, по-видимому, одинаковы. Этот факт требует дальнейшего подтверждения в специальных исследованиях.

Механизмы пробиотической

активности B.subtilis

Синтез противомикробных веществ

Как правило, кишечные инфекции вызваны бактериями или вирусами, реже - простейшими. В соответствии с действующими рекомендациями в большинстве случаев нет необходимости в назначении антибиотиков. Следует поддерживать правильный режим регидратации, и диарея разрешится самостоятельно. Однако как в легких, так и в тяжелых случаях кишечных инфекций врач может принять решение о включении в состав проводимой терапии пробиотиков для повышения ее эффективности.

Одной из наиболее многообещающих в этом отношении бактерий является B.subtilis. Уникальность бактерии заключается в том, что 4-5 % ее генома кодирует синтез разнообразных противомикробных веществ. В соответствии с опубликованными обзорами к 2005 г. от разных штаммов B.subtilis было выделено около 24 таких веществ, а к 2010 г. - 66, и перечень продолжает расти. Большая часть противомикробных веществ представлена рибосо-мально и нерибосомально синтезируемыми пептидами. В меньшем количестве обнаруживают непептидные вещества, например поликетиды, аминосахары и фосфоли-пиды . Некоторые из противомикробных веществ B.subtilis приведены в табл. 1. Видно, что активность многих из них направлена против грамположительных бактерий. Кроме того, спектр действия охватывает грамо-трицательные бактерии, вирусы и грибы. Следовательно, охватываются практически все патогены, которые могут вызывать кишечные инфекции.

Примером могут служить результаты исследования одного из новых штаммов B.subtilis ВКПМ В-16041 (DSM 24613). Была выявлена высокая антагонистическая активность в отношении St.aureus и C.albicans, средняя или низкая - в отношении C.freundii, E.coli,

Таблица 1. Некоторые противомикробные вещества, синтезируемые и выделяемые B.subtilis

Рибосомально синтезируемые пептиды Бактериоцины: -лантибиотики типа А -лантибиотики типа В Субтилин Эрицин S Мерсацидин Для 2 веществ: формирование пор в цитоплазматической мембране Ингибирование синтеза клеточной стенки Грамположительные бактерии Грамположительные бактерии, включая метициллинрезистентные штаммы Staphylococcus aureus и ванкомицин-резистентные штаммы Enterococci

Нерибосомально синтезируемые пептиды Липопептиды Сурфактин Бацилизин Бацитрацин Растворение липидных мембран Ингибирование глюкозамин-синтазы,вовлеченной в синтез нуклеотидов, аминокислот и коферментов, что приводит к лизису микробных клеток Ингибирование синтеза клеточной стенки Вирусы, Mycoplasma Staphylococcus aureus, Candida albicans Грамположительные бактерии

Непептидные вещества Диффицидин Нарушение синтеза белков Грамположительные бактерии, грам-отрицательные бактерии

K.pneumoniaе, P.vulgaris, P.aeruginosa, Salmonella spp., Sh.sonnei, Sh.flexneri IIa.

Разные штаммы B.subtilis выделяют разный набор противомикробных веществ. Однако в любом случае охватываемый спектр антагонизма в отношении кишечных патогенов оказывается достаточно широким. Например, штамм B.subtilis ATCC6633 выделяет субтилин, являющийся антибиотиком против грамположительных бактерий. Другой штамм B.subtilis A1/3 не выделяет субтилин. Зато он выделяет антибиотик эрицин S, обладающий тем же самым механизмом действия и спектром активности, что и субтилин . Значит, какой бы из этих штаммов ни применялся при производстве пробиотика, спектр грамположительных бактерий будет охвачен.

Противомикробные пептиды, выделяемые B.subtilis, обладают огромным преимуществом по сравнению с традиционными антибиотиками. Дело в том, что они близки к противомикробным пептидам, выделяемым в организме человека и являющимся частью его врожденного иммунитета. Подобные вещества были идентифицированы в большом количестве тканей и эпителиальных поверхностей, включая кожу, глаза, уши, полость рта, кишечник, иммунную, нервную и мочевыводящую системы. Наиболее известны из них дефензин, лизоцим, кателицидин, дермцидин, лектин, гистатин и др. . B.subtilis выделяют сходные вещества, поэтому резистентность к ним возникает редко, побочные эффекты обычно отсутствуют. Отсутствие резистентности к противомикробным пептидам человека и B.subtilis связывают с тем, что их действие чаще направлено на формирование мембранных пор, приводящих к гибели бактерий. Активность традиционных антибиотиков больше сфокусирована на метаболических ферментах бактерий, что облегчает формирование резистентности .

Усиление неспецифического и специфического иммунитета

В.тЪШк усиливает защиту от кишечных и дыхательных патогенов путем стимуляции неспецифического и специфического иммунитета. Неспецифический иммунитет определяют как систему защиты, срабатывающую одинаково по отношению к самым разным микроорганизмам. Специфический иммунитет работает по принципу «ключ к замку» - для конкретного возбудителя вырабатываются специальные клетки или антитела. Неспецифический иммунитет обычно рассматривают в качестве первой фазы защитной реакции организма, а специфический - второй фазы.

Неспецифический иммунитет

Важнейшими клетками, вовлеченными в неспецифический иммунитет, являются макрофаги. Они фагоцитируют патоген, переваривая его. Кроме того, происходит выстраивание антигенов возбудителя на поверхности собственных мембран - так называемая презентация, необходимая для запуска второй фазы защитной реакции организма.

В многочисленных исследованиях было продемонстрировано, что введение ВжЬНШ вызывает активацию макрофагов . В активированных макрофагах усиливается синтез и высвобождение провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухоли а, интерферона-у (№N-7), интерлейкина (Щ 1р, Ш-6, Ш-8, Ш-10, Ш-12, макрофагального белка воспаления-2. В результате развивается комплексный воспалительный ответ, направленный на уничтожение патогена. Например, 1КК-у активирует макрофаги и защищает клетки от вирусной инфекции. Ш-6 стимулирует пролиферацию и дифференциацию В-лимфоцитов, ответственных за синтез антител. Ш-8 является мощным хемотаксическим и пара-кринным медиатором для нейтрофилов. Инфильтрация

активированными нейтрофилами играет важную роль в поддержании воспаления и окислительного стресса. IL-12 регулирует рост, активацию и дифференциацию Т-лимфоцитов .

Механизмы, с помощью которых B.subtilis активирует макрофаги, продолжают изучаться. В одной из работ было показано, что за это ответственны экзополи-сахариды пробиотика .

Следующим важным компонентом неспецифического иммунитета является барьерная функция эпителия. Эпителиальные ткани первыми встречают атаку патогенов, и от их устойчивости во многом зависит течение болезни.

Исследователями было установлено , что бактерии коммутируют между собой внутри одного вида и между разными видами с помощью особой группы веществ, называемых кворумчувствующими молекулами. Одна из таких молекул, выделяемых B.subtilis, получила название фактора компетенции и споруляции (CSF). Перенос CSF в эпителиальные клетки кишечника активирует важнейшие сигнальные пути, необходимые для выживания этих клеток. Прежде всего, это p38 MAP-киназный путь и про-теинкиназа-В/АИ-путь. Помимо этого CSF индуцирует синтез белков теплового шока (Hsps), предотвращающих развитие окислительного стресса в эпителиальных клетках. Оба перечисленных эффекта - улучшение выживаемости эпителиальных клеток и уменьшение в них окислительного стресса - приводят к повышению барьерной функции слизистой оболочки кишечника. Она становится менее уязвимой к воздействию патогенов.

К факторам неспецифического иммунитета относят также содержание ряда метаболических веществ, влияющих на общую сопротивляемость организма к инфекциям.

Было выявлено, что B.subtilis синтезирует ряд витаминов, в частности тиамин (В1), пиридоксин (В6) и ме-нахинон (К2) . Разные штаммы B.subtilis выделяют разный набор аминокислот, некоторые из которых являются незаменимыми, например валин .

Специфический иммунитет

Специфический иммунитет является более мощной системой защиты, поскольку избирательно нацелен на тот или иной патоген. В нем различают клеточный и гуморальный иммунитет. Клеточный иммунитет обеспечивают Т-лимфоциты, направляя свою борьбу против вирусов. Гуморальный иммунитет связан с функционированием В-лимфоцитов, выделяющих антитела (иммуноглобулины). В данном случае борьба направлена против бактерий.

Во многих исследованиях была подтверждена способность B.subtilis вызывать активацию и пролиферацию Т- и В-лимфоцитов. Это происходит как в периферической крови (оба типа клеток), так и в тимусе (Т-лимфоциты) и селезенке (В-лимфоциты). Выше было рассмотрено, что это становится возможным благодаря высвобождению цитокинов из макрофагов. Кроме того, была обнаружена прямая способность стимулировать лимфоциты за счет клеточных стенок, пептидогликанов и тейхоевых кислот B.subtilis .

Рисунок 2. Пробиотик B.subtilis достоверно увеличивал содержание lgA в слюне у пожилых пациентов

Примечание: пробиотик принимался в 4 захода по 10 дней, между которыми были перерывы по 18 дней. Представлены данные по состоянию на конец исследования (43) - спустя 4 месяца.

Ш B.subtilis □ Плацебо

и о ГО о Q. Л

Рисунок 3. ПробиотикB.subtilis достоверно увеличивал содержание 1дА в каловых массах пожилых пациентов

Примечание: пробиотик принимался в 4 захода по 10 дней, между которыми были перерывы по 18 дней. Представлены данные по состоянию на начало исследования (VI), спустя 10 дней после первого приема пробиотика (VI + 10 дней) и по окончании исследования (43) - спустя 4 месяца.

Следствием влияния на В-лимфоциты является повышение содержания иммуноглобулинов (IgG и 1&Л) в сыворотке крови и 1&Л - на поверхности слизистых оболочек. Например, в одной из работ было обнаружено повышение содержания 1&Л в каловых массах, что характеризует усиление иммунитета против кишечных инфекций, а также в слюне, что важно для усиления защиты от острых респираторных инфекций (рис. 2, 3). Как известно, 1&Л

является одной из основных молекул, защищающих эпителий от попадающих извне патогенов .

Стимуляция роста нормальной микрофлоры кишечника

Нормальная микрофлора занимает различные отделы кишечной трубки, начиная от ротовой полости и заканчивая толстым кишечником. В человеческом организме насчитывают около 1014 таких бактерий, что в 10 раз превышает количество собственных клеток человека. Совокупная метаболическая активность бактерий превышает таковую у наших клеток .

Количество видов бактерий, составляющих нормальную микрофлору кишечника, определяли двумя способами. Более старый метод, базирующийся на культивировании бактерий из образцов каловых масс, позволил выявить свыше 500 видов. Более новые методы, основанные на ДНК-анализе, свидетельствуют о том, что на самом деле таких видов более 1000. Цифра выросла по причине того, что в нормальной микрофлоре присутствуют те бактерии, которые не поддаются культивированию обычным способом .

Основные функции нормальной микрофлоры кишечника сводятся к защите от колонизации и роста патогенных микробов, стимуляции неспецифического и специфического иммунитета, перевариванию пищевых компонентов . Как видно, эти функции совпадают с теми, которые обсуждаются в отношении про-биотика B.subtilis в настоящем обзоре.

Дисбаланс кишечной микрофлоры возникает в случае кишечных инфекций, поскольку патогенные бактерии конкурентно подавляют жизнедеятельность нормальных бактерий. О кишечных инфекциях мы упоминали выше при рассмотрении выделяемых из B.subtilis противомикробных веществ. Кроме того, дисбаланс возникает при курсовом лечении антибиотиками терапевтических и хирургических болезней. При этом путь введения антибиотика не имеет значения - он может быть как пероральным, так и парентеральным. Частота развития антибиотикассоциированной диареи зависит от вида используемого антибиотика и составляет от 2 до 25 %, реже - до 44 %. Антибиотик подавляет жизнедеятельность нормальной микрофлоры, что приводит к росту патогенных бактерий .

Во многих исследованиях было продемонстрировано положительное влияние B.subtilis на содержание нормальной микрофлоры кишечника. Пробиотик увеличивал количество Lactobacillus и снижал содержание Escherichia coli в кишечнике и каловых массах , увеличивал уровень Bifidobacterium и снижал - Alistipes spp., Clostridium spp., Roseospira spp., Betaproteobacterium в каловых массах (рис. 4). Следовательно, введение B.subtilis меняло соотношение кишечной микрофлоры в сторону увеличения количества нормальных бактерий и уменьшения патогенных штаммов.

Механизмы этого явления продолжают изучаться. Данные, полученные на сегодняшний день, указывают на две возможности. С одной стороны, B.subtilis за счет высвобождения противомикробных веществ

Влияние на содержание Lactobacillus

о ш н о (И т S

Рисунок 4. Пробиотик B.subtilis в наивысшей из вводимых доз достоверно увеличивал содержание Lactobacillus в каловых массах поросят

подавляет развитие патогенной микрофлоры, что создает условия для заполнения высвободившейся ниши нормальными бактериями. На этот механизм косвенно указывают результаты исследования, в котором поросятам вводили антибиотик неомицина сульфат. Данное средство характеризуется тем, что подавляет рост Escherichia coli, но не влияет на Lactobacillus. В результате прием антибиотика ожидаемо приводил к уменьшению содержания в каловых массах Escherichia coli, но при этом - к увеличению Lactobacillus . Данный феномен возможен только в том случае, если нормальная микрофлора кишечника начинает развиваться за счет подавления патогенных бактерий. То же самое происходит, когда B.subtilis высвобождает свои проти-вомикробные вещества.

Вторая возможность связана с прямой стимуляцией B.subtilis нормальной микрофлоры кишечника, такой как Lactobacillus и Bifidobacterium. На это указывают результаты экспериментов in vitro по созданию смешанных пробиотиков, содержащих B.subtilis и Lactobacillus. Было выяснено, что жизнеспособность лактобацилл в таких комбинациях значительно увеличивалась. Результаты одной из работ свидетельствуют о том, что это может быть связано с высвобождением из B.subtilis ка-талазы и субтилизина .

Интерес представляет еще одно обнаруженное обстоятельство. В некоторых работах было продемонстрировано, что B.subtilis усиливает разнообразие нормальной микрофлоры кишечника. Считается, что это положительно влияет на здоровье организма хозяина. В частности, B.subtilis увеличивала разнообразие микрофлоры кишечника за счет таких бактерий как Eubacterium coprostanoligenes, L.amylovorus, Lachnospiraceae bacterium, L.kitasatonis .

Одно время довольно широко дискутировался вопрос о том, не могут ли пробиотики наносить вред организму хозяина, меняя привычную, годами установившуюся для него микрофлору на чужеродные, искусственно введенные извне бактерии. Однако позже было установлено, что любые пробиотики, принимаемые с медицинской целью, не задерживаются в желудочно-кишечном тракте и после окончания курса

лечения полностью выводятся из него. Применительно к B.subtilis важно учесть еще одно обстоятельство. Данная бактерия, хотя постоянно попадает в пищеварительный канал из почвы, воды, воздуха и пищевых продуктов, тем не менее не колонизирует его (в отличие от Lactobacillus и Bifidobacterium). B.subtilis является своего рода транзитной бактерией, постоянно поступающей и выводящейся из пищеварительной трубки. Поэтому прижиться в кишечнике и изменить стабильный состав нашей микрофлоры B.subtilis не может .

Усиление переваривания и продвижения пищи

Существует большое количество заболеваний и состояний, приводящих к нарушению переваривания и продвижения пищи. Примером могут быть погрешности в диете, изменение рациона питания, болезни желудочно-кишечного тракта (холецистит, панкреатит и др.), нарушения вегетативной нервной системы (приводящие к функциональным расстройствам) и т.д.

Пробиотик на основе B.subtilis может усиливать пищеварение и вторично продвижение пищи за счет выделения пищеварительных ферментов. В исследованиях было установлено, что данные бактерии синтезируют все группы ферментов, необходимые для успешного расщепления пищи: амилазы, липазы, про-теазы, пектиназы и целлюлазы. О высокой активности этих ферментов свидетельствует тот факт, что B.subtilis используют в пищевой промышленности для ферментативной обработки изготавливаемых продуктов .

В пище присутствуют вещества, называемые антипищевыми факторами. Такое название они получили за то, что их присутствие уменьшает доступность одного или нескольких пищевых компонентов из потребляемой пищи. Было установлено, что ферменты B.subtilis разрушают антипищевые факторы, уменьшая их содержание в пище. Это, в частности, касалось общих фенолов, танинов и кофеина. Тем самым увеличивается доступность пищевых компонентов для организма хозяина .

В пище содержатся также вещества, которые у ряда чувствительных лиц могут вызывать аллергические реакции. Однако ферменты B.subtilis способны разрушать эти вещества, уменьшая аллергенный потенциал пищи. Было проведено исследование, в котором подобное действие пробиотика было обнаружено в отношении глиадина (содержится в пшенице) и р-лактоглобулина (присутствует в коровьем молоке) .

Примеры клинических исследований

В данном разделе мы не ставили цель дать исчерпывающий обзор всех доступных клинических исследований B.subtilis. Скорее, было желание на клинических примерах подтвердить работу всех тех пробиотических механизмов, которые были описаны выше.

Кишечные инфекции. В исследование Грачевой и соавт. были включены пациенты с сальмонел-

Частота антибиотикассоциированной диареи

о ш н о (Ч т S

30 25 20 15 10 5 0

Рисунок 5. Пробиотик В.виЫШв достоверно снижал частоту развития диареи у амбулаторных пациентов, принимавших пероральные и внутривенные антибиотики

лезом, пищевой токсикоинфекцией и дизентерией. Одна из выделенных групп больных получала B.subtilis вместе с еще одним пробиотиком (общее количество - 2 109 живых микробных клеток) 2 раза в день в течение 4-10 дней. По итогам исследования было обнаружено выраженное лечебное действие препарата, заключавшееся в ускоренной нормализации стула, исчезновении болей в животе и уменьшении дисбиоза кишечника.

Антибиотикассоциированная диарея. В рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируе-мое клиническое исследование T.V. Horosheva и соавт. были включены амбулаторные пациенты в возрасте > 45 лет, которым назначали один или более пер-оральный или внутривенный антибиотик не менее 5 дней. Одна из групп больных (n = 90) получала пробиотик B.subtilis (2 109 живых микробных клеток) 2 раза в день, начиная за 1 день до инициирования ан-тибиотикотерапии и заканчивая спустя 7 дней после отмены антибиотиков. В результате было установлено, что в группе пробиотика антибиотикассоциирован-ная диарея развивалась лишь у 7,8 % (7/90) пациентов, в то время как в плацебо-группе этот показатель составил 25,6 % (23/90) (p < 0,001) (рис. 5). Пробиотик достоверно снижал частоту появления тошноты, рвоты, метеоризма и абдоминальной боли.

Усиление переваривания и продвижения пищи. В исследование Y.P. Liu и соавт. были включены пожилые (74 ± 6 лет) амбулаторные и стационарные пациенты с функциональными запорами. Одна из групп лечения (n = 31) получала живые микробные клетки B.subtilis в течение 4 недель. По окончании исследования было выяснено, что пробиотик был эффективен у 41,9 % (13/31) больных.

Респираторные инфекции. Данное показание может выглядеть несколько необычно, учитывая, что B.subtilis является пробиотиком, работающим в желудочно-кишечном тракте. Однако при рассмотрении механизмов пробиотического действия бактерии мы упоминали, что ее способность влиять на дыхательные патогены связана со стимуляцией работы иммунной системы.

В 2015 г. сообщество Cochrane опубликовало результаты систематического обзора по применению пробиотиков для предупреждения острых респираторных инфекций (ОРИ). Авторы пришли к выводу, что пробиотики были эффективнее плацебо на 47 % в отношении уменьшения числа эпизодов ОРИ. Кроме того, пробиотики уменьшали длительность ОРИ на 1,89 дня. Пробиотики могут несколько снижать частоту использования антибиотиков и количество дней, пропущенных в школе. Побочные эффекты пробио-тиков были минимальны, чаще отмечались симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта.

Безопасность

Безопасность B.subtilis была протестирована по трем основным направлениям: на наличие патогенных генов, антибиотикорезистентность и точность микробной идентификации .

Патогенные гены. Наличие подобных генов опасно тем, что они приводят к образованию токсинов и других вредных веществ, негативно влияющих на стенку кишечника и организм в целом. Авторы сообщают о том, что эти гены в B.subtilis обнаружены не были. Более того, культивирование данного пробиотика in vitro с эпителиальными клетками кишечника и введение его in vivo самым разным видам животных не приводило к развитию вредных влияний и побочных эффектов.

Антибиотикорезистентность. Этот параметр опасен тем, что если у пробиотика есть гены, способные обусловливать устойчивость к антибиотикам, то они в конечном счете могут быть переданы патогенным бактериям, которые также станут устойчивыми к антибиотикам. Хорошая новость состоит в том, что при тестировании в 3 исследованиях пробиотик B.subtilis оказался чувствительным (нерезистентным) ко всем основным антибиотикам, применяемым в медицине. Следовательно, B.subtilis не может передавать резистентность патогенным бактериям.

Точность микробной идентификации. В 2003 г. было опубликовано исследование, в котором продемонстрировано, что 7 пробиотиков, позиционируемых на фармацевтическом рынке как содержащие B.subtilis, на самом деле содержали другие близкие бактерии. Тем не менее микробиологи сообщают, что сегодня существуют все условия для надежной идентификации B.subtilis. Поэтому правильность состава пробиотика зависит от ответственности выпускающего его производителя.

Следует помнить, что, как и другие пробиотики, B.subtilis не назначают пациентам с выраженным иммунодефицитом (ослабление организма после тяжелых инфекций, лучевой и химиотерапии, пациенты с ВИЧ/СПИДом и т.д.) в связи с возможностью генерализации инфекции и развития сепсиса .

В одной из публикаций были перечислены признаки «хорошего» пробиотика . К ним среди прочего авторы отнесли способность бактерий оказывать

положительное влияние на организм хозяина, например увеличивать резистентность к заболеваниям. Пробиотик должен быть непатогенен и нетоксичен. Он должен быть способен выживать и развиваться внутри желудочно-кишечного тракта - то есть обладать резистентностью к низким значениям рН и органическим кислотам. Как следует из настоящего обзора, все эти свойства присущи пробиотической бактерии B.subtilis.

По данным экспериментальных и клинических исследований, существует целый ряд показаний, когда назначение пробиотика на основе B.subtilis является целесообразным. Прежде всего это включение пробиотика в состав комплексной терапии кишечных инфекций, в том числе диареи путешественников, а также использование его для профилактики респираторных инфекций в холодное время года. Пробиотик будет полезен при проведении курсов пе-роральной или парентеральной антибиотикотерапии для профилактики антибиотикассоциированной диареи. Назначение данных бактерий будет важно при нарушениях переваривания и продвижения пищи различного генеза, связанных с погрешностями в диете, изменением рациона питания, болезнями желудочно-кишечного тракта, нарушениями вегетативной нервной системы и т.д.

Для пробиотиков на основе B.subtilis характерно высокое соотношение эффективности и безопасности.

Список литературы

1. FAO/WHO (2001) Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Expert Consultation Report/FAO/ WHO. - 2001. - ftp://ftp.fao.org.

2. Sorokulova I. Modern Status and Perspectives of Bacillus Bacteria as Probiotics // J. Prob. Health. - 2013. - Vol. 1, № 4. - Numb. of publ. 1000e106.

3. Olmos J., Paniagua-Michel J. Bacillus subtilis A Potential Probiotic Bacterium to Formulate Functional Feeds for Aquaculture // J. Microb. Biochem. Technol. - 2014. - Vol. 6, № 7. - P. 361-365.

4. Evaluation of Bacillus subtilis R0179 on gastrointestinal viability and general wellness: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial in healthy adults/Hanifi A., Culpepper T., Mai V. et. al. // Benef. Microbes. - 2015. - Vol. 6, № 1. - P. 19-27.

5. Leser T.D., Knarreborg A., Worm J. Germination and outgrowth of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis spores in the gastrointestinal tract of pigs // J. Appl. Microbiol. - 2008. - Vol. 104, № 4. - P. 1025-1033.

6. Jadamus A., Vahjen W., Simon O. Growth behaviour of a spore forming probiotic strain in the gastrointestinal tract of broiler chicken and piglets // Arch. Tierernahr. - 2001. - Vol. 54, № 1. - P. 1-17.

7. Fate and Dissemination of Bacillus subtilis Spores in a Murine Model / Hoa T.T., Duc L.H., Isticato R. et al. // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - Vol. 67, № 9. - P. 38193823.

8. The Intestinal Life Cycle ofBacillus subtilis and Close Relatives / Tam N.K.M., Uyen N.Q., Hong H.A. et al. // Journal of Bacteriology. - 2006. - Vol. 188, № 7. - P. 2692-2700.

9. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions // Mol. Microbiol. - 2005. - Vol. 56, № 4. - P. 845-857.

10. Production of Antimicrobial Metabolites by Bacillus subtilis Immobilized in Polyacrylamide Gel/Awais M, Pervez, A., Yaqub Asim, Shah M.M. //Pakistan J. Zool. - 2010. - Vol. 42, № 3. - P. 267-275.

11. Леляк А.А., Штерншис М.В. Антагонистический потенциал сибирских штаммов Bacillus spp. в отношении возбудителей болезней животных и растений // Вестник Томского государственного университета. Биология. - 2014. - № 1. - С. 42-55.

12. Antimicrobial Compounds Produced by Bacillus spp. and Applications in Food/ Baruzzi F., Quintieri L., Morea M., Ca-puto L. // Science against Microbial Pathogens: Communicating CurrentResearch and Technological Advances (Vilas A.M., ed.). - Badajoz, Spain: Formatex, 2011. - P. 1102-1111.

13. Two different lantibiotic-likepeptides originate from the ericin gene cluster ofBacillus subtilis A1/3 / Stein T., Borchert S., Conrad B. et al. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, № 6. - P. 1703-1711.

14. Wang G. Human Antimicrobial Peptides and Proteins // Pharmaceuticals. - 2014. - Vol. 7, № 5. - P. 545-594.

15. Antimicrobial peptides of the genus Bacillus: a new era for antibiotics / Sumi C.D, Yang B.W., Yeo I.C., Hahm Y.T. // Can. J. Microbiol. - 2015. - Vol. 61, № 2. - P. 93-103.

16. Effects ofBacillus subtilis B10 spores on viability and biological functions of murine macrophages/Huang Q., Xu X., Mao Y.L. et al. //Anim. Sci. J. - 2013. - Vol. 84, № 3. - P. 247-252.

17. Modulatory Effects of Bacillus subtilis BS02 on Viability and Immune Responses of RAW 264.7 Murine Macrophages / Huang Q., Li Y.L., Xu X. et al. // Journal of Animal and Veterinary Advances. - 2012. - Vol. 11, № 11. - P. 1934-1938.

18. Immunomodulatory effects of Bacillus subtilis (natto) B4 spores on murine macrophages/Xu X, Huang Q., Mao Y. et al. // Microbiol. Immunol. - 2012. - Vol. 56, № 12. - P. 817-824.

19. Bacillus subtilis-based direct-fed microbials augment macrophage function in broiler chickens/Lee K.W., Li G., Lillehoj H.S. et al. // Res. Vet. Sci. - 2011. - Vol. 91, № 3. - P. e87-e91.

20. Protection from intestinal inflammation by bacterial exopolysaccharides / Jones S.E., Paynich M.L., Kearns D.B., KnightK.L. // J. Immunol. - 2014. - Vol. 192, № 10. - P. 48134820.

21. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter/ Fujiya M., Musch M.W., Nakagawa Y. et al. // Cell Host Microbe. - 2007. - Vol. 1, № 4. - P. 299-308.

22. Zhang Y., Begley T.P. Cloning, sequencing and regulation of thiA, a thiamin biosynthesis gene from Bacillus subtilis // Gene. - 1997. - Vol. 198, № 1-2. - P. 73-82.

23. Crystal structure of thiamin phosphate synthase from Bacillus subtilis at 1.25 A resolution / Chiu H.J., Reddick J.J., Begley T.P, Ealick S.E. //Biochemistry. - 1999. - Vol. 38, № 20. - P. 6460-6470.

24. YaaD and yaaE are involved in vitamin B6 biosynthesis in Bacillus subtilis / Sakai A., Kita M., Katsuragi T. et al. // J. Biosci. Bioeng. - 2002. - Vol. 93, № 3. - P. 309-312.

25. Glycolaldehyde-forming route in Bacillus subtilis in relation to vitamin B6biosynthesis/Sakai A., Katayama K., Katsuragi T., Tani Y // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - Vol. 91, № 2. - P. 147152.

26. Investigation of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase and transketolase of Bacillus subtilis in relation to vitamin B6 biosynthesis / Sakai A., Kinoshita N., Kita M. et al. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). - 2003. - Vol. 49, № 1. - P. 73-75.

27. Ikeda H., Doi Y. A vitamin-K2-binding factor secreted from Bacillus subtilis // Eur. J. Biochem. - 1990. - Vol. 192, № 1. -P. 219-224.

28. Structure and reactivity ofBacillus subtilis MenD catalyzing the first committed step in menaquinone biosynthesis / Dawson A., Chen M, Fyfe P.K. et al. // J. Mol. Biol. - 2010. - Vol. 401, № 2. - P. 253-264.

29. Bentley R., Meganathan R. Biosynthesis of vitamin K (menaquinone) in bacteria // Microbiological Reviews. - 1982. - Vol. 46, № 3. - P. 241-280.

30. Extracellular amino acids of aerobic spore-forming bacteria / Smirnov V.V., Reznik S.R., Kudriavtsev V.A. et al. // Mikro-biologiia. - 1992. - Vol. 61, № 5. - P. 865-872.

31. Chattopadhyay S.P., Banerjee A.K. Production of valine by a Bacillus sp. // Z. Allg. Mikrobiol. - 1978. - Vol. 18, № 4. -P. 243-254.

32. Expression of activation markers on peripheral-blood lymphocytes following oral administration of Bacillus subtilis spores / Caruso A., Flamminio G., Folghera S. et al. //Int. J. Immunophar-macol. - 1993. - Vol. 15, № 2. - P. 87-92.

33. Immunostimulatory activity ofBacillus spores / Huang J.M., La Ragione R.M., Nunez A., Cutting S.M. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2008. - Vol. 53, № 2. - P. 195-203.

34. Sebastian A.P., Keerthi T.R. Immunomodulatory effect of probiotic strain Bacillus subtilis MBTU PBBMI spores in Balb/C Mice // International Journal of Engineering and Technical Research (IJETR). - 2014. - Vol. 2, № 11. - P. 258-260.

35. R&s&nen L., Mustikkam&ki U.P., Arvilommi H. Polyclonal response of human lymphocytes to bacterial cell walls, peptido-glycans and teichoic acids // Immunology. - 1982. - Vol. 46, № 3. - P. 481-486.

36. Effect of Bacillus subtilis natto on growth performance in Muscovy ducks / Sheng-Qiu T., Xiao-Ying D., Chun-Mei J. et al. //Rev. Bras. Cienc. Avic. - 2013. - Vol. 15, № 3. - P. 191197.

37. Assessment of a probiotic based on Bacillus subtilis and its endospores in the obtainment of healthy lungs of pigs / Ayala L., Bocourt R., Milian G. et al. // Cuban Journal of Agricultural Science. - 2012. - Vol. 46, № 4. - P. 391-394.

38. Probiotic strain Bacillus subtilis CU1 stimulates immune system of elderly during common infectious disease period: a randomized, double-blind placebo-controlled study / Lefevre M., Racedo S.M., Ripert G. et al. // Immun. Ageing. - 2015. - Vol. 12. - Numb. of publ. 24.

39. Eerola E., Ling W.H. Intestinal microflora // Encyclopedia of Life Support Systems (EOLSS); http://www.eolss.net.

40. Horosheva T. V., Vodyanoy V., Sorokulova I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial // JMM Case Reports. - 2014. - DOI: 10.1099/ jmmcr.0.004036.

41. Jeong J.S., Kim I.H. Effect of Bacillus subtilis C-3102 spores as a probiotic feed supplement on growth performance, noxious gas emission, and intestinal microflora in broilers // Poult. Sci. - 2014. - Vol. 93, № 12. - P. 3097-3103.

42. Screening ofBacillus strains as potential probiotics and subsequent confirmation of the in vivo effectiveness of Bacillus subtilis MA139 in pigs/ Guo X., Li D., Lu W. et al. //Antonie Van Leeu-wenhoek. - 2006. - Vol. 90, № 2. - P. 139-146.

43. Effects of Bacillus subtilis KN-42 on Growth Performance, Diarrhea and Faecal Bacterial Flora of Weaned Piglets / Hu Y, Dun Y, Li S. et al. // Asian-Australas J. Anim. Sci. - 2014. - Vol. 27, № 8. - P. 1131-1140.

44. Effects of Bacillus subtilis KD1 on broiler intestinal flora / Wu B.Q., Zhang T, Guo L.Q., Lin J.F. //Poult. Sci. - 2011. - Vol. 90, № 11. - P. 2493-2499.

45. Effect of Feeding Bacillus subtilis natto on Hindgut Fermentation and Microbiota of Holstein Dairy Cows / Song D.J., Kang H.Y., Wang J.Q. et al. // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. - 2014. - Vol. 27, № 4. - P. 495-502.

46. Yang J.J., Niu C.C., Guo X.H. Mixed culture models for predicting intestinal microbial interactions between Escheri-chia coli and Lactobacillus in the presence of probiotic Bacillus subtilis//Benef. Microbes. - 2015. - Vol. 6, № 6. - P. 871877.

47. Zhang Y.R., Xiong H.R., Guo X.H. Enhanced viability of Lactobacillus reuteri for probiotics production in mixed solid-state fermentation in the presence of Bacillus subtilis // Folia Microbiol. (Praha). - 2014. - Vol. 59, № 1. - P. 31-36.

48. Improved growth and viability of lactobacilli in the presence of Bacillus subtilis (natto), catalase, or subtilisin / Hosoi T., Ametani A., Kiuchi K., Kaminogawa S. // Can. J. Microbiol. - 2000. - Vol. 46, № 10. - P. 892-897.

49. Helping Patients Make Informed Choices About Probiotics: A Need For Research / Sharp R.R, Achkar J.-P., Brinich M.A., Farrell R.M. // The American journal of gastroenterology. - 2009. - Vol. 104, № 4. - P. 809-813.

50. Crislip M. Probiotics // 2009; https://www.sciencebased-medicine.org.

51. Chan K.Y., Au K.S. Studies on cellulase production by a Bacillus subtilis//Antonie Van Leeuwenhoek. - 1987. - Vol. 53, № 2. - P. 125-136.

52. Sharma A., Satyanarayana T. Microbial acid-stable a-amylases: Characteristics, genetic engineering and applications // Process Biochemistry. - 2013. - Vol. 48, № 2. - P. 201211.

53. Guncheva M., Zhiryakova D. Catalytic properties and potential applications of Bacillus lipases // Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. - 2011. - Vol. 68, № 1. - P. 1-21.

54. Gupta R., Beg Q.K., Lorenz P. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2002. - Vol. 59, № 1. - P. 15-32.

55. Khan M., Nakkeeran E., Umesh-Kumar S. Potential application of pectinase in developing functional foods // Annu. Rev. Food Sci. Technol. - 2013. - Vol. 4. - P. 21-34.

56. Biological treatments affect the chemical composition of coffee pulp/ Ulloa Rojas J.B., Verreth J.A., Amato S., Huisman E.A. // Bioresour. Technol. - 2003. - Vol. 89, № 3. - P. 267-274.

57. Identification of proteolytic bacteria from thai traditional fermented foods and their allergenic reducing potentials / Phrom-raksa P., Nagano H., Boonmars T., Kamboonruang C. // J. Food Sci. - 2008. - Vol. 73, № 4. - P. M189-M195.

58. Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность //Химическая и биологическая безопасность. - 2007. - № 2-3. - С. 32-33.

59. Liu Y.P., Liu X., Dong L. Lactulose plus live binary Bacillus subtilis in the treatment of elders with functional constipation // Zhonghua Yi Xue Za Zhi. - 2012. - Vol. 92, № 42. - P. 29612964.

60. Hao Q., Dong B.R., Wu T. Probiotics for preventing acute upper respiratory tract infections // Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2015. - Iss. 2. - Art. No.: CD006895.

61. Cartwright P. Bacillus subtilis-Identification & Safety // Probiotic news. - 2009. - № 2. - www.protexin.com.

62. Opinion of the Scientific Committee on a request from EFSA related to a generic approach to the safety assessment by EFSA of microorganisms used in food/feed and the production of food/ feed additives // EFSA Journal. - 2005. - Vol. 3, № 6. - DOI: 10.2903/j.efsa.2005.226.

63. Sanders M.E., Morelli L., Tompkins T.A. Sporeformers as Human Probiotics: Bacillus, SporoLactobacillus, and BreviBacil-lus // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. - 2003. - Vol. 2, № 3. - P. 101-110.

64. Chitra N. Bacteremia associated with probiotic use in medicine and dentistry // International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology. - 2013. - Vol. 2, № 12. - P. 7322-7325.

65. Fuller R. Probiotics in man and animals// J. Appl. Bacte-riol. - 1989. - Vol. 66, № 5. - P. 365-378.

Подготовил к.м.н. А.В. Савустьяненко ■

Савустьяненко А.В.

МЕХАШМИ ДМ ПРОБЮТИЮВ НА OCHOBi BACILLUS SUBTILIS

Резюме. Бактерiя В^ыЬНШ е одним 1з найбшьш перспектив-них пробютиив, вивчених в останш десятир1ччя. Мехашзми 11 пробютично! дц пов"язаш 1з синтезом протимжробних ре-човин, посиленням неспециф1чного 1 специф1чного 1муш-тету, стимулящею росту нормально! мжрофлори кишечнику та видшенням травних ферменпв. B.subtilis видшяе рибосо-мально синтезоваш пептиди, нерибосомально синтезоваш пептиди 1 непептидш речовини 1з широким спектром про-тимжробно! активноси, що охоплюе грампозитивш, грам-негативш бактерп, в1руси 1 гриби. Резистентшсть до цих протимщробних речовин виникае рщко. Посилення не-

специсфчного iмунiтету пов"язане з активащею макрофапв i вившьненням 1з них прозапальних цитоишв, пщвищенням бар"ерно! функцп слизово! оболонки кишечнику, видшенням вггамшв i амшокислот (включаючи незамшш). Посилення специсфчного iмунiтету проявляеться активащею Т- i В-лш-фоцитш та вившьненням з останнк iмуноглобулiнiв - IgG та IgA. B.subtilis стимулюе рют нормально! мжрофлори кишечника, зокрема бактерш род1в Lactobacillus i Bifidobacterium. Крiм того, пробютик збшьшуе рiзноманiтнiсть мжрофло-ри кишечника. Пробютик видшяе в просви кишечника ва основш травш ферменти: амшази, лшази, протеази, пектина-

зи i целюлази. На додаток до переварювання "ж цi фермен-ти руйнують aHraxap40Bi фактори i алергенш речовини, що мiстяться в спожитiй iжi. Перераховаш механiзми дп роблять обГрунтованим застосування B.subtilis у складi комплексно! терапп для боротьби з кишковими шфекцшми; профшакти-ки респiраторних iнфекцiй у холодну пору року; профилактики антибютикасоцшовано"! дiареi; для корекцп порушень

переварювання i просування iжi рiзного генезу (погрiшностi в дieтi, змша рацiону харчування, хвороби шлунково-кишко-вого тракту, порушення вегетативно! нервово"! системи та ш.). B.subtilis зазвичай не викликае побiчнi ефекти. Для цього про-бiотика характерне високе стввщношення ефективностi й безпеки.

Ключовi слова: Bаcillus subtilis, пробютик, механiзми дп.

Savustyanenko A.V.

MECHANISMS OF ACTION OF PROBIOTICS BASED ON BACILLUS SUBTILIS

Summary. The bacterium B.subtilis is one of the most promising probiotics studied in recent decades. Mechanisms of its probiotic action are associated with the synthesis of antimicrobial agents, increasing of non-specific and specific immunity, stimulation of growth of normal microflora of the intestine and the releasing of digestive enzymes. B.subtilis releases ribosomally synthesized peptides, non-ribosomally synthesized peptides and non-peptide substances with a broad spectrum of antimicrobial activity covering Grampositive, Gram-negative bacteria, viruses and fungi. Resistance to these antimicrobial agents is rare. Enhancement of non-specific immunity is associated with macrophage activation and the release of pro-inflammatory cytokines from them, increasing of barrier function of the intestinal mucosa, releasing of vitamins and amino acids (including essential ones). Enhancement of specific immunity manifests by activation of T- and B-lymphocytes and the release from the latter of immunoglobulins - IgG and IgA. B.subtilis stimu-

lates the growth of normal intestinal flora, in particular, bacteria of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium. Furthermore, probiotic increases the diversity of intestinal microflora. Probiotic secretes all major digestive enzymes to the intestinal lumen: amylases, lipases, proteases, pectinases and cellulases. In addition to digestion, these enzymes destroy antinutritional factors and allergenic substances contained in the food. These mechanisms of action make reasonable the use of B.subtilis in the combination therapy to treat intestinal infections; prevention of respiratory infections during the cold season; prevention of antibiotic-associated diarrhea; for the correction of food digestion and movement impairments of various origin (errors in the diet, changes in the diet, diseases of the gastrointestinal tract, disorders of the autonomic nervous system, etc.). B.subtilis does not usually cause side effects. This probiotic is characterized by a high efficacy and safety ratio.

Key words: Bacillus subtilis, probiotic, mechanisms of action.

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для получения препарата из группы пробиотиков. Штамм бактерий Bacillus subtilis BKM В-2287 выделен из почвы. Клетки грамположительны, капсулы не образуют, образуют круглые споры, тип дыхания - аэробный. Гидролизует глюкозу, маннит, лактозу. Не сбраживает сахарозу, инозит, сорбит, мальтозу. Не образует газа при сбраживании. Подавляет рост стафилококков, кишечной палочки, энтеробактерий, цитробактерий, аэромонас. Штамм используют как производственный для получения пробиотического препарата, названного авторами "Субтилис+". Препарат нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, птицы, рыбы; перспективен в лечении и профилактике бактериальных инфекций. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, применяемого в ветеринарии при лечении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб.

Известен штамм Bacillus subtilis 534 - продуцент пробиотика “Споробактерин”, который предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов. SU 1708350, кл. А 61 К 35/66.

Недостатком является небольшие сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии, которые не могут длительное время сохранять свои свойства, низкая чистота препарата, что имеет узкую область применения - как кормовая добавка для животных. Штамм также чувствителен к антибиотикам за исключением полимиксина, что ограничивает сферу применения препарата.

Известен штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК №248), несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения пробиотического препарата “Бактиспорин”, который применяют совместно с антибиотиками для лечения и профилактики дисбактериоза, ферментной недостаточности органов пищеварения, гнойных инфекций, пищевой аллергии. RU 2067616 С1, кл. А 61 К 35/74, 10.10.1996.

Известен штамм Bacillus subtilis TPAXC-KM-117, проявляющий ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладающий множественной лекарственной устойчивостью. Штамм резистентен к тетратциклину, рифампицину, аленициллину, хлорамфениколу, апректомицину. На его основе готовят антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одноименной антибиотикотерапии (RU 2118364 С1, кл. С 12 N 1/20, 27.08.1988).

Известен штамм Bacillus subtilis ВКМ B-2250 (RU №2184774, кл. А 61 К 35/74, 10.07.02), который является основой препарата для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является выявление нового эффективного штамма-продуцента пробиотического препарата для ветеринарных целей и рыбного хозяйства.

Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в повышении эффективности лечения, увеличения усвояемости кормов, продуктивности и привесов животных, птицы, рыб за счет использования пробиотического препарата на основе предложенного штамма-продуцента, стабильности препарата при хранении в широком диапазоне температур внешней среды.

Штамм Bacillus subtilis Б-9 выделен из почвы, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. К.Г.Скрябина) под номером ВКМ В-2287.

Штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2287 может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой на основе мясопептонного бульона с обязательным пересевом не реже 1 раза в 2 месяца на эту же среду.

Характеристики штамма.

Культурально-морфологические признаки. Палочки. Размер односуточной агаровой культуры 3-5 мкм. Клетки окрашиваются положительно по Грамму, образуют круглые споры, одиночные, центральные диаметры меньше диаметра клетки. Колонии на МПА белые, пигмент в среду не выделяют.

Физиологические признаки. Аэроб, оптимальная температура роста 37° С и рН 3,5-8,0. Возможен рост в диапазоне температур 4-50° С. Отношение к NaCl - рост при содержании до 3%.

Биохимические признаки. Расщепляет глюкозу, лактозу, маннит. Несбраживаемые соединения углерода: сахароза, инозит, сорбит, мальтоза, лактоза. Утилизирует цитрат и ацетат. При сбраживании не образует газа. Продуцирует оксидазу, каталазу.

Антагонистические признаки. Штамм Bacillus subtilis BKM В-2287 подавляет рост стафилококков, протея, клебсиелл, кишечной палочки, энтеробактерий, цитробактерий, аэромонас, дрожжевых грибов.

Штамм Bacillus subtilis BKM В-2287 не является патогенным для растений, животных, рыбы и человека.

Данные таблицы 1 показывают антагонистическую активность тестовых штаммов микроорганизмов (метод отсроченного антагонизма).

Для культивирования штамма Bacillus subtilis BKM В-2287 используют жидкую питательную среду, содержащую гидролизат казеина - 5 см 3 · дм -3 (N aM =300 мг%); кукурузный экстракт - 80 см 3 · дм -3 (N aм =290 мг %), MnSO 4 5Н 2 О - 0,250 г-дм -3 ; MgSO 4 7H 2 O - 0,300 г-дм -3 ; FeSO 4 7H 2 О - 0,015 г-дм -3 ; CaCl 2 2Н 2 О - 0,052 г-дм -3 ; NaCl - 11,000 г-дм -3 , дистиллированную воду.

Предварительно сухую биомассу микроорганизмов высевают в пробирку с бульоном. При появлении видимого роста колонии пересевают на мясопептонный агар в пробирки.

Отбирают типичные колонии, которые пересевают на жидкую среду во флаконах. Через 22 часа всю выросшую массу переносят в 20-литровую бутыль с 10-ю литрами питательной среды и культивируют 26 часов при 37-39° С, получая посевной материал.

Питательную среду на основе гидролизата казеина помещают в биологический реактор, стерилизуют 60 мин при 1 атм, охлаждают до 39° С и засевают посевным материалом из бутыли в соотношении 1:9.

В процессе аэробного культивирования рН среды поддерживают в пределах (6,8-7,2) ед. рН, подпитывая среду (10-15)% -ной глюкозой до конечной концентрации (0,1-0,2)%. При достижении биологической концентрации по БК (15-20) 10 9 кл.см -3 и (8-10) 10 9 кл.см -3 по БKt прекращают добавление глюкозы до снижения рН 4,0 и отключают подачу воздуха. Затем отключают обогрев реактора, среду охлаждают до (15-19)° С. Полученную охлажденную культуру перекачивают в емкости или расфасовывают во флаконы.

При указанном способе культивирования получают пробиотический препарат в виде жидкой формы с содержанием (80-95)% спор и живых вегетативных клеток бактерий штамма Bacillus subtilis ВКМ В-2287.

Предложенный пробиотический препарат безвреден, не содержит посторонней микрофлоры. Безвредность проверена на белых мышах массой тела (18-20) г, которым перорально вводили препарат в объеме 1,0 мл.

Препарат обладает специфической активностью: количество клеток в одной дозе препарата (8-20)10 9 кл.см -3 , антагонистическая активность - зона задержки роста тестовых микроорганизмов составляет от 10 до 38 мм.

Таким образом, предлагаемый штамм Bacillus subtilis ВКМ В-2287 может быть использован как производственный для получения препарата пробиотического действия, рекомендуемого для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы, рыбы.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Испытания предложенного пробиотического препарата на новорожденных телятах и поросятах.

Эффективность препарата на основе предложенного штамма Bacillus subtilis ВКМ В-2287 была испытана на новорожденных телятах и поросятах с диагнозом диарея, протекавшей на фоне сложной эпизоотической обстановки в хозяйстве. Контрольные группы телят и поросят содержались согласно принятой в хозяйстве технологии. Телятам и поросятам опытных групп дополнительно задавали препарат на основе предложенного штамма Bacillus subtilis BKM В-2287 перорально с небольшим количеством воды за 20 минут до кормления в разовой дозе на голову по 15 мл телятам и по 20 мл поросятам три раза в сутки в течение трех суток. Наблюдения показали, что в опытных группах через сутки после дачи препарата улучшилось общее состояние всех животных, диарея прекратилась, а еще через двое суток все животные были практически здоровы. Состояние животных в контрольных группах характеризовалось продолжением состояния диареи, падеж составил 10% у телят и 22% у поросят.

Пример 2. Добавление пробиотического препарата “Субтилис+” в корм аквариумных рыб.

Проводилось кормление подрощенной молоди золотых рыб (оранда) экструдированным кормом с добавлением пробиотического препарата “Субтилис+”. Количество корма составляло 10 кг, добавленного пробиотика 1 мл. Количество рыб в опытной и контрольной группах составляло по 250 экз. Кормление осуществляли 4-6 раз в сутки. Корм поедался охотно. Темп роста молоди в опытной группе по сравнению с контрольной составил 22%. Выход рыб в опытной - 98%, в контрольной - 78%. Вода в аквариумах не портилась, мутность отсутствовала.

Пример 3. Сохранность цыплят в первые недели.

Проведены испытания “Субтилис+” на цыплятах бройлерной птицефабрики (по 5 птичников в опытной и в контрольной группах). Отход цыплят контрольной группы, не получавших пробиотик, составил 4%, опытных - 0,2%. В опытных группах цыплята более интенсивно набирали вес. После первых трех дней средний вес цыпленка в контрольной группе равнялся 61 г, в опытной - 70 г.

Проведенные испытания показали эффективность препарата “Субтилис+”, получаемого на основе предложенного штамма Bacillus subtilis BKM В-2287.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм бактерий Bacillus subtilis BKM В-2287, используемый для получения пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы.

Формула, химическое название: нет данных.
Фармакологическая группа: органотропные средства/ желудочно-кишечные средства/ противодиарейные средства; иммунотропные средства/ иммуномодуляторы/ другие иммуномодуляторы.
Фармакологическое действие: антибактериальное широкого спектра, иммуностимулирующее, противодиарейное.

Фармакологические свойства

Действующее вещество бациллюс субтилис представляет собой лиофилизированную микробную массу живого антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3H, который был селектирован по признаку хромосомной резистентности к рифампицину из производственного штамма Bacillus subtilis 534. Одна доза лекарственного препарата содержит от одного до пяти миллиардов живых бактерий. Бациллюс субтилис обладают антагонистической активностью, выделяют антибактериальные вещества широкого спектра действия, которые подавляют рост условно патогенных и патогенных грибов, бактерий. При этом рост сапрофитов, включая нормальную микрофлору кишечника, не угнетается. За счет выделения Bacillus subtilis протеолитических ферментов (включая липазы, лизоцим, амилазы и другие) лекарственный препарат способствует расщеплению жиров, белков, клетчатки, углеводов, улучшает переваривание и усвоение пищи, способствует очищению ран, воспалительных очагов от некротизированных тканей. Бациллюс субтилис оказывают выраженное иммуностимулирующее действие, в том числе на переваривающую и поглотительную активность фагоцитирующих клеток крови. Бациллюс субтилис также обладают умеренным антиаллергическим действием.

Показания

Дисбактериоз кишечника различного происхождения (в том числе осложненный аллергодерматозом и пищевой аллергией); острые бактериальные кишечные инфекции (в том числе сальмонеллез, острая дизентерия и другие); бактериальный вагиноз; бактериальный вагинит; остеомиелит (при отсутствии крупных секвестров); хирургические инфекции мягких тканей; лечение и профилактика гнойно-септических осложнений, вызываемых условно патогенными и патогенными микроорганизмами при акушерско-гинекологических и хирургических операциях, в послеоперационном периоде.

Способ применения бациллюс субтилис и дозы

Бациллюс субтилис применяется внутрь за 30 - 40 минут до еды, интравагинально, в виде орошений или аппликаций (на тампоне). При приеме внутрь бациллюс субтилис предварительно растворяют кипяченой остуженной водой. Дозировка, способ применения, длительность лечения устанавливаются индивидуально в зависимости от показаний и возраста пациента.
Лечение острых бактериальных кишечных инфекций, в том числе острой дизентерии, сальмонеллезов, продолжается в течение 7 - 10 суток.
Лечение дисбактериозов после перенесенных бактериальных инфекций или применения антибиотиков продолжается в течение 20 суток.
Лечение аллергодерматозов продолжается в течение 10 - 20 суток.
Лечение бактериального вагиноза, вагинита продолжается в течение 5 - 10 дней.
Профилактика гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде: в течение 5 дней до операции и 5 дней после операции или травмы.
Лечение и профилактики хирургической инфекции мягких тканей продолжается в течение 7 - 10 суток.
При необходимости курс лечения может быть повторен.
При применении бациллюс субтилис по показаниям в рекомендуемых дозах нежелательных реакций не выявлено. В случае развития побочных реакций они полностью проходят в течение суток при снижении дозы или отмене лекарственного препарата.
Действие бациллюс субтилис на женщин во время беременных не изучалось.
Разведенный порошок бациллюс субтилис не подлежит хранению.
С осторожностью назначают бациллюс субтилис при поливалентной лекарственной аллергии.
Бациллюс субтилис не используют при нарушении целостности упаковки, изменении физических свойств, наличии посторонних примесей, отсутствии маркировки.
Применение бациллюс субтилис не оказывает действия на выполнение потенциально опасных видов деятельности, которые требуют повышенной концентрации внимания и быстроты психомоторных реакций.

Противопоказания к применению

Гиперчувствительность (в том числе к вспомогательным компонентам лекарственного препарата).

Ограничения к применению

Поливалентная лекарственная аллергия, детский возраст.

Применение при беременности и кормлении грудью

Действие бациллюс субтилис на женщин во время беременных не изучалось. Бациллюс субтилис может применяться по назначению лечащего врача во время грудного вскармливания.

Побочные действия бациллюс субтилис

Пищеварительная система: диарея, боли в животе.
Прочие: повышение температуры, озноб, кожная сыпь.

Взаимодействие бациллюс субтилис с другими веществами

При совместном использовании бациллюс субтилис с антибиотиками возможно снижение терапевтической эффективности бациллюс субтилис.
При совместном использовании бациллюс субтилис с сульфаниламидами возможно снижение терапевтической эффективности бациллюс субтилис.
Допускается использование бациллюс субтилис совместно с другими лекарственными препаратами по согласованию с лечащим врачом.

Диссертация

Гатауллин, Айрат Гафуанович

Ученая cтепень:

Кандидат биологических наук

Место защиты диссертации:

Код cпециальности ВАК:

Специальность:

Микробиология

Количество cтраниц:

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Микробный антагонизм - основа создания биотерапевтических препаратов для коррекции дисбиотических состояний

Глава 2. Споровые пробиотики и их воздействие на макроорганизм

2.1. Препараты из бактерий рода Bacillus

2.2. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus

2.3. Биологически активные вещества, продуцируемые аэробными спорообразующими бактериями

2.4. Факторы патогенности бактерий рода Bacillus 34 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Объекты и методы исследований

3.1. Объекты исследований

3.2. Методы исследований 43 3.2.1. Оборудование и методики

Глава 4. Характеристика выделенных штаммов

4.1. Изучение морфологических и физиолого-биохимических свойств штаммов

4.2. Антагонистическая и адгезивная активность штаммов B.subtilis в опытах in vitro

4.3. Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов B.subtilis

Глава 5. Влияние штамма B.subtilis 1719 на макроорганизм

5.1. Изучение токсичности, токсигенности , вирулентности и пробиотической активности штамма B.subtilis 1719 в опытах in vivo

5.2. Изучение влияние штамма В.subtilis 1719 на показатели иммунитета в опытах in vivo при экспериментальном дисбиозе

Глава 6. Технологическая характеристика штамма B.subtilis 1719 как основы пробиотического препарата

6.1. Оценка ростовых свойств на различных жидких питательных средах

6.2. Изучение жизнеспособности и антагонистической активности штамма B.subtilis 1719 при хранении

Глава 7. Сравнительная характеристика свойств штамма B.subtilis\l\9 и штаммов, составляющих основу некоторых коммерческих препаратов-пробиотиков. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Биологические свойства штаммов Bacillus subtilis, перспективных для создания новых пробиотиков"

Актуальность проблемы

На современном этапе в медицинской микробиологии появились новые данные, обосновывающие использование сапрофитной микрофлоры, которая способна в процессе своей жизнедеятельности вырабатывать биологически активные вещества (БАВ ), подавляющие рост патогенных микроорганизмов, злокачественных опухолей и нормализующие различные патологические и биохимические процессы в организме человека .

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желу-дочно - кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих

Бактерии рода Bacillus, одна из наиболее разнообразных и широко распространенных групп микроорганизмов, являются важными компонентами экзогенной флоры человека и животных .

Род Bacillus привлекает внимание исследователей с давних времен. Накопленные знания в области микробиологии, физиологии, биохимии, генетики бактерий свидетельствуют о преимуществах Bacillus как продуцентов биологически активных веществ: ферментов, антибиотиков, инсектицидов . Высокая приспособляемость к различным условиям существования (наличие или отсутствие кислорода, рост и развитие в значительном диапазоне температур, использование в качестве источников питания различных органических или неорганических соединений и т.д.) способствуют распространению бацилл в почве, воде, воздухе, пищевых продуктах и других объектах внешней среды, а также в организме человека и животных.

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам , послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Управление по контролю за качеством продовольственных и лекарственных средств США , присвоило Bacillus subtilis статус GRAS (generally regarded as safe) - вполне безопасных организмов, что является обязательным условием для применения этих бактерий в производстве лекарственных препаратов .

Активность бацилл проявляется в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря синтезу разнообразных ферментов и других веществ они регулируют и стимулируют пищеварение, оказывают противоаллергенное и антитоксическое действие. При применении бацилл существенно повышается неспецифическая резистентность макроорганизма. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабильны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Лечебные и профилактические препараты на основе живых непатогенных микробов, способные оказывать при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические и биохимические функции организма хозяина через оптимизацию его микробиологического статуса, относят в настоящее время к препаратам - пробиотикам .

Из бацилл наибольший интерес вызывают штаммы В. subtilis. По изученности генетических и физиологических свойств они занимают второе место после Е. coli. О больших возможностях В. subtilis в биотехнологии свидетельствует факт создания банка данных по молекулярной генетике этого штамма -SubtiList, в который вносится вся информация о бактериальном геноме .

На основе живых бактерий рода Bacillus, созданы препараты - пробиоти-ки, которые безвредны для макроорганизма, имеют широкий диапазон лечебно-профилактического действия и экологическую безопасность . Важное научно-практическое значение имеют результаты, посвященные использованию живых микробных культур рода Bacillus для лечения желудочно-кишечных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных .

В настоящее время в практическом здравоохранении широко используют известные препараты - пробиотики: бактисубтил , споробактерин, биоспорин, бактиспорин, субалин, цереобиоген , энтерогермин и другие .

Показания к лечебному применению и терапевтическая эффективность этих препаратов ограничивается свойствами штаммов , используемых для их производства. Определяющее значение при этом имеет спектр антагонистической активности против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являющихся причиной нарушения микроэкологии в различных биотопах организма человека или животных. Кроме того, нельзя не учитывать способности бацилл к продукции БАВ (полипептидные антибиотики, ферменты и др.) и их антибиотикорезистентности.

Многообразие и возникающая антибиотикоустойчивость микроорганизмов, участвующих в развитии дисбиотических нарушений, с одной стороны, а также вариабельность биосинтетических возможностей у разных штаммов B.subtilis, с другой, обуславливают целесообразность постоянного мониторинга штаммов, обладающих направленной пробиотической активностью и/или являющихся продуцентами различных БАВ.

Цель работы:

Изучить биологические свойства выделенных штаммов B.subtilis и оценить возможность их использования для разработки оригинального спорового пробиотика.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические, физиолого-биохимические, антагонистические, адгезивные и другие свойства выделенных культур B.subtilis в опытах in vitro и выбрать для дальнейших исследований наиболее перспективный штамм .

2. Оценить пробиотическую активность выбранного штамма B.subtilis в опытах in vivo.

3. Подобрать питательную среду, оптимальную для накопления биомассы изучаемого штамма B.subtilis.

4. Определить жизнеспособность и антагонистическую активность выбранного штамма B.subtilis при хранении.

5. Сравнить свойства оригинального штамма B.subtilis и культур, используемых для изготовления коммерческих препаратов-пробиотиков.

Научная новизна.

На основе изучения морфологических, физиолого-биохимических, генетических и других биологических свойств выделенных штаммов отобран бес-плазмидный штамм B.subtilis 1719, проявляющий антагонизм против условно патогенных и патогенных микроорганизмов различных таксономических групп, обладающий низкой адгезивной активностью, устойчивый к гентамицину, по-лимиксину и эритромицину.

Экспериментально обоснованы подходы к созданию производственной технологии, включающие изучение ростовых свойств штамма В.subtilis 1719 на оригинальных питательных средах, условий стабилизации его жизнеспособности и антагонистической активности как этапов получения нового препарата-пробиотика.

Подана заявка на изобретение (№2005111301 от 19.04.2005 г.): «Штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов».

Практическая значимость.

Выделенный и идентифицированный штамм B.subtilis 1719 депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича под №277 и может быть рекомендован для разработки промышленной технологии получения оригинального биотерапевтического препарата-пробиотика.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные три штамма бактериальных культур по морфологическим, физиолого-биохимическим и другим свойствам соответствуют виду В. subtilis. Они не содержат плазмид , антагонистически активны в отношении условно патогенных и патогенных бактерий разных таксономических групп, имеют низкий или средний уровень адгезии.

2. Штамм B.subtilis 1719 обладает пробиотическими свойствами, проявляющимися в элиминации условно патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением количественного и качественного состава нормальной микрофлоры при экспериментальном дисбиозе, а также оказывает иммуномодули-рующее действие на макроорганизм.

3. По технологическим характеристикам штамм B.subtilis 1719 можно рекомендовать в качестве кандидата для создания оригинального препарата-пробиотика.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме "Микробиология", Гатауллин, Айрат Гафуанович

1. На основании морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенные штаммы идентифицированы как B.subtilis. В препаратах ДНК штаммов B.subtilis плазмид не обнаружено, что, по-видимому, указывает на хромосомный контроль антибиотикорезистентности.

2. На модели дисбиоза белых мышей показана пробиотическая активность штамма B.subtilis 1719, проявляющаяся в элиминации условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с восстановлением качественного и количественного состава нормальной микрофлоры.

3. Оптимальной средой для накопления биомассы при культивировании штамма B.subtilis 1719 является среда ВК-2 с добавлением в качестве источника углеводов глюкозы или сахарозы .

4. Установлено, что штамм B.subtilis 1719 сохраняет жизнеспособность и антагонистическую активность в лиофилизированном состоянии с сахаро-зо-желатиновым стабилизатором не менее 4 лет (срок наблюдения), в жидкой форме, стабилизированной 7% раствором NaCl - 2 года, и 1 год в присутствии дистиллированной воды или 10% раствора глицерина.

5. Антагонистически активный, низкоадгезивный , бесплазмидный, нетоксичный штамм B.subtilis 1719, обладающий пробиотической и иммуно-модулирующей активностью, депонирован в Государственной коллекции культур ГИСК им. J1.A. Тарасевича.

6. Штамм B.subtilis 1719 (277) по биологическим свойствами и основным технологическим характеристикам перспективен для использования при разработке новых препаратов-пробиотиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытия и достижения современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику новые биопрепараты - пробиотики. Основу этих лекарственных средств составляют живые микробные культуры. В основе лечебного действия этих препаратов лежит выраженный микробный антагонизм в отношении патогенных и условно патогенных штаммов - возбудителей болезней. В процессе лечения не менее важной является иммуномодулирующая активность пробиотиков. Неоспоримые преимущества препаратов из живых бактерий перед лекарствами, синтезированными химическим путем, это - безвредность, их физиологич-ность для организма человека, отсутствие аллергических реакций,. Уже сейчас пробиотики заняли лидирующие позиции при коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта, нарушениях обмена веществ, лечении последствий антибактериальной, химио-, гормональной и лучевой терапии. В ре зультате исследования феномена транслокации бактерий показано, что пробиотики могут с успехом заменять антибиотики и протеолитические ферменты при профилактике и лечении различных хирургических инфекций.

В последнее десятилетие для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта широко используют биопрепараты на основе живых микробных культур спорообразующих бактерий .

Разнообразие метаболических процессов, генетическая и биохимическая вариабельность, устойчивость к литическим и пищеварительным ферментам , послужили обоснованием использования бацилл в различных областях медицины. Эти микроорганизмы технологичны в производстве, стабиль> ны при хранении и, что существенно важно, экологически безопасны .

Высокая активность у штаммов против одного набора тест - культур не гарантирует его активности против других. В связи с этим использование спорового пробиотика ограничено конкретными лечебными целями. Вариабельность нозологических форм гнойно-септических заболеваний и многообразие этиологически значимых для развития дисбиотических нарушений микроорганизмов определяют требования к используемому биопрепарату. Это побуждает исследователей к постоянному скринингу штаммов-антагонистов с заданными свойствами.

Изученные нами штаммы обладали морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами, типичными для представителей В. subtilis, и характеризовались набором ферментов , расщепляющих различные субстраты.

По данным литературы B.subtilis обладают выраженными антагонистическими свойствами в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов и высокой ферментативной активностью, за счет чего нормализуют процессы пищеварения, а также обеспечивают антитоксический и противоаллергический эффект .

Исследованные штаммы B.subtilis имели широкий спектр антагонистической активности, низкий (В. subtilis № 1719) или средний (В. subtilis № 1594, В. subtilis № 1318) уровень адгезии.

Таким образом, изученные нами штаммы характеризовались высокой пробиотической активностью. Однако изучение биохимических свойств показало, что штамм B.subtilis 1719 обладал более высокой ферментативной активностью (протеазной , амилазной, липазной), что выражалось в наибольшей зоне гидролиза исследуемых субстратов . Кроме того, низкий уровень адгезивной активности штамма В.subtilis 1719 и, по-видимому, его природная антибиотикоустойчивость , контролируемая хромосомой, позволили сделать заключение о перспективности дальнейшего изучения этой культуры.

На наш взгляд, перспективы для расширения промышленного выпуска препаратов на основе рода Bacillus очень велики.

Бациллы способны секретировать в культуральную жидкость множество ферментов. Они служат важным промышленным объектом для получения протеолитических и амилолитических ферментов, используемых для производства пищевых продуктов, детергентов и медико-биологических субстанций . В последнее десятилетие с их участием получен ряд новых антибиотиков, бактериальных инсектицидов и других биологически активных веществ .

Несмотря на то, что В. subtilis имеют статус GRAS, в литературе имеются единичные сообщения о наличии факторов патогенности , у некоторых штаммов В. subtilis. Указывается, что это не является постоянным признаком, поскольку исчезает при пересевах . Высказано предположение о взаимосвязи патогенных свойств бактерий с наличием у них плазмид . Например, Le Н. и Anagnostopoulos С. выделили плазмиды из 8 штаммов В. subtilis у 83 обследованных. Плазмидные ДНК были определены только в клетках токсигенных штаммов В. subtilis и не обнаружены в клетках других штаммов одного вида, не обладающих токсигенностью . Элиминация плазмид из токсигенных штаммов под воздействием элиминирующих агентов приводила к устранению токсигенных свойств фильтратов культур. Однако генетическая роль плазмид изучена недостаточно.

В проведенных нами исследованиях, в препаратах выделенной ДНК трех изученных штаммов В. subtilis плазмид не обнаружено.

Авторы, изучавшие воздействие бацилл на организм теплокровных, пришли к заключению, что штаммы В. subtilis совершенно безвредны для человека и животных. Доказательством безвредности для макроорганизма служат экспериментальные данные о том, что уже через несколько дней после парентерального введения, B.subtilis элиминируется из организма . Механизмы лечебного действия этих культур изучали на животных. В настоящее время считают, что терапевтический эффект споровых пробиотиков определяется комплексом факторов, в их числе: продуцирование культурами В. subtilis бактериоцинов , подавляющих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов; синтез высокоактивных ферментов: протеаз , рибонуклеаз, трансаминаз и др.; продуцирование субстанций, нейтрализующих бактериальные токсины.

Изучение свойств выбранного штамма на мышах показало, что он ави-рулентен, не обладает токсичностью и токсигенностью.

Факторами положительного воздействия пробиотиков на макроорганизм являются различные продукты микробного синтеза: аминокислоты, полипептидные антибиотики, гидролитические ферменты и ряд других биологически активных субстанций, имеющих меньшее значение. Поэтому изучение и выделение протективных субстанций, продуцируемых микроорганизмами рода Bacillus, и создание на их основе медико-биологических препаратов является насущной необходимостью .

В желудочно-кишечном тракте проявляется прямое антагонистическое действие бацилл, которое носит преимущественно избирательный характер в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время они характеризуются отсутствием антагонизма в отношении представителей нормальной микрофлоры.

В проведенных нами исследованиях при коррекции экспериментального дисбиоза, индуцированного введением антибиотика доксициклина, культура В. subtilis 1719 способствовала нормализации состава и численности кишечной микрофлоры, а также элиминации условно патогенных микроорганизмов в пристеночной и просветной микрофлоре.

Из литературных данных следует, что производственные штаммы рода Bacillus обладают низким индексом адгезивной активности к эритроцитам и слабой или средней адгезивностью к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы B.subtilis 534 и ЗН имеют больше адгезинов к рецепторам энтеро-цитов, штамм В. licheniformis - к колоноцитам , т.е. у разных штаммов по-видимому, имеются адгезины к рецепторам разных клеток кишечника .

Их активность осуществляется в просвете кишечника и направлена в отношении патогенных микроорганизмов, не оказывая антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры. При приеме споровых пробиотиков реализуется возможность восстановления аутофлоры в различных локусах кишечника, и через 3-5 суток количество лактобактерий, бифи-добактерий, кишечных палочек и др. увеличивается, а затем восстанавливается до нормальных показателей .

Результаты проведенных нами исследований по изучению адгезии микроорганизмов на энтероцитах, позволяют с большей вероятностью утверждать, что адгезивная способность клеток кишечника зависит от количественного и качественного состава нормальной микрофлоры. При дисбиоти-ческих состояниях происходит открытие рецепторов на поверхности энтероцитов, на которые прикрепляются условно патогенные и патогенные микроорганизмы, а при коррекции дисбиоза происходит колонизация кишечника нормальной микрофлорой и происходит уменьшение количества рецепторов энтероцитов, способных адгезировать на своей поверхности неиндигенные микроорганизмы.

Известно, что нормальная микрофлора играет важную пусковую роль в механизме формирования иммунитета и специфических защитных реакций в постнатальном развитии макроорганизма .

Роль микрофлоры в развитии иммунного ответа обусловлена ее универсальными иммуномодулирующими свойствами, которые включают им-муностимуляцию и иммуносупрессию. Установлено, что бактериальные ли-пополисахариды (ЛПС ) оказывают иммунорегулирующее действие на Ig А -иммунный ответ и играют роль адъювантов. Микрофлора обеспечивает развитие комплекса неспецифических и специфических иммунологических реакций, формируя адаптационно-защитные механизмы .

Какой бы высокой антимикробной активностью не обладало лекарственное средство, решающая роль в ликвидации инфекционного патологиче ному статусу. Создание препаратов, эффективных по антимикробным показателям и стимулирующих реакции иммунитета, представляется важной задачей. Поэтому большое количество исследований направлено на изучение влияния препаратов - пробиотиков на разные звенья иммунной системы человека и животных.

Введение живых культур аэробных бацилл заметно стимулирует in vivo продукцию сывороточного интерферона и интерферона, индуцированного in vitro вирусом болезни Ньюкастла .

В ряде работ указывается на то, что препараты - пробиотики оказывают иммуномодулирующее действие, восстанавливая нарушенный патологией иммунный статус, увеличивая продукцию эндогенного интерферона, усиливая функциональную активность макрофагальных клеток, повышая фагоцитарную активность лейкоцитов крови - моноцитов и нейтрофилов .

Нашими исследованиями показано, что культура В. subtilis 1719 достоверно изменяла метаболическую активность нейтрофилов при коррекции дисбиоза и не вызывала изменений функциональной активности нейтрофилов при нормальном состоянии индигенной микрофлоры. Кроме того, установлено, что дисбиоз сопровождался повышением уровня ФНО-а, что свидетельствовало о выраженной фагоцитарной, цитотоксической, адгезивной активности макрофагов, лимфоцитов, а также клеток эндотелия и эпителия тонкой кишки.

Повышенная секреция провоспалительного цитокина у мышей с дис-биозом, вероятно, отражает активацию иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов, моноцитов/макрофагов). Под влиянием культуры B.subtilis 1719 * наблюдали снижение продукции ФНО-а. Введение культуры интактным животным, изменений уровня продукции ФНО-а не вызывало.

Учитывая, что ФНО-а является маркером воспалительных реакций, сделан вывод о важной роли пробиотика в повышении противовоспалительной активности иммунокомпетентных клеток у животных.

Проведенные исследования по изучению динамики продукции цитоки-нов под влиянием штамма B.subtilis 1719 показали, что культура не оказывала влияния на продукцию цитокинов в первые часы после введения, кроме IL-lp, количество которого накапливалось постепенно. Уровень других изученных цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y) значительно возрос в интервале от 12 до 24 ч.

Таким образом, модуляция клеток иммунной системы и изменение потенциала цитокинов может быть одним из механизмов, посредством которого культура В. subtilis 1719 способствует коррекции дисбиоза.

Анализ результатов научных исследований, проводимых у нас в стране и за рубежом, свидетельствует о масштабах использования бактерий рода Bacillus для получения продуктов из биомассы бактерий или их метаболитов. Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основой для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. .

При изучении ростовых свойств культуры В. subtilis 1719 на различных жидких питательных средах, установлено, что для максимального накопления биомассы наиболее адекватным субстратом для культивирования штамма можно считать среду ВК-2 с добавлением глюкозы или сахарозы

В настоящее время при отборе и характеристике производственных культур микроорганизмов учитываются, главным образом, следующие показателя биологической характеристики: спектр и уровень антагонистической активности, технологичность, т.е. способность к быстрому накоплению био* массы, устойчивость к лиофильному высушиванию, жизнеспособность при хранении. Особое внимание уделяется критериям степени безопасности используемых микроорганизмов для здоровья человека .

В проведенных исследованиях по оценке жизнеспособности микробных клеток B.subtilis 1719 при хранении в присутствии жидких стабилизаторов выявлено, что оптимальным стабилизатором является 7% раствор NaCl, который позволял сохранять жизнеспособность и антагонистические свойства штамма в течение 2 лет. Для сохранения свойств культуры в течение 1,5 лет возможно использование 10% раствора глицерина, 1 года - дистиллированной воды, при этом установлено, что указанные наполнители, статистически значимых влияний на антагонистические свойства штамма B.subtilis 1719 не оказывали. Необходимо отметить, что важным фактом является способность штамма B.subtilis 1719 сохранять антагонистическую активность в отношении S.sonnei и S.aureus в жидких стабилизаторах длительный срок -36 мес. (срок наблюдения).

Лиофильное высушивание с сахарозо-желатиновым стабилизатором сохраняло жизнеспособность и антагонистическую активность штамма B.subtilis 1719 в течение 4 лет (срок наблюдения).

Сравнительное изучение штамма B.subtilis 1719 по антагонистической и адгезивной активности с коммерческими культурами следующих пробиоти-ческих препаратов: Споробактерин, Россия (В. subtilis 534), Цереобиоген, Китай {В.cereus DM423), Субтил, Вьетнам {В.cereus var. vietnami), Бактисубтил, Франция (B.cereus IP5832), Нутролин, Индия (B.coagulans), показало, что выделенный штамм является оригинальным и может быть рекомендован в качестве производственного, при получении нового препарата-пробиотика.

Таким образом, по физиолого-биохимическим свойствам штамм B.subtilis 1719 имеет четко различимые индивидуальные признаки, занесенные в паспорт культуры при депонировании в коллекции культур ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Кроме того, доминирующее положение выделенного штамма B.subtilis 1719 по антагонистической активности свидетельствует о перспективности использования этой культуры для разработки на его основе пробиотического препарата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гатауллин, Айрат Гафуанович, 2005 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медизд, 1962, 180 с

2. Байбаков В.И., Карих Т.Л., Борукаева Л.А. и др. Нормализация кишечной микрофлоры и общего состояния мышей линии JCR под влиянием концентрата бифидобактерий.//Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, №3. - С. 20-24.

3. Байда Г.Е., Бударина Ж.И. Первичная структура и анализ гена гемолизина II Bacillus cereus // 2 Откр. гор. науч. конф. мол. Ученых г. Пущино , 23-25 апр. 1997: Тез. докл. Пущино. - 1997 - С. 45-46.

4. Байда Г.Е., Кузьмин Н.П. Ген HLY-III Bacillus cereus, клонированный в Escherichia coli, кодирует новый поро-формирующий гемолизин // Междун. конф. посвящ. памяти акад. А.А.Баева: Тезисы докл., Москва, 20-22 мая 1996. М. - 1996. - С. 108, 291.

5. Барановский А.Ю., Кондрашина Э.А. Дисбактериоз и дисбиоз кишечни-ка//СПб. «Питер ». -2000. -209 с.

6. Баханова Е.М., Николаев С.М., Николаева И.Г., и др. Раст. ресурсы. 2001 . Т. 37, вып. 1. С. 70-76. Влияние экстракта из побегов Pentaphylloides fruticosa на течение экспериментальных дисбактериозов кишечника, вызванных сульфадиметоксином и изониазидом

7. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ильичев А.А. Перспективы конструирования иммунопрепаратов на основе рекомбинантных бацилл // Новые направления биотехнологий: Тез. док. YI Конф. РФ, 24-26 мая, 1994. Пущино. -1994.-С. 68.

8. Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Масычева В.А. Рекомбинантные пробио-тики: проблемы и перспективы использования для медицины и ветеринарии // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всеросссийской научно-практической конф. М. - 1996. - С. 7.

9. Белявская В.А., Чердынцева Н.В., Бондаренко В.М., и др. Биологические эффекты интерферона, продуцируемого рекомбинантными бактериями препарата пробиотика Субалина. Журн. микробиол ., 2003, №2, с. 102-109.

10. Беляев Е.И. Пути усовершенствования препаратов, нормализующих микрофлору кишечника / Респ. сборник научных трудов: «Аутофлора человека в норме и патологии. Горький. - 1988. - С. 74-78.

11. Билибин А. Ф. //Тер. арх. -1967. № 11. - С. 21-28.

12. Билибин А. Ф. // Клин. Медицина. 1970. - № 2. - С. 7-12.

13. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам обследования. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. М.: Медицина, 1982. - С. 180.

14. Блинкова Л.П., Семенов С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // ЖМЭИ. 1994. -N5.-С. 71-72.

15. Бойко Н.В., Туряница А.И., Попович Е.П., Вьюницкая В.А. Антагонистическое действие культур Bacillus subtilis на бактерии рода Klebsiella / Микробиол. ж. 1989. - Т. 51, N 1. - С. 87-91.

16. Бойко Н.В., Лисецька М.В. Розробка пробютиюв виб1рковощн: Протискле-ромна ефектившсть деяких штам1в В. subtilis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 194-198.

17. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН . -М.- 1997.-N3.-C. 7-10.

18. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их лечебного действия // Эксперим. и клин, гастроэн-терол. 2004. № 3. С. 83-87.

19. Бочкарева Н.Г., Белогорцев Ю.А., Удалова Э.В. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент комплекса гидролитических ферментов , обогащенных b-глюканазой // Пат. N 2046141 Россия, С12 N 9/42, Опубл. 20.10.95. - Бюл. N 29.

20. Брилис В.И. Адгезивные свойства лактобацилл //Автореф. дис. канд. мед. наук. Тарту. -1990. - 25 с.

21. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Адгезивные и ге-магглютинирующие свойства лактобацилл . Журн. микробиол., 1982, 9: 7578.

22. Васильева В.Л., Тацкая В.Н., Резник С.Р. Опыт применения растительного и микробного адъювантов при получении иммунных асцитных жидкостей у лабораторных животных // Мжробюл. журн. 1974. Т. 36, N 3. - С. 358-360.

23. Вершигора A.E. Основы иммунологии // Киев: Вища школа. 1975. - 319 с.

24. Винник Ю.С., Перьянова О.П., Якимов С.В. и др., Метод лечения гнойных ран с использованием антагонистов / International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 4., С. 143.

25. Виноградов Е.Я., Шичкина В.П. Штамм бактерии В. mucilaginosus в качестве продуцента биостимулятора неспецифического иммунитета у телят // А.с. 1210452, СССР -1/00. Опубл. 27.04.96. - Бюл. N 12.

26. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.Итоги науки и техники: Биофизика 1989; 24: 172.

27. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбакте-риозы актуальная проблема медицины //Вестник АМН . -1997. - № 3. -С.3-9.

28. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Зуденкова А.Е., Буданова Е.В. Сравнительное изучение пристеночной и просветной микрофлоры толстой кишки в экспериментах на мышах . Журн. микробиол., 2001, 1: 62-67.

29. ВоробьевА.А., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника человека. Журн. микробиол., 2003, 1: 6063.

30. Вьюницкая В.А., Бойко Н.В., Спивак Н.Я., Ганова Л.А./ Некоторые механизмы действия новых микробиотиков // Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства: Сборник тезисов Алма-Ата, 1990. - С. 17.

31. Галаев Ю.В. Патогенные ферменты бактерий // М.: Медицина. 1968. - 115 с.

32. Гончарова Г.И., Семенова А.П., Лянная A.M., и др. Количественный уровень бифидофлоры в кишечнике и его коррелятивная связь с состоянием здоровья человека.// Антибиотики и микроэкология человека и животных. -1988.-С.118—123

33. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.//Диссертация в форме научного

34. Грачева Н.М., Гончарова Г.И. и др. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение при дисбактериозе кишечника. Методические рекомендации. 1986, С. 23

35. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Аваков А.А. и др. - Новые лекарственные препараты. 1994, №1, С. 3-12

36. Грачева Н.М., Гаврилов А.Ф., Соловьева А.И. и др. Эффективность нового бактерийного препарата биоспорина при лечении острых кишечных инфекций // Журн. микробиол. 1996. - N 1. - С. 75-77.

37. Гребнева A.J1., Мягкова Л.П. Кишечный дисбактериоз//Руководство по гастроэнтерологии в 3 т. М., 1996. -Т.З. -С.324-334

38. Григорьева Т.М., Кузнецова Н.И., Шагов Е.М. Штамм Bacillus thuringiensis 4КН, синтезирующий экзотоксин со специфической активностью против колорадского жука// Биотехнология. 1994. - N 9-10. - С. 7-10.

39. Гулько М.А., Казаринова JI.A., Позднякова Т.М. Способ получения инозина // Пат. N 175583, С12Р 19/32. Опубл. 30.08.94. - Бюл. N 16.

40. Демьянов А.В., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Диагностическая ценность исследования уровней цитокинов в клинической практике. Журнал Цитоки-ны и воспаление, 2003, Т. 2, № 3, с. 20-35

41. Егоров Н.С., Зарубина А.П., Выборных С.Н., Ландау Н.С. Синтетическая * среда для выращивания бактерий рода Bacillus // Вестник МГУ . 1989. N 4.1. С. 52.

42. Ермакова Л.М., Смирнова Т.А., Алиханян С.И. и др., Кристаллические включения у мутанта Bacillus subtilis с измененным спектром протеиназ // Докл. АН СССР. 1977. - Т. 236, N 4. - С. 1001-1003.

43. Жирков И.Н., Братухин И.И. Применение пробиотика РАС для коррекции дисбактериозов у телят// Ветеринария. 1999. N 4. - С. 40-42.

44. Згонник В.В., Фуртат И.М., Василевская И.А. и др. Антагонистические свойства спорообразующих бактерий, контаминирующих процесс производства лизина//Микробиол. ж. 1993. -Т.55, N4. - С. 53-58.

45. Зинкин В.Ю. Фотометрический НСТ-тест с нейтрофилами крови человека и его клинико-иммунологическая значимость у больных с травмой опорно-двигательного аппарата. Автореф. дис. канд. мед. наук.- Москва, 2004.

46. Зуденков А.Е. Микрофлора и состав иммунокомпетентных клеток пристеночного муцина толстой кишки в норме и при некоторых патологических состояниях. Автореф. дис. канд. мед. наук,- Москва, 2001.

47. Ивановский А.А., Новый пробиотик бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария. 1996 - N11. - С. 34-35.

48. Ивановский А.А., Вепрева Н.С., Зимирева В.В., Лагунова О.П. Способ получения пробиотика для ветеринарии / RU Патент N 2084233, опубл. 20.07.97. Бюл. N 20.

49. Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Смирнов О.В. Итоги и перспективы применения бактокулицида // Совр. достиж. биотехнол.: Матер. 1 Конф. Сев.-Кавк. региона, Ставрополь, сент. 1995. Ставрополь. - 1995. - С. 14-15.

50. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры.//Русский медицинский журнал. 2000. - Т. 8, №13-14. - С. 572-575.

51. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Рубакова Э.И. Система цитокинов. М., 2000.

52. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережнизкая Т.Г. и др. Бактерии рода 4 Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней.// Мшробюл. ж. - 1995.- Т.57, N 5. - С. 69-78.

53. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. М., 1979. -198 с.

54. Кудрявцев В.А.,Сафронова JI.A., Осадчая А.И. и др. Влияние живых культур Bacillus subtilis на неспецифическую резистентность организма // Мик-робиол. ж. 1996 - Т.58, N 2. - С. 46-53.

55. Кузнецова Н.И., Смирнова Т.А., Шамшина Т.Н. и др. Штамм Bacillus thuringiensis, токсичный для комнатной мухи // Биотехнология. 1995. -N3-4.-С. 11-14.

56. Лапчинская А.В., Шендеров Б.А. Коррекция дисбактериозов, вызванных цефалексином, некоторыми иммуномодуляторами.//Медицинские аспекты микробной экологии. М., 1991. -С.70—79

57. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.Т., Микельсаар М.Э. с соавт. Лактофлора и колонизационная резистентность.//Антибиотики и мед. биотехнология. -1987. -32. -№3. -С. 173-180.

58. Лещенко В.М. Клиника, диагностика и лечение висцерального кандидамикоза . Методические рекомендации. М., 19871.

59. Лисецька М.В. Експериментальне визначення антагонютичжм активносп штам1в Bacillus subtilis щодо Klebsiella rhinoscleromatis // Наук. вюн. Ужгор. ун-ту. Сер. Бюл. 1997. - N 4. - С. 207-212

60. Лопатина Т.К. с соавт. Иммуномодулирующее действие препаратов* эубиотиков //Вестник РАМН. М., «Медицина ». -1997. №3. -С.30-34

61. Лукин А.А. Антибиотикообразование и споруляция у плазмидных и бес-плазмидных микроорганизмов // Пущино. 1978. - С. 25-28.

62. Мазанкова JI.H., Михайлова Н.А., Курохтина И.С. и др. Бактиспорин новый пробиотик для лечения острых кишечных инфекций у детей// Человек и лекарство: Тез. докл. V Российского Национального Конгресса, Москва, 8-12 апреля 1997г. - М. - С. 199.

63. Мазанкова Л.Н., Ваулина О.В. Новые лекарственные средства для коррекции дисбиотических нарушений.//Детский доктор. 2000. №3. - С. 51-53.

64. Маниатис Т., Френч Э., Сэмбрук Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование, 1984.

65. Марков И.И., Жданов И.П., Марков А.И. Штамм Bacillus subtilis МЖ-6 антагонист микобактерий туберкулеза // Пат. N 2120992, С 12N 1/20. - Опубл. 27.10.98.-Бюл.N30.

68. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А. и др., Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis II Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. Саратов. -1998.-7 с.

69. Митрохин С.Д. // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - № 8. - С.46 - 50.

70. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс-диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автореферат дис. д-ра мед. наук, М., 1998. 37 с.

71. Митрохин С.Д., Ардатская М.Д., Никушкин Е.В., Иваников И.О. и др. - М., 1997. 45 с. Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбакте-риоза (дисбиоза) кишечника в клинике внутренних болезней (Методические рекомендации).

72. Митрохин С.Д., Шендеров Б.А.Микробиологические и биохимические показатели изменения микробной экологии толстой кишки крыс под влиянием рифампицина. Антибиотики и химиотерапия - 1999, Т. 34 № 6 (482-4).

73. Молчанов O.JL, Позняк A.JI. Применение биоспорина в комплексной терапии бактериального вагиноза // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. С. 187.

74. Музыченко JI.A., Сенаторова В.Н., Альховская JI.JI. и др. Морфометрический анализ развития микроорганизмов / Биотехнология. 1990. - N 3. - С. 3-6.

75. Мюллер Г., Литц П., Мюнх Г. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения// М.:Б.и..- 1977.- С.343 347

76. Никитенко В.И. Бактериальный препарат для профилактики и лечения вос-«. палительных процессов и аллергических заболеваний // Международная заявка. N 89/09607, WO, публ. 19.10.1989.

77. Никитенко В.И. Вместо лекарств бактерии // Наука в СССР. - 1991. - N 4. -С. 116-121.

78. Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения молочного продукта, предназначенного для лечения диатеза, дисбак-териоза и бактериальных инфекций // А.с. N 1648975, S.U. публ 15.05. 91.

79. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus pulvifaciens, используемый для изготовления лечебно-профилактического препарата против бактериальных инфекций у животных // А.с. N 1723117, S.U. публ. 12. 1992.

80. Никитенко В.И., Никитенко И.К. Штамм бактерий Bacillus subtilis, используемый для получения препарата для профилактики и лечения противовоспалительных процессов и аллергических заболеваний // А.с. N 1723116, S.U. опубл. 12. 1992.

81. Никитенко Л.И., Никитенко В.И. Штамм бактерий Bacillus sp. компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергии // А.с. N 1710575, S.U. - публ. 5. 1992.

82. Никитенко В.И., Горбунова Н.Н., Жигайлов А.В. Споробактерин новый препарат для лечения дисбактериозов и гнойно-воспалительных процессов // Дисбактериозы и эубиотики: Тезисы докладов Всерос. научно-практ. конф. -М.- 1996.-С. 26.

83. Николичева Т.А., Тараканов Б.В., Голинкевич Е.К., Комкова Е.Е. Изменение биоценоза пищеварительного тракта поросят при включении в рацион Bacillus micilaginosis // Бюл. ВНИИ физиол., биохимии и питания с-х животных. 1989.-N 2. - С. 31-35.

84. Обухова О.В., Соболева Н.Н. О наличии фактора распространения в культурах сапрофитных споровых бактерий // Журн. микробиол. 1950. - N 12. С. 482-485.

85. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические рекомендации МУК 4.2.1980-04, 2004.

86. Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Влияние кислотности среды и температуры на рост и экскрецию полисахаридов Bacillus subtilis при глубинном культивировании // Мисробюл. журн. 1998. - Т. 60., N 4. - С. 25-32.

87. Осипова И.Г. Некоторые аспекты механизма защитного действия колибак-терина и споровых эубиотиков и новые методы их контроля.// Автореф. дис.канд.биол.наук.- М., 1997.- 25 с.

88. Осипова И.Г., Сорокулова И.Б., Терешкина Н.В., Григорьева JI.B. Изучение безопасности бактерий рода Bacillus, составляющих основу некоторых про-биотиков // Журн. микробиол. 1998. - N 6. - С. 68-70.

89. Осипова И.Г., Михайлова Н.А., Сорокулова И.Г., Васильева Е.А., Гайде-ров А.А. Споровые пробиотики. Журн. микробиол. - 2003. №3. с. 113-119.

90. Остерман Л.Д. Методы Исследования белков и нуклеиновых кислот. 1981.

91. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. и др. Повышение эффективности пробиотикотерапии у поросят/ Ветеринария, 1996. - N 3. - С. 17.

92. Панчишина М.В., Олейник С.Ф. Дисбактериоз кишечника. Киев, 1983

93. Паршина С.Н., Имшенецкий А.А., Нестерова Н.Г. и др. Штамм бактерий Bacillus сегеш"-продуцент протеолитических ферментов с тромболитическим действием // А. с. N 1615177, С 12N 1/20. Опубл. 23.12.90. - Бюл. N 4. 1988.

94. Перт С. Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. Мир, 1978, 332 с

95. Петров Л.Н., Вербицкая Н.Б., Вахитов Т.Я. Конструирование препаратов для лечения и профилактики дисбактериоза на основе представлений о эндо-экологии человека // Рус. ж. Вич/Спид и родст. пробл. 1997.- Т. 1, N 1. С. 161-162.

96. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. М.:Медицина. -1976. -217 С.

97. Поберий И.А., Харечко А.Т., Садовой Н.В., Литусов Н.В. Новый комплексный эубиотик «биоспорин » для детей и взрослых / Здравоохранение Башкортостана. 1998. -N 1. - С. 97-99.

98. Погосян Г.П., Надирова А.Б., Калиев А.Б., Карабаев М.К. Плазмида pCLl и антимикробная активность штамма Bacillus sp. 62 II Молекулярная генетика, микробиол. и вирусология. 1999. - N 1. - С. 37-38.

99. Подберезный В.В., Париков В.А. Среда для культивирования бактерии-симбионта Bacillus pulvifaciens или Bacillus subtilis - продуцента пробиоти-ка// RU Патент № 2100029, опубл. 27.12.97. Бюл.№36.

100. Подберезный В.В., Полянцев Н.И., Ропаева Л.В. Культивирование производственных штаммов Bacillus subtilis в подсырной сыворотке // Ветеринария.- 1996.-N 1.-С. 21-29.

101. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колониза-ционнной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность/Груды ВНИИ антибиотиков.- М. -1990. -вып.Х1Х. -С. 15-25.

102. Полховский В.А., Буланов П.А. О декарбоксилазах аминокислот у Bacillus cereus //Микробиология. 1968. - Т. 37, N 4. - С. 600-604.

103. Поспелова В. В., Грачева Н.М., Антонова Л. В. и др. Биологические микробные препараты, их лекарственные формы и сферы применения //Новые лекарственные препараты: Экспресс информация. -1990. -Вып. 5. - С. 1-8.

104. Поспелова В.В., Рахимова Н.Г., Халенева М.П. и др. Новые сферы применения микробных биопрепаратов для коррекции бактериоценоза организма человека.//Иммунобиол. препараты. М. -1989. -С. 142-152.

105. Резник С.Р. Способ лечения и профилактики вирусных и бактериальных заболеваний животных // SU, А.с. N 1311243, опубл. 1982.

106. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А. и др. Профилактический биопрепарат споролакт // Патент N 2035186. RU. - А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

107. Резник С.Р., Шуст И.И. Гематологические и цитохимические показатели телят при даче препарата Бактерии- SL // Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа: Тез. докл. Всесоюзн. симпоз. -Киев, 1989. С. 25.

108. Решедько Г.К., Стецюк О.У. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузным методом. Современные методы клинической микробиологии, выпуск 1. Смоленск, 2003.

109. Ряпис JI.A., Липницкий А.В. Микробиологические и популяционно-генетические аспекты патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1998. - N 6. С. 109-112.

110. Савицкая К.И. Нарушения микроэкологии желудочно-кишечного тракта и хронические болезни кишечника // Terra medica. - 1998. N 2. - С. 13-15.

111. Свечникова Е.Б., Максютова Л.Ф., Хунафин С.Н. и др., Опыт использования бактиспорина в комплексном лечении детей с термической травмой // Тез. докл: Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней. Санкт-П. - 1999 г. - С. 268.

112. Синев М.А., Бударина Ж.И., Гавриленко И.В. и др., Доказательство существования гемолизина II Bacillus cereus: клонирование генетической детерминанты гемолизина II // Молек. биол . 1993. - Т. 27, N 6. - С. 1218-1229.

113. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С., Резник С.Р. Ферментативная активность бацилл , перспективных для включения в состав биопрепаратов // Микробиол. ж. 1990. - N2. - С. 9-14.

114. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - Киев, 1982 - 280 с.

115. Смирнов В.В. Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий рода Bacillus из организма человека и животных // Киев, 1983. -49 с.

116. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ// Киев. Нау-кова думка.- 1983.- 278 с.

117. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. О некоторых механизмах возникновения бессимптомной бактеремии // Микробиол. журн. 1988 -Т. 50,N6.-С. 56-59.

118. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Способ лечения гнойно-септических послеродовых заболеваний суспензией живых культур // А. с. N 1398868 S.U. - А 61 К 35/74. - публ. 30.05.88, бюл. N 20.

119. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Препарат биоспорин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний человека // А. с. N 1722502. S.U. - А 61 К. 39/02, публ. 30.03.92.

120. Смирнов В.В.,Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Вьюницкая В.А Дискуссионные вопросы создания и применения бактериальных препаратов для коррекции микрофлоры теплокровных // Микробиол. журн. 1992. - Т.54, N 6.- С. 82-92.

121. Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.А., и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода BacillusII Микробиол. журн.- 1993.- 55,- № 4.С.92—112

122. Смирнов В.В., Осадчая А.И., Кудрявцев В.А., Сафронова JI.A. Рост и спорообразование Bacillus subtilis в различных условиях аэрации // Микробиол. журн. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 38-44.

123. Смирнов В.В., Резник С.Р., Сорокулова И.Б. и др. Профилактический биопрепарат субалин // Патент N 2035185, RU. А 61 К 35/66, публ. 20.05.95, бюл. N 14.

124. Смирнов В.В., Сорокулова И.Б., Осипова И.Г. Биопрепарат субтикол для профилактики и лечения инфекционных болезней // Патент N 2129432. -А. 61 К 35/74. - Бюл. N 12, опубл. 27.04.99.

125. Смирнов В.В., Рева О.Н., Вьюницкая В.А. Создание и практическое применение математической модели антагонистического действия бацилл при конструировании пробиотиков // Мшробюлопчний журн. 1995. -Т. 64, N 5. -С. 661-667.

126. Смирнов В.В., Косюк И.В. Адгезивные свойства бактерий рода Bacillus-компонентов дробиотика // Мшробюлопчний журн. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 36-43.

127. Сорокулова И.Б. Перспективы применения бактерий рода Bacillus для конструирования новых биопрепаратов // Антибиотики и химиотерапия. -1996. Т.41, N 10. - С. 13-15.

128. Сорокулова И.Б. Сравнительное изучение биологических свойств био-спорина и других коммерческих препаратов на основе бацилл // Мшробю-лопчний журнал. 1997. - Т. 69, N 6. - С. 43-49.

129. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов / Антибиотики и химиотерапия. 1998. - Т. 43, N 2. - С. 20-23.

130. Сторожук П.Г., Быков И.М., Сторожук А.П. Патогенетическая направленность белкового питания и заместительной ферментотерапии при имму-нодефицитных состояниях организма // International journal on immunorehabilitation. 1998. - N 10., С. 110-115.

131. Таболин В.А., Бельмер С.В., Гасилина Т.В. и др. Рациональная терапия дисбактериоза кишечника у детей. Методические рекомендации. М., 1998. -11с.

132. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: Автореф. дис. канд. биол. наук. Минск, 1997. -21 с.

133. Тришина Н.В. Связь между развитием дисбактериоза кишечника и состоянием антиэндотоксинового иммунитета. Автореф. дис. канд. мед. наук. -Москва, 2003., 24 с.

134. Учитель И.Я. Макрофаги в иммунитете. М 1978; 175.).

135. Фазылова А.А. Клинико-иммунологическое обоснование применения споробактерина и бактиспорина при дисбиозе кишечника у детей раннего возраста // Авт. кан. дис. Уфа. - 1998. - 24 с.

136. Харвуд К. Бациллы . Генетика и биотехнология. М., 1992. - С. 52.

137. Харченко С.Н., Резник С.Р., Литвин В.П. Способ борьбы с плесневением кормов // А.с. N 751382, СССР., опубл. в Б.И., 1980, N 28.

138. Хмель И.А., Чернин Л.С., Леванова Н.Б. и др. Штамм бактерий Bacillus pumilus для получения препарата против фитопатогенных микроорганизмов // Патенты 1817875 Россия F01N 63/00, C12N 1/20. опубл. 20.05.95. - Бюл. N 14.

139. Чернякова В.И., Береза Н.М., Селезнева С.И. Бактериологическая и иммунологическая эффективность препарата биоспорина при неспецифическом язвенном колите // Микробиол.ж. 1993. - Т. 55, N 3. - С. 63-67.

140. Чхаидзе И.Г., В.Г. Лиходед, и др. Корректирующее действие антител при экспериментальном дисбактериозе // Журн. Микробиол. 1998, №4: 12-14.

141. Шарп Р., Скавен М., Аткинсон Т. Бациллы: Генетика и биотехнология. -М. 1992. - 398 с.

142. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса//Вопр.питан. -1999. -Т.68. -№2. -С.32

143. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. I, С. 287.

144. Шендеров Б.А. Колонизационная резистентность и химиотерапевтиче-ские и антибактериальные препараты.// Антибиотики и колонизационная резистентность: Труды ВНИИ антибиотиков. М. -1990. -вып.Х1Х. -С.5-16.

145. Шендеров Б.А., Манвелова М.А., Степанчук Ю.Б., Скиба Н.Э. Пробиотики и функциональное питание // Антибиотики и химиотерапия. 1997. - Т. 42, N 7. - С.30-34.

146. Шендеров Б.А.Медицинская микробная экология и функциональное питание.-М., 1998, Т. II, С. 413

147. Ямпольская Т.А., Великжанина Г.А., Жданова Н.И. и др. Штамм бактерий Bacillus subtilis продуцент L-фенилаланина: А.с. N 1693056, С 12 Р 13/22, опубл. 23.11.91. Бюл. N 43.

148. Adami A., Sandrucci A., Cavazzoni V. Piglets fed froom birthwith the probi-otic Bacillus coagulans as additive: Zootechnical and microbiological aspects // Ann. microbiol. ed enzimol. 1997. - V. 47, N 1. - P. 139-149.

149. Azuma I., Sugimura C., Iton S. Adjuvant activity of bacterial glycolipids // Jap. J. Microbiol. 1977. - V. 20, N 5. - P. 465-468.

150. Benedettini J. et al. Immunomodulation by Bacillus subtilis spores // Boll. 1st, SieroteMilan. 1983.-V. 62.,N6.-P. 509-516.

151. Berkel H., Hadlok R. Lecithinase-und Toxinbildung durch Stamme der Gat-tung Bacillus // Lebensmittelhygiene. 1976. - V. 27, N 2. - p. 63-65.

152. Bernheimer A., Avigad L. Nature and Properties of Cytolytic Agent produced by Bacillus subtilis // J. Gen. Microb.- 1970. V. 61, N 2. - P. 361-369.

153. Blaznic J, Kumel I.M., Salamum B. et al. Sdravljenje kronicne granulomotozne bolezni z acidofilnem mlecom // Zdrav.Vesth. 1976. N 45. - P. 77-79.

154. Boer A.S., Priest F., Diderichsen B. On the industrial use of Bacillus licheni-formis: A review // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 40, N 5. - P. 595-598.

155. Buchell M.E., Smith J., Lynch H.C. A phisiological model for the control of erytromycin production in batch and cyclyc fed batch cuiture // Microbiology. -1997. V. 143, N 2. - P. 475-480.

156. Cipradi G. et al. Effects of an adjunative treatment with Bacillus subtilis for foodallergy // Chemioterapia. -1986. 5, N6. -P.408-410

157. Cromwick A.M., Birrer G.A., Gross R.A. Effects of pH and aeration on y-poly (glutamic acid) formation by bacillus licheniformis in controlled batch fermentor cultures // Biotechnol. and Bioeng. 1996. - V. 50, N 2. - P. 222-227.

158. Danchin A., Glasser P., Kunst F. et al. Bacillus subtilis devoile ses genes // Biofutur. 1998. - N 174. - P. 14-17.

159. Devin K.M. The Bacillus subtilis genome project: Aims and progress // Trends Biotechnol. 1995. - V. 13, N 6. - P. 210-216.

160. Donovan W.P., Rupar M.J., Slanei A.C. Bacillus thuringiensis crytic, protein toxic to coleopteran isects // Патент N 5378625 США A61K 31/00. Опубл. 03.01.95.

161. Dubos R. Toxic factors in enzymes used in laundry products // Science. 1971. - N 3993. - P. 259-260.

162. Edlund C., Nord C.E. Effect of qinolones on intestinal ecology. Drugs, 1998, 58(2): 65-70.

163. Flindt M. Pulmonare disesase due to ingalation of derivates of Bacillus subtilis containing proteolytic enzyme // Lancet.- 1969. V. 1, N 7607. - P. 1177-1181.

164. Fox M. The phylogeny of procaryotes// Science. -1980. V. 209, N 4455. P. 457-463.

165. Fuller R. J Appl Bacteriol 1989; 66: 5: 365-378.

166. Gastro G.R., Ferrero M.A., Abate C.M. et al. Simultaneous production of alpha and beta amylases by Bacillus subtilis Mir-5 in batch and continuous culture // Biotechnol. Lett. 1992. - V. 14, N 1. - P. 49-54.

167. Glatz B.A., Spira W.M., Goepfert J.M. Alteration of vascular permeability in rabbits by culture filtrates of Bacillus cereus and related species // Infect, and Immunol. 1974. V. 10, N 2. - P. 299-303.

168. Guida V., Guida R. Importansia dos Bacillos esporulados aerobios em gastroenterologia e nutricao // Rev. Brasil. med. 1978. - V. 35, N 12. - P. 702707.

169. Haenel H., Bending J. Intestinal flora in health and disease // Progr. Food and Nutr. sci.- 1975.-V. 21, N l.-P. 64.

170. Himanen J.-P., Pyhala L., Olander R.-M. et al. Biological activites of lipo-teichoic acid and peptidoglycan teichoic acid of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Microbiol. - 1993.-V. 139,N 11.-P. 2659-2665.

171. Hirano Y., Matsudo M., Kameyama T. Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis of proteins synthesized during early germination of Bacillus subtilis 168 in the presence of actinomycin D // J. Basic Microbiol. 1991. - V. 31, N 6.- P. 429-436.

172. Humbert Florence Les probiotigues: un sujet d" actualite //Bull. inf. Stat. exp. auicult. Ploufragan. 1988. - V. 28, N 3. - P. 128-130.

173. Inouye S., Kondo S. Amicoumacin and SF-2370, pharmacologically active agents of microbiol origin // Novel Microbial Prod. Med. and Agr. Amsterdam. -1989.-P. 179-193.

174. Johnson С. E. Lethal toxin of Bacillus cereus 1. Relationships and nature of toxin, hemolysin and phospholipase // J. Bacterid. 1967. V. 94, N 2. - P. 306316.

175. Kakinuma A., Hori M., Isono M. Determination of fatty acid in surfactin and elucidation of the total structure of surfactin // Agric. and Biol. Chem. 1969. - V. 33. - P. 973-976.

176. Kaneko J., Matsushima H. Crystal-like structure in the sporulation cells of Bacillus subtilis 168 // J. Electron. Microsc.- 1973. V. 22, N 2. - P. 217-219.

177. Kaneko J., Matsushima H. Crystalline inclusions in sporulating Bacillus subtilis cells // In: Spores YI. Select. Pap. 6th Int. Spore Conf. Washington. - 1975. -P. 580-585.

178. Kitazawa H., Nomura M., Itoh T. J Dairy Sci 1991; 74: 7: 2082 2088.

179. Kubo Kazuhiro. Pure culture of Bacillus subtilis FERM BP-3418 // Пат. N 5364738. США. МКИ A01N 25//00. - публ. 15.11.94.

180. Kudrya V.A., Simonenko L.A. Alkaline serine proteinase and lectine isolation from the culture fluid of Bacillus subtilis // Appl. Microbiol, and Biotechnol. -1994.-V. 41,N5.-P. 505-509.

181. Le H., Anagnostopoulos C. Detection and characterization of naturally occur-ing plasmids //Molec. Gen. Genet. 1977. - V. 157. - P. 167-174.

182. Legakis N.J., Papavassilion J. Thin-layer chromatographic technique for rapid detection of bacterial phospholipases // J. Clin. Microbiol.- 1975. V.2, N 5. - P. 373-376.

183. Leviveld H.L.M., Bachmayer H., Boon B. et al. Safe biotechnology. Part 6. Safety assessment, in respect of human health of microorganisms used in biotechnology // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1995. V. 43, N 3. - P. 389-393.

184. Lin S.-C., Carswell K.S., Sharma M.M., Georgiou G. Continuos production of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus licheniformis JF-2 // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1994. - V. 41, N 3. - P. 281-285.

185. Lovett P., Bramucci M. Plasmid DNA in bacilli // In: Microbiology- Washington. 1976. - P. 388-393.

186. Markham R., Wilkie B. Influence of detergent on aerosol allergic sensitization with enzymes of Вас. subtilis // Int. Arch. Allergy and Appl. Immunol. 1976. -V. 51, N 5. - P. 529-543.

187. Maruta Kiyoshi Exclusion of intestinal pahogens by continuous feeding with Bacillus subtilis C-3102 and its influence on the in testinal microflora in broilers // Anim. Sci. and Technol. 1996. - V. 67, N 3. - P. 273-280.

188. Moszer I., Glaser P., Danchin A. SubtiList: A relational database for the Bacillus subtilis genome // Microbiology. 1995. - V. 141, N 2. - P. 261-268.

189. Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C., Jolken R.H., Manual of Clinical Microbiology, 7th Edition, Washington D.C., ASM Press, 1999

190. Nozari-Renard J. Induction d 5, OInterferon par Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. 1978. - V. 129a. - N 4. - P. 525-542.

191. Oh M.K., Kim B.G., Park S.H. Importance of spore mutants for fed-batch and continuous fermentation of Bacillus subtilis // Biotechnol. and Bioeng. 1995. -V. 47, N 6. - P. 696-702.

192. Payne Jewel M. Isolates of Bacillus thuringiensis Hist are active ayanist nematodes / Патент N 5151363, C12 N 1/20, A 01 N 63/00, заявл. 27.07.90., опубл. 29.09.92.

193. Pepys J., Hargreave F., Longbotton Y. Allergic reactions of the lungs to enzymes of Bacillus subtilis // Lancet. 1969. - V. 1, N 44 - 7607. - P. 1181-1184.

194. Peterson W.L., Mackrowiak Ph.A., Barnett C.C. et al. The human gastric bactericidal barrier: Mechanisms of action, relative antibacterial activity, and dietary influences.//J. Infec. Diseases. -1989. -159 № 5. -p.978-985.

195. Prasad S.S.V., Shethna G.J. Biochemistry biological activities of the proteina-ceous crystal of Bacillus thuringiensis // J. Sci. and Ind. Res. 1976. - V. 35, N 10. - P. 626-632.

196. Rocchietta I. The use of Bacillus subtilis in the treatment of the diseases/Minerva Med. -1969. -60. N3/4. -P. 117-123.

197. Rosental G.J., Corsini E. // Methods Immunotoxicol. 1995. V 1, P 327-343

198. Rychen G., Simoes Nunes C. Effets des flores lactigues des produits laitiers fermentes: Une base scientifigue pour l"etude des probiotiques microbiens dans l"espece porcine // Prod. anim. 1995. - V. 8, N 2. - C. 97-104.

199. Salminen Seppo Clinical aspects of probiotics //Ecol. health and Disease.-1999.- 11.-N4.-P. 251-252

200. Shore N., Greene R., Kezeni H. Lung disfuction in worcers exposed to Bacillus subtilis // Environm. Res. 1971. - V. 4, N 6. - P. 512-519.

201. Slein M., Logan G., Characterization of the phospholipases of Вас. cereus and their effects on erytrocytes, bone and kidnei cells // J. Bacteriol. 1965. - V. 90, Nl.-P. 69-81.

202. Somerville H.J. The insecticidal endotoxin of Bacillus thuringiensis // In: Sem. etude theme Prod, natur. et prot. plant. 1977. - P. 253-268.

203. Spira W., Goepfert J. Biological characteristics of an enterotoxin produced by Bacillus cereus // Can. J. Microbiol. 1975. - V. 21, N 8. - P. 1236-1246.

204. Stgard Henri Microbielle v kstfremmer til svin. Teori og prasksis/ Dan veterinaertidsskr. 1989. - V. 72, N 15. - P. 855-864.

205. Su Li, Zhang Zhihong, Xiao Xianzhi, Wang Xiaomin Wuhan daxue xuebao. Ziran kexue ban // J. Wuhan Univ. Natur. Sci. Ed. 1996. - V. 42, N 4. - C. 516518.

206. Sumi H. Physiological function of natto // J. Brew. Soc. Jap. 1990. - V. 85, N 8.-P. 518-524.

207. Tihole F. Fizioloski pomer backteriemije z geiunalo microflora // Zdravstv vestn 1982. - V. 51, N 1. P. 3-5.

208. Towalski Z., Rothman H. Enzyme technology //in: The Biotechnological Challenge. Cambridge University Press. Cambridge, 1986 - P. 37 -76.

209. Tsuge Kenji, Ano Takashi, Shoda Macoto. Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin B1 //J. Gen. and Appl. Microbiol. 1995.- 41, N 6. P. 541-545.

210. Van der Waaij D. Colonization resistance of the digestive tract: mechanism and clinical consequences.//Nahrung. -1987. -31 № 5. -p.507-524.

211. Vollaard E.J., Clasener H.A.L., Janssen J.H.M. The contribution of Escherichia coli to microbial colonization resistance.//.!, of Antimicrobial Chemotherapy. -1990.- 26. -p.411-418

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Бациллюс субтилис или cенная палочка (лат. Bacillus subtilis ) - вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus ). Bacillus subtilis - один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов.

Название сенная палочка происходит из-за того, что ранее Bacillus subtilis изолировался исключительно из сенных отваров . Bacillus subtilis имеет вид бесцветной прямой палочки, размером примерно 0,7 мкм в толщину и 2-8 мкм в длину. Bacillus subtilis может размножаться делением и спорами. Иногда отдельные Bacillus subtilis , после поперечного деления, остаются соединенными в нити.

Bacillus subtilis (сенная палочка), благодаря продуцируемым антибиотикам и способности закислять среду обитания, является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, таких как сальмонелла , протей , стафилококки , стрептококки , дрожжевые грибки; продуцируют ферменты, удаляющие продукты гнилостного распада тканей; синтезируют аминокислоты, витамины и иммунноактивные факторы. Некоторые штаммы Bacillus subtilis являются продуцентами гиалуроновой кислоты .

Bacillus subtilis может быть причиной пищевых отравлений человека (код по МКБ-10 A05.4).

Bacillus subtilis - действующее вещество лекарственных препаратов

Бациллюс субтилис (Bacillus subtilis ) - действующее вещество некоторых лекарственных препаратов. В данном контексте под термином «бациллюс субтилис» понимается определенный штамм (штаммы) бактерий вида Bacillus subtilis . По фармакологическому указателю бациллюс субтилис относится к группам «Противодиарейные средства» и «Другие иммуномодуляторы». По АТХ бациллюс субтилис имеет код «A07FA Антидиарейные микроорганизмы». Показания к применению бациллюс субтилис:

острые кишечные инфекции у детей
дисбактериоз кишечника различной природы
бактериальный вагиноз
профилактика гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде.

В качестве активного вещества лекарственных препаратов используется лиофилизированная микробная масса живого антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 534 или штамма Bacillus subtilis 3H,

селектированного по признаку хромосомной устойчивости к антибиотику - римфапицину из производственного штамма Bacillus subtilis 534. Российскими предприятиями 48 ЦНИИ Минобороны России ФГУ, г. Екатеринбург, ЗАО «Биофарма» и несколькими украинскими предприятиями производится лекарственный препарат Биоспорин , содержащий смесь Bacillus subtilis штамм 2335 (также называемый Bacillus subtilis 3) и Bacillus licheniformis 2336 (также называемый Bacillus licheniformis 31) в пропорции 3:1.

В России также зарегистрированы (были зарегистрированы) лекарства, в которых основным действующим веществом являлись Bacillus subtilis: (штамм 534), Бактиспорин (штамм N 3H).

Препараты на основе сенной палочки Bacillus subtilis (Споробактерин, Биоспорин, Бактиспорин) и сходного микроорганизма Bacillus cereus (Бактисубтил) обладают антимикробной активностью и могут использоваться при бактериальных инфекциях при невозможности приема антибиотиков или для селективной деконтаминации тонкой кишки при синдроме избыточного бактериального роста. Споры этих бактерий, превращаясь в толстой кишке в активные формы, вырабатывают в процессе жизнедеятельности кислые метаболиты - органические кислоты. При этом рН в толстой кишке сдвигается в кислую сторону и подавляется рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Белоусова E.А., Златкина А.Р.).

В состав лекарственного препарата Энзимтал , имеющего разрешение на применение на территории Украины (позже отозванном), имеется грибковая амилаза - амилолитический фермент, получаемый из грибов Aspergillus oryzae и непатогенных бактериальных культур Bacillus subtilis (Кирик Д.Л., Полякова И.Ф.).

Bacillus subtilis - пробиотик

Кроме перечисленных выше лекарств-пробиотиков , штаммы Bacillus subtilis входят в состав пищевых добавок. В России продаются (продавались) БАДы, содержащие Bacillus subtilis: Бактистатин, Супрадин Киндер гель (производство Германии), Ветом и другие.

БАД Бактистатин содержит метаболиты бесклеточной культуральной жидкости Bacillus subtilis штамм 3 (содержащей в том числе витамин Е), носитель цеолит, ферментированный гидролизат соевой муки, антислеживающий агент стеарат кальция (или аэросил), ингредиенты капсулы (желатин медицинский, титана диоксид, индиготин). Бактистатин рекомендуется разными авторами, в частности, для коррекции синдрома избыточного бактериального роста лёгкой степени (Логинов В.А.), как дополнительного средства: при синдроме кишечной недостаточности (Левченко С.А.), Н.pylori- ассоциированном гастрите (Грищенко Е.Б.) и других.

Штаммы Bacillus subtilis используются в ряде лекарств и продуктов для ветеринарии и сельского хозяйства. В частности, пробиотик «Субтилис» (жидкая форма «Субтилис-Ж» и порошок «Субтилис-С»), включающий в свой состав собой микробную массу живых спор бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis применяется в животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве для профилактики и лечение заболеваний ЖКТ бактериальной этиологии, дисбактериоза, легочных инфекций, увеличения продуктивности, получения здорового потомства, подавления роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов (